郭維文，黎帥，陳玲玲，陸文松，李佑生△

(1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院中醫(yī)科，廣東深圳 518020;2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)系，廣東廣州 510632)

黃芪甲苷對(duì)糖尿病腎病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制*

郭維文1，2，黎帥2，陳玲玲1，2，陸文松1，2，李佑生1△

(1暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/深圳市人民醫(yī)院中醫(yī)科，廣東深圳 518020;2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)系，廣東廣州 510632)

目的:觀察黃芪甲苷(AS-IV)對(duì)糖尿病腎病(DN)腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法：38只清潔級(jí)雄性SD大鼠分成正常組(10只)、模型組(14只)和AS-IV干預(yù)組(14只)，用鏈脲佐菌素造模，成功后1周開始治療，期間每4周動(dòng)態(tài)觀測(cè)血糖及尿微量白蛋白，治療12周后處死大鼠取材及采血，取腎皮質(zhì)行HE和Masson染色觀察，并檢測(cè)β1整合素、整合素連接激酶(ILK)和α-actinin-4的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:干預(yù)8周末AS-IV組血糖水平較模型組明顯降低(P＜0.01)。干預(yù)12周末AS-IV組與模型組相比，尿微量白蛋白明顯下降(P＜0.01)，并使因造模引起的β1整合素、ILK和α-actinin-4表達(dá)水平的變化產(chǎn)生逆變(P＜0.05)。與正常組比較，模型組的β1整合素、ILK和α-actinin-4表達(dá)水平均有明顯差異(P＜0.05)。結(jié)論:AS-IV對(duì)DN腎臟有明顯保護(hù)作用，能降低血糖和尿白蛋白排泄量，改善足細(xì)胞黏附功能，從而延緩DN的進(jìn)展。

黃芪甲苷;糖尿病腎病;足細(xì)胞;蛋白尿

研究表明糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)患者尿中丟失的足細(xì)胞數(shù)和尿蛋白量呈正相關(guān)［1-2］。2型糖尿病患者有微量白蛋白尿者，50%可以檢測(cè)出尿中有足細(xì)胞，已經(jīng)出現(xiàn)明顯蛋白尿者，這一比例達(dá)到80%［3］，提示足細(xì)胞對(duì)腎小球基底膜的黏附失常與脫落，是DN蛋白尿發(fā)生的主要原因之一。有人發(fā)現(xiàn)［4］從腎小球基底膜脫落至尿液中的足細(xì)胞部分具有活力，說(shuō)明足細(xì)胞的脫失較凋亡在DN蛋白的發(fā)病中發(fā)揮了更為重要的作用。本研究通過(guò)黃芪甲苷(astragaloside IV，AS-IV)對(duì)DN進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)DN病變時(shí)血糖、蛋白尿和足細(xì)胞黏附功能及分子機(jī)制的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠38只(SPF級(jí))，8周齡，體重為(200±20)g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為0010232。于暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，測(cè)空腹血糖低于7 mmol/L。

1.2 藥品黃芪甲苷(98%干粉)購(gòu)自成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司。鏈脲佐菌素(98%干粉)購(gòu)自Sigma。

1.3 儀器血糖儀為羅氏(Roche)產(chǎn)品;7020全自動(dòng)生化分析儀為日立股份有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 分組、模型制作與給藥方法按數(shù)字隨機(jī)表法，將SD大鼠分成3組:正常組(10只)、模型組(14只)和AS-IV干預(yù)組(14只)。根據(jù)文獻(xiàn)［5］的方法，經(jīng)12 h禁食后(不禁水)，左下腹腔注射鏈脲佐菌素。72 h后，連續(xù)3 d取尾靜脈血測(cè)血糖，以連續(xù)3次血糖＞16.7 mmo/L作為糖尿病模型大鼠。干預(yù)組給予AS-IV 40 mg·kg-1·d-1;而正常組、模型組給予等量生理鹽水，均每天灌胃1次。不使用胰島素及其它降糖藥物。藥物干預(yù)期間除正常組大鼠外，其余各組均有死亡，其中模型組6只死亡，AS-IV 組4只死亡。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)(1)血、尿指標(biāo):剪尾采血用血糖儀測(cè)定24 h尿微量白蛋白。(2)組織病理染色觀察:對(duì)腎皮質(zhì)行HE、Masson染色，觀察腎小球系膜及系膜基質(zhì)的情況，選取10個(gè)腎小球計(jì)算面積比并取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。(3)免疫組織化學(xué)分析:對(duì)腎皮質(zhì)預(yù)處理后對(duì)β1整合素、α-actinin-4和整合素連接激酶(integrin-linked kinase，ILK)指標(biāo)行免疫組織化學(xué)法染色，隨機(jī)選擇10個(gè)腎小球照相，測(cè)量平均積分吸光度(IA)，然后計(jì)算3張圖片IA值的平均值，以此反映該只實(shí)驗(yàn)大鼠免疫組化反應(yīng)物(蛋白)表達(dá)的強(qiáng)度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較用單因素方差分析，不同時(shí)點(diǎn)所獲數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)行方差分析，LSD法對(duì)方差分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的資料進(jìn)行各組間的兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 黃芪甲苷對(duì)血糖和尿蛋白的改善作用

用藥8周末時(shí)，AS-IV組血糖水平較模型組明顯降低(P＜0.05)，12周末時(shí)AS-IV組尿微量白蛋白較模型組明顯減少(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1、2。

表1 AS-IV在不同時(shí)點(diǎn)對(duì)糖尿病腎病大鼠血糖水平的影響Table 1.Glucose level at different time points(mmol/L.Mean±SD)

表2 AS-IV在不同時(shí)點(diǎn)對(duì)糖尿病腎病大鼠尿微量白蛋白水平的影響Table 2.The excretion of 24 h urinary microalbumin at different time points(μg/24 h.Mean±SD)

2 黃芪甲苷對(duì)腎臟組織病理學(xué)的影響

模型組的系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)等腎小球固有成分明顯增生，基底膜明顯增厚，與正常組、AS-IV組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)圖1、表3。

Figure 1.Pathological observation of antagonism of AS-IV on renal injury in diabetic nephropathy rats(×400).圖1 AS-IV拮抗大鼠糖尿病腎病腎臟損傷的病理形態(tài)學(xué)觀察

表3 AS-IV對(duì)糖尿病腎病大鼠基底膜面積比與腎小球固有成分比值的影響Table 3.The area proportions of glomerular basement membrane (SGBM)and intrinsic composition(SIC)in different groups(%.Mean±SD)

3 黃芪甲苷對(duì)糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞黏附分子和骨架蛋白的影響

模型組和干預(yù)組與正常組比較，β1整合素表達(dá)水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。干預(yù)組與模型組比較，β1整合素表達(dá)水平有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。模型組、AS-IV組與正常組比較，ILK和α-actinin-4表達(dá)水平均有增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。干預(yù)組與模型組比較，ILK和α-actinin-4的表達(dá)水平均有降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)圖2、表4。

Figure 2.Immunohistochemical staining of α-actin in-4 and ILK in the podocytes of rats(×400).圖2 大鼠足細(xì)胞α-actin in-4和ILK的免疫組化染色

表4 AS-IV對(duì)糖尿病腎病大鼠β1整合素、ILK和α-actin-4表達(dá)水平的影響Table 4.Expression level of β1integrin，ILK and α-actinin-4 in different groups examined by immunohistochemistry (Mean±SD)

討論

糖尿病腎病是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，是造成終末期腎衰竭的主要因素之一，是中老年人常見(jiàn)的疾病之一。糖尿病早期于影像學(xué)上無(wú)明顯改變，隨著病情的進(jìn)展可出現(xiàn)腎臟的增大，早期病理解剖可發(fā)現(xiàn)腎臟細(xì)胞的增生和肥大，并且這種病理改變很大可能是相繼發(fā)生。由于糖尿病腎臟組織中不同類型細(xì)胞的生長(zhǎng)及生長(zhǎng)速度反應(yīng)不一，因此不同解剖部位腎組織出現(xiàn)不一樣的病理改變，在糖尿病腎病早期主要是系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞的增生和肥大，以及基底膜的增厚，這與本研究模型組和治療組病理切片結(jié)果顯示一致。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，腎小球系膜細(xì)胞肥大、系膜基質(zhì)增加、基底膜增厚、細(xì)胞外基質(zhì)積聚是造成蛋白尿的主要機(jī)制［6］。蛋白尿是DN早期最主要的臨床特征，也是腎功能進(jìn)行性惡化的主要因素之一。從臨床上看，糖尿病腎病蛋白尿起始表現(xiàn)為微量白蛋白尿，隨著病情的進(jìn)展，可呈現(xiàn)大量蛋白尿，即非選擇性蛋白尿，并最終發(fā)展為腎小球硬化而進(jìn)入終末期腎?。?］。本研究結(jié)果也表明，腎小球系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)和基底膜的變化與蛋白尿的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系。

在腎小球?yàn)V過(guò)膜中，足細(xì)胞是一種高度分化和特異化的上皮細(xì)胞，是維持整個(gè)腎小球?yàn)V過(guò)膜正常通透性的主要成份，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和數(shù)量維持一定的比率是保證腎小球?yàn)V過(guò)膜功能正常運(yùn)行的基礎(chǔ)。目前認(rèn)為足細(xì)胞損傷是腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能受損的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并認(rèn)為足細(xì)胞在DN蛋白尿的形成發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，它數(shù)量的減少和功能的異常是DN早期微量白蛋白產(chǎn)生的主要原因。足細(xì)胞損傷具體表現(xiàn)為足細(xì)胞形態(tài)的損傷，黏附功能受損和細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)細(xì)胞脫失與細(xì)胞數(shù)量的減少，從而導(dǎo)致濾過(guò)膜完整性受損。研究［1-2］表明DN患者尿蛋白的產(chǎn)生與足細(xì)胞數(shù)目和密度有著密切的聯(lián)系，甚至認(rèn)為足細(xì)胞脫失的比率與尿蛋白的量呈正相關(guān)。這提示足細(xì)胞對(duì)腎小球基底膜的黏附失常與脫落，是DN蛋白尿發(fā)生的主要因素之一。

黃芪為豆科草本植物蒙古黃芪、膜莢黃芪的根，藥用迄今已有2 000多年的歷史，其單體主要有黃芪甲苷和黃芪多糖，傳統(tǒng)主要用于氣虛不固、氣虛不運(yùn)等證候?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃芪及其單體有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、保肝、抗衰老、抗應(yīng)激、抗菌、降壓、降糖和利尿護(hù)腎等作用。在護(hù)腎方面［8-9］，黃芪單體除對(duì)腎小管損傷有一定的保護(hù)作用外，對(duì)DN腎小球損傷亦有良好的保護(hù)作用。許多研究結(jié)果表明黃芪有益于糖尿病和DN早、中期的控制，可以明顯延緩DN的進(jìn)展。李志杰等［9］的研究結(jié)果表明黃芪單體可增加早期DN大鼠足細(xì)胞的nephrin和podocin蛋白表達(dá)水平，可明顯延緩DN的病理進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明，AS-IV對(duì)處于DN早期大鼠的腎臟病變有較好療效，主要體現(xiàn)在:(1)使血糖降低，改善高血糖狀況;(2)使腎臟肥大減輕，改善DN狀態(tài)下微觀病理結(jié)構(gòu);(3)使24 h尿微量白蛋白量降低，改善DN狀態(tài)下蛋白等大分子物質(zhì)的流失;(4)提高足細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，減少足細(xì)胞脫失。研究結(jié)果顯示，ASIV可提高大鼠腎皮質(zhì)β1整合素的表達(dá)水平而降低α-actinin-4和ILK的表達(dá)水平，從而對(duì)足細(xì)胞黏附功能產(chǎn)生有益的作用。我們推測(cè)AS-IV對(duì)黏附分子的影響，可能與AS-IV降低血糖、影響DM多種病理機(jī)制和調(diào)節(jié)免疫機(jī)能有關(guān)。從中醫(yī)理論分析，黃芪甲苷是黃芪中的主要單體之一，很可能具有黃芪的益氣固攝功能，從而可以提高體內(nèi)氣的固攝能力，改善“氣虛”狀態(tài)，而在微觀上即表現(xiàn)為對(duì)足細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性的維護(hù)和促進(jìn)黏附分子的表達(dá)，從而可以使DN患者足細(xì)胞恢復(fù)和維持一定的黏附能力。

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Protective effect of astragaloside IV on kidney of diabetic nephropathy rats

GUO Wei-wen1，2，LI Shuai2，CHEN Ling-ling1，2，LU Wen-song1，2，LI You-sheng1
(1Department of Traditional Chinese Medicine，Second Clinical Medical College of Jinan University，Shenzhen People's Hospital，Shenzhen 518020，China;2Department of Traditional Chinese Medicine，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:deyti@163.com)

AIM:To observe the protective effect of astragaloside IV(AS-IV)on the kidney of diabetic nephropathy(DN)rats and its mechanism.METHODS:Male SD rats(n=38)were divided into normal group(n=10)，model group(n=14)and AS-IV intervention group(n=14).The rats in model group and intervention group were injected with streptozotocin for inducing DN.One week after the success of modeling，the blood glucose and urinary microalbumin were dynamically monitored every 4 weeks during the study.After treatment for 12 weeks，the rats were sacrificed，the blood samples and the renal cortex were collected.HE staining and Masson staining were applied for observing the pathological changes of the renal tissues.The protein levels of β1integrin，integrin-linked kinase(ILK)and α-actinin-4 were also detected.RESULTS:At the end of the 8th week，the glucose level in AS-IV intervention group was significantly lower than that in model group(P＜0.01).After 12 weeks of treatment，compared with model group，the amount of urinary microalbumin in AS-IV intervention group was significantly decreased(P＜0.01)，and the inverse changes of the β1integrin，ILK and α-actinin-4 expression in AS-IV intervention group were also observed(P＜0.05).Compared with normal group，the levels of β1integrin，ILK and α-actinin-4 in model group were significantly different(P＜0.05).CONCLUSION:AS-IV has a protective effect on DN kidneys.AS-IV reduces blood glucose and urinary albumin excretion，improves the adhesion of podocytes and delays the development of DN.

Astragaloside IV;Diabetic nephropathies;Podocytes;Proteinuria

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.029

1000-4718(2014)02-0351-04

2013-10-30

2014-01-06

深圳市科技研發(fā)資金資助項(xiàng)目(No.JCYJ20120830163410835;No.JCYJ20130402092657779)

△通訊作者Tel:0755-22943819;E-mail:syzyklys@163.com