張文峰，張瓊宇，邵紅偉，吳鳳麟，王騰，黃樹林△

(1廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，2廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006;3永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南永州 425100)

·短篇論著·

5型腺病毒載體對人T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及細(xì)胞毒性分析*

張文峰1，2，張瓊宇3，邵紅偉1，2，吳鳳麟1，2，王騰1，2，黃樹林1，2△

(1廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，2廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州 510006;3永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，湖南永州 425100)

目的:利用5型腺病毒載體轉(zhuǎn)染人T淋巴細(xì)胞，對其轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞的效率以及細(xì)胞毒性進(jìn)行分析。方法：選取T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞及原代T細(xì)胞，腺病毒按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為20、50、100、200和400對其轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率;選取腺病毒轉(zhuǎn)染后的不同時點，利用碘化丙啶染色法分析轉(zhuǎn)染對于細(xì)胞周期的影響;利用Annexin V/7-AAD染色法分析轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況;利用臺盼藍(lán)染色計數(shù)法分析轉(zhuǎn)染對活細(xì)胞數(shù)目的影響。結(jié)果:5型腺病毒載體轉(zhuǎn)染T淋巴瘤的效率最高，轉(zhuǎn)染效率隨著MOI值的增大而增加;CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率大致相同，T細(xì)胞經(jīng)刺激活化后，CD8+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率下降;病毒轉(zhuǎn)染未導(dǎo)致明顯細(xì)胞凋亡;病毒轉(zhuǎn)染對細(xì)胞周期與活細(xì)胞數(shù)目沒有顯著影響。結(jié)論:5型腺病毒載體轉(zhuǎn)染T細(xì)胞呈現(xiàn)較低細(xì)胞毒性。

腺病毒載體;T淋巴細(xì)胞;細(xì)胞毒性

T細(xì)胞通過膜表面的T細(xì)胞受體(T-cell receptor，TCR)發(fā)揮抗原識別作用［1-2］。利用抗原特異性TCR基因修飾T細(xì)胞進(jìn)行過繼性移植/回輸，在抑制腫瘤生長、控制病毒感染等方面具有良好的前景［3-4］。腺病毒載體因具有能感染增殖和非增殖細(xì)胞、無插入致突變性、能同時表達(dá)多個外源基因等優(yōu)點，是基因治療中的理想載體工具，有望在TCR基因修飾T細(xì)胞治療中發(fā)揮重要作用。

目前主要使用的腺病毒載體為血清型5型腺病毒(adenovirus serotype 5，Ad5)載體，本實驗利用Ad5轉(zhuǎn)染人T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞及原代T細(xì)胞，確定其轉(zhuǎn)染效率;并在轉(zhuǎn)染后的各個不同時點進(jìn)行細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和活細(xì)胞數(shù)目檢測，評價Ad5轉(zhuǎn)染的細(xì)胞毒性，為進(jìn)一步研究腺病毒載體在TCR基因修飾T細(xì)胞的過繼性治療的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

Jurkat細(xì)胞為本實驗室保存，腺病毒穿梭載體pDC315與骨架載體pBHGloxΔE1，3Cre購自Microbix。淋巴細(xì)胞分離液購自灝洋生物制劑技術(shù)公司，AIM-V無血清培養(yǎng)基和無血清RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco，胰蛋白酶購自Amresco，胎牛血清購自Gibco，propidium iodide購自TaKaRa，流式細(xì)胞術(shù)檢測抗體CD8-PE、CD4-PE-Cy5和Annexin V/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Ebioscience，Trypan blue購自廣州威佳生物公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo，Coulter Elite流式細(xì)胞儀購自貝克曼公司。

2 方法

2.1 淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取健康人外周血，F(xiàn)icoll-Hapaque密度梯度離心法分離健康供血者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，用RPMI-1640將細(xì)胞調(diào)至2×109/L。移至培養(yǎng)瓶中豎立培養(yǎng)(20 mL/瓶)，再加入10%胎牛血清和2×104IU/L白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)，37℃培養(yǎng)。

2.2 病毒轉(zhuǎn)染分離的PBMC以1×109cells/L在AIM-V無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，細(xì)胞刺激活化組則在培養(yǎng)基中補(bǔ)加有終濃度6×105IU/L IL-2和10 μg/L anti-CD3抗體;1 000×g離心5 min，棄上清，AIM-V無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞為1×109cells/L，接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，按不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)加入腺病毒并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;1 000×g離心5 min，棄上清，加入新鮮AIM-V無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至不同時點。

2.3 細(xì)胞周期的測定取腺病毒轉(zhuǎn)染后不同時點的T細(xì)胞，800×g離心10 min棄上清;PBS洗1次，800×g離心10 min棄上清;加0.5 mL PBS吹勻;用5 mL注射器將細(xì)胞吸起，用力打入5 mL 70%預(yù)冷乙醇中，4℃固定過夜;800×g離心15 min收集固定細(xì)胞，PBS洗2次;用0.4 mL PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)至tube中輕輕吹打;加RNase-A約3 μL至終濃度約為50 mg/L，37℃水浴消化30 min;加PI約50 μL至終濃度約為65 mg/L，在冰浴中避光染色30 min;經(jīng)尼龍網(wǎng)過濾，上流式細(xì)胞儀檢測。

2.4 細(xì)胞凋亡的檢測取腺病毒轉(zhuǎn)染后不同時點的Jurkat細(xì)胞，800×g離心10 min，棄上清;PBS洗1次，800×g離心10 min，棄上清;加2 mL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，800×g離心10 min，棄上清;加100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后加入5 μL Annexin V-PE，室溫避光孵育15 min;加入2 mL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，800×g離心10 min，棄上清;加500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，隨后加入5 μL 7-AAD，上流式細(xì)胞儀檢測。

2.5 細(xì)胞計數(shù)選取生長狀態(tài)良好的Jurkat細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔5×105細(xì)胞，按所選MOI值加入腺病毒，未經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染組為對照組;放置37℃培養(yǎng)48 h和72 h后，經(jīng)臺盼藍(lán)染色后計數(shù)活細(xì)胞數(shù)目，取4個孔的均值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用方差分析(ANOVA)對組間差異進(jìn)行顯著性檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 Ad5針對T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

Ad5-GFP轉(zhuǎn)染各種T細(xì)胞48 h后的效率見圖1。在MOI值相同時，Ad5-GFP對T淋巴瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高，并且隨著MOI值的升高，轉(zhuǎn)染效率隨之增加;當(dāng)MOI為400時，大約60%的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。Ad5-GFP對原代CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染能力大致相當(dāng)，轉(zhuǎn)染效率并未隨MOI值的升高而顯著增加;在MOI為400時，約15%的CD8+T細(xì)胞和約13%的CD4+T細(xì)胞表達(dá)GFP。當(dāng)外周血T細(xì)胞預(yù)先用CD3抗體和IL-2、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)等細(xì)胞因子刺激活化后，CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞所占比例有所提高，CD8+T為50%，CD4+T為32%(結(jié)果未顯示)，在MOI為400時，約9%的CD4+T細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染;經(jīng)刺激活化后，Ad5-GFP針對CD8+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯下降，在MOI為400時，僅4%的CD8+T細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。

Figure 1.The Ad5 transfection efficiencies for T cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs MOI 20 group.圖1 Ad5針對T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率結(jié)果

2 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況

磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)位于細(xì)胞膜磷脂雙分子層的內(nèi)側(cè)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生早期凋亡時，PS會發(fā)生外翻到細(xì)胞膜脂雙層外側(cè)，外翻的PS會被Annexin V結(jié)合，而染料7-AAD無法通過細(xì)胞膜而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部，Annexin V+/7-AAD-細(xì)胞即為早期凋亡細(xì)胞;細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡時，染料7-AAD會穿過凋亡細(xì)胞膜上小孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，Annexin V+/7-AAD+細(xì)胞即為晚期凋亡細(xì)胞。Ad5-GFP轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞后不同時點，利用Annexin V-PE/7-AAD檢測細(xì)胞凋亡情況，如圖2所示，相比未發(fā)生病毒轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞，病毒轉(zhuǎn)染后早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞所占的比例均沒有出現(xiàn)明顯增加。圖2中還列出了病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞結(jié)合染料Annexin V-PE的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescent intensity，MFI)，該值反映出每個細(xì)胞所結(jié)合染料Annexin V的情況，細(xì)胞膜上發(fā)生外翻的PS越多，其MFI值就越大。在病毒轉(zhuǎn)染后的相同時點，隨著病毒MOI值的增加，其MFI值出現(xiàn)遞減的趨勢。MFI值的減少也許與腺病毒通過細(xì)胞胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)有關(guān)。

3 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對細(xì)胞增殖能力的影響

經(jīng)不同MOI值轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞，被植物血凝素刺激不同時間(48 h和72 h)后活細(xì)胞數(shù)目的變化情況見圖3。隨著刺激時間增加，所選MOI值轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞數(shù)目均有增加;在同一刺激時段，與未發(fā)生病毒轉(zhuǎn)染的對照組相比較，各MOI值轉(zhuǎn)染條件下的細(xì)胞數(shù)目未發(fā)現(xiàn)明顯下降，表明Jurkat細(xì)胞在被腺病毒轉(zhuǎn)染后，對外界刺激所具有的增殖能力并未受到影響。

4 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞對細(xì)胞周期影響

在病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后48 h和72 h，相對于未發(fā)生病毒轉(zhuǎn)染的陰性對照組細(xì)胞，處于G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例未見明顯變化，沒有出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯于某個時期，見表1。

討論

Ad5利用病毒纖毛頭節(jié)區(qū)結(jié)合細(xì)胞膜表面的柯薩奇-腺病毒受體(coxsackie-adenovirus receptor，CAR)完成病毒與靶細(xì)胞的吸附，然后通過病毒纖毛基底部五鄰體與靶細(xì)胞膜表面的整合素相互作用內(nèi)化到細(xì)胞中并進(jìn)入溶酶體，最后腺病毒顆粒轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過核孔將病毒DNA釋放到細(xì)胞核內(nèi)［5］。本實驗發(fā)現(xiàn)Ad5-GFP轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞的效率明顯高于原代T淋巴細(xì)胞，也許和Jurkat細(xì)胞表面的CAR與整合素的表達(dá)有關(guān);抗體和細(xì)胞因子刺激活化后的CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出更難以被Ad5-GFP轉(zhuǎn)染，或許是刺激活化導(dǎo)致細(xì)胞CAR與整合素的表達(dá)水平發(fā)生變化，也可能與病毒顆粒在細(xì)胞內(nèi)的運輸效率有關(guān)［6］，有關(guān)Ad5在T細(xì)胞中運輸?shù)姆肿訖C(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Figure 2.The apoptosis of Jurkat cells after Ad5 transfection detected by flow cytometry and Annexin V/7-AAD staining.Mean±SD.n=3.MFI:mean fluorescent intensity.圖2 Ad5轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞后不同時點細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

在本實驗所選擇的MOI值條件下，磷脂酰絲氨酸外翻細(xì)胞的所占比例未顯著提高，未發(fā)現(xiàn)Ad5轉(zhuǎn)染導(dǎo)致T細(xì)胞的顯著凋亡。實驗中發(fā)現(xiàn)病毒MOI值的增加導(dǎo)致單個細(xì)胞上磷脂酰絲氨酸外翻數(shù)目減少的現(xiàn)象，可能與腺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞胞吞進(jìn)入細(xì)胞的方式有關(guān)。以往研究結(jié)果表明膽固醇在腺病毒的胞吞過程中發(fā)揮重要作用［7］，磷脂酰絲氨酸是否在腺病毒的胞吞過程中起到重要作用以及具體參與方式等問題，有待進(jìn)一步的研究。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及慢病毒載體是目前基因治療中最常用的2種病毒載體，但由于其滴度偏低、可能在淋巴細(xì)胞基因組內(nèi)隨機(jī)插入產(chǎn)生致瘤的風(fēng)險，因此并不是TCR基因修飾T細(xì)胞過繼性治療中的理想載體［8］。本研究對Ad5轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞的效率以及細(xì)胞毒性進(jìn)行了初步的分析，發(fā)現(xiàn)Ad5轉(zhuǎn)染原代T淋巴細(xì)胞的效率偏低，以往研究結(jié)果表明增加病毒轉(zhuǎn)染的MOI值將會有效提高病毒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的能力［9］，因此可以采用提高M(jìn)OI值的方法提高Ad5轉(zhuǎn)染原代T細(xì)胞的效率;在細(xì)胞周期檢測中，未發(fā)現(xiàn)Ad5轉(zhuǎn)染引起細(xì)胞周期阻滯;在活細(xì)胞計數(shù)的實驗中，T細(xì)胞對刺激的活化增殖能力未受到Ad5轉(zhuǎn)染的影響，表明Ad5介導(dǎo)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的低細(xì)胞毒性。綜上所述，Ad5腺病毒載體是TCR基因治療的一種合適載體，在以后的臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。

Figure 3.The effects of transfection with Ad5 on the proliferation of Jurkat cells.Mean±SD.n=5.圖3 Ad5轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞后不同時點細(xì)胞計數(shù)結(jié)果

表1 Ad5轉(zhuǎn)染T細(xì)胞后不同時點細(xì)胞周期分析結(jié)果Table 1.The effects of transfection with Ad5 on the cell cycle of T lymphocytes(Mean±SD.n=3)

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Transfection efficiency and cytotoxicity in human T lymphocytes infected with Ad5 adenoviral vector

ZHANG Wen-feng1，2，ZHANG Qiong-yu3，SHAO Hong-wei1，2，WU Feng-lin1，2，WANG Teng1，2，HUANG Shu-lin1，2
(1School of Life Science＆Biopharmacology，2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology Candidate Drug Research，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China;3Department of Basic Medical Science，Yongzhou Vocational Technical College，Yongzhou 425100，China.E-mail:shulhuang@sina.com)

AIM:To determine the transfection efficiencies and to evaluate the cytotoxicity of infection with Ad5 adenoviral vector in human T lymphocytes.METHODS:The T-lymphoma Jurkat cell line，normal CD3+T cells and pre-stimulated CD3+T cells were transfected with Ad5 adenovirus at multiplicities of infection(MOI)ranging from 20 to 400.GFP expression was analyzed by flow cytometry 48 h after transfection.The cells were harvested 24 h，48 h and 72 h after transfection.The cell cycle was analyzed using propidium iodide staining and the apoptosis of T lymphocytes was detected by annexin V/7-AAD staining.Trypan blue exclusion assay was used to determine the survival cell numbers after 48 h or 72 h of transfection.RESULTS:The transfection of primary human T cells by the Ad5 virus was less efficient than that of a T-lymphoma cell line.Similar transfection efficiency was observed in both CD4+T lymphocytes and CD8+T lymphocytes.The activation of T lymphocytes resulted in a decrease in Ad5 transfection efficiency in CD8+T cells.Following transfection(24 h，48 h and 72 h)，the percentages of G0/G1-phase cells，S-phase cells，G2/M-phase cells and apoptotic cells at all MOI did not change significantly.Therefore，transfection by the Ad5 adenoviral vector did not influence the cell cycle and survival cell numbers.CONCLUSION:The Ad5 adenoviral vector，which shows little cytotoxicity to T lymphocytes，may be a valuable tool for T cell receptor gene therapy.

Adenoviral vector;T lymphocytes;Cytotoxicity

1000-4718(2014)02-0318-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.022

2013-09-05

2013-12-23

科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項“十一五”計劃項目(No.2009ZX09103-708);國家自然科學(xué)基金資助項目(No.31100664;No.31300737;No.81303292);東莞市科技計劃項目(No.2011105102027)

△通訊作者Tel:020-39352201;E-mail:shulhuang@sina.com