尹素娟， 張榮華， 朱曉峰， 王攀攀， 楊 麗△

(暨南大學(xué)1藥學(xué)院，2附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632)

rhTGF-β1對(duì)SD大鼠MSCs骨向分化的影響及機(jī)制研究*

尹素娟1， 張榮華1， 朱曉峰2， 王攀攀2， 楊 麗1△

(暨南大學(xué)1藥學(xué)院，2附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510632)

目的：通過(guò)觀察重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(rhTGF-β1)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)增殖和骨向分化能力的影響，以及對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、Smad4及核心結(jié)合因子α1(Cbfa1)的作用，闡釋其對(duì)MSCs骨向分化影響以及可能的作用機(jī)制。方法：用全骨髓貼壁法分離、純化SD大鼠MSCs;用MTT法檢測(cè)0、5、10、20、40、80和100 μg/L rhTGF-β1對(duì)MSCs增殖活性的影響;以堿性磷酸酶(ALP)活性及ALP染色陽(yáng)性率確定rhTGF-β1的最佳促M(fèi)SCs骨向分化濃度，并以該濃度對(duì)MSCs骨向分化進(jìn)行干預(yù)。按是否添加經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液將實(shí)驗(yàn)分為:正常組、經(jīng)典組、rhTGF-β1組和rhTGF-β1+經(jīng)典組。通過(guò)檢測(cè)ALP、I型膠原、骨鈣素表達(dá)和鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)目，評(píng)價(jià)各組骨向分化能力;通過(guò)檢測(cè)BMP-2、Smad4和Cbfa1 mRNA的表達(dá)，評(píng)價(jià)各組促M(fèi)SCs骨向分化的可能作用機(jī)制。結(jié)果：rhTGF-β1最佳促M(fèi)SCs增殖濃度為10 μg/L，最佳促M(fèi)SCs骨向分化濃度為5 μg/L。經(jīng)典組、rhTGF-β1組和rhTGF-β1+經(jīng)典組均能促進(jìn)MSCs骨向分化，刺激BMP-2分泌，并上調(diào)Smad4和Cbfa1 mRNA的表達(dá)，且rhTGF-β1對(duì)MSCs成骨分化的早期、中期效果好，而rhTGF-β1+經(jīng)典組對(duì)MSCs成骨分化的晚期效果更為明顯。結(jié)論：經(jīng)典組、rhTGF-β1組和rhTGF-β1+經(jīng)典組均有促M(fèi)SCs骨向分化的作用，其機(jī)制可能是促進(jìn)BMP-2的分泌，通過(guò)TGF-β超家族/Smads信號(hào)通路調(diào)控骨向分化。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;成骨分化;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是在骨髓中發(fā)現(xiàn)的一種起源于中胚層，具有自我復(fù)制和多向分化潛能的非造血干細(xì)胞。影響MSCs骨向分化的細(xì)胞因子主要包括:轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等，其中以TGF-β和BMPs報(bào)道較多。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察重組人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(recombinant human tansforming growth factor β1，rhTGF-β1)的促 MSCs骨向分化能力，及觀察其在促M(fèi)SCs骨向分化過(guò)程中對(duì)BMP-2、Smad4和核心結(jié)合因子α1(core binding factor α1，Cbfa1)表達(dá)的影響，闡釋其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)3月齡SD雌性大鼠5只，體重(230±10)g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)為粵監(jiān)證字2005A010)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 rhTGF-β1(Cell Science公司分裝)，L-DMEM培養(yǎng)基(Gibco)，地塞米松、β-甘油磷酸鈉和維生素 C(Sigma)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，大鼠I型膠原(type I collagen，Col I)ELISA試劑盒(美國(guó)ADL診斷實(shí)驗(yàn)室)，骨鈣素(bone Gla protein，BGP)放射免疫分析藥盒(解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所)，Rat BMP-2 ELISA試劑盒(R＆D)，TaKaRa SYBR? ExScriptTMRT PCR Kit(Perfect Real Time)試劑盒(大連寶生物工程有限公司)。

2 方法

2.1 rhTGF-β1的制備 使用低糖無(wú)血清培養(yǎng)基將rhTGF-β1分別溶解至終濃度為1 mg/L，0.22 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾除菌，無(wú)菌條件下分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液的配制 取10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L維生素C、10%胎牛血清，無(wú)菌條件下用高糖DMEM定容至100 mL，充分混勻，4℃保存。

2.3 MSCs的分離、培養(yǎng)及傳代 采用全骨髓貼壁法分離大鼠MSCs，接種24 h后首次半量換液，之后每3 d換液1次。待細(xì)胞達(dá)到80% ～90%融合后，以1∶2比例傳代，并建立大鼠MSCs穩(wěn)定分離培養(yǎng)體系與鑒定［1］。

2.4 rhTGF-β1促M(fèi)SCs增殖最佳濃度的確定 采用MTT法，取第3代MSCs以1×104cells/well接種于96孔板，設(shè)置空白組(既無(wú)細(xì)胞也無(wú)藥物)、對(duì)照組(有細(xì)胞但未加藥物)，rhTGF-β1組6個(gè)濃度組，共8個(gè)組，每組6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞接種24 h后，換入無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h細(xì)胞周期同步化后，分別添加無(wú)血清培養(yǎng)基及rhTGF-β1，使其終濃度為0、5、10、20、40、80和100 μg/L，每孔終體積200 μL。培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。72 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL/well，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄去上清液，加DMSO 150 μL/well，微孔振蕩器振蕩10 min使甲臜充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)吸光度(A)值，波長(zhǎng)490 nm。

2.5 rhTGF-β1促M(fèi)SCs骨向分化最佳濃度的確定第3代MSCs以5×107cells/L的密度接種于24孔板，設(shè)置空白組(既無(wú)細(xì)胞也無(wú)藥物)、對(duì)照組(有細(xì)胞但未加藥物)和rhTGF-β1組6個(gè)濃度組，共8個(gè)組，每組5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞接種24 h后，換入無(wú)血清培養(yǎng)基，24 h細(xì)胞周期同步化后，再加入藥物及完全培養(yǎng)基，使藥物終濃度分別為0、5、10、20、40、80和100 μg/L，每孔終體積1 mL。培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d換液1次，連續(xù)干預(yù)14 d。第14天取細(xì)胞上清液，檢測(cè)其ALP含量;并將每孔進(jìn)行ALP染色，光鏡下隨機(jī)取10個(gè)非重疊視野，高倍鏡下記數(shù)ALP陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性染色率。綜合上述2種方法檢測(cè)的ALP進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以確定rhTGF-β1最佳的促M(fèi)SCs骨向分化濃度。

2.6 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組，分別如下:空白組(N group):含10%FBS的L-DMEM完全培養(yǎng)液;經(jīng)典組(C group):含10%FBS的L-DMEM完全培養(yǎng)液+經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑;rhTGF-β1組(T group):含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)液+5 μg/L rhTGF-β1; rhTGF-β1+經(jīng)典組(T+C group):含10%FBS的L-DMEM完全培養(yǎng)液+經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑+5 μg/L rhTGF-β1。

2.7 指標(biāo)檢測(cè)

2.7.1 ALP活性 第3代MSCs以5×107cells/L接種于24孔板，共6組，每組6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞接種24 h后，換入無(wú)血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞周期同步化24 h后加藥，每3～4 d換液1次，連續(xù)干預(yù)14 d。干預(yù)期間分別取3、7、10和14 d細(xì)胞上清液，-20℃保存，標(biāo)本收集齊后按照ALP試劑盒說(shuō)明檢測(cè)ALP活性。

2.7.2 Col I和BGP釋放量 按上述分別取7、14和21 d細(xì)胞上清液，-20℃保存，樣本收集齊后，按Rat Col I ELISA試劑盒和BGP放射免疫分析藥盒說(shuō)明操作進(jìn)行檢測(cè)。

2.7.3 體外鈣化能力 第3代MSCs以1×108cells/L接種于預(yù)先置有小蓋玻片的6孔板中，共6組，每組3個(gè)復(fù)孔。處理同上，每孔終體積2.5 mL。每3 d換液1次，連續(xù)干預(yù)21 d。第21天將每組細(xì)胞棄培養(yǎng)液，PBS清洗后，95%乙醇固定30 min，再用0.1%茜素紅染色30 min，清水沖洗。低倍鏡(× 40)下進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)，每孔細(xì)胞隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)。

2.7.4 BMP-2釋放量 分別取第3代MSCs各組誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液，其中rhTGF-β1加藥量為5 μg/L，加藥3 d后取上清液，于7、14和21 d取細(xì)胞上清液，-20℃保存，樣本收集齊后，分別按照Rat BMP-2 ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

2.7.5 對(duì)Smad4和Cbfa1 mRNA表達(dá) 采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)后各組細(xì)胞Smad4和Cbfa1 mRNA的表達(dá):取第3代MSCs以1×108cells/L接種于6孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，共6組。待細(xì)胞接種24 h后，換入無(wú)血清培養(yǎng)基，待細(xì)胞周期同步化24 h后加藥，每3 d換液加藥1次，連續(xù)干預(yù)7 d后采用Trizol法提取各組總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。引物設(shè)計(jì)和合成:根據(jù)GenBank注冊(cè)的大鼠 β-actin、Smad4和 Cbfa1基因序列，利用軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)上述基因的熒光定量PCR引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，設(shè)計(jì)引物序列(表1)。按照SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)說(shuō)明，RT-PCR反應(yīng)體系為:cDNA模板2.5 μL，ddH2O 8.0 μL，SYBR Green PCR Mix 12.5 μL，上游引物(10 mmol/L)0.5 μL，下游引物(10 mmol/L)0.5 μL，總體系為25.0 μL。反應(yīng)條件為:95℃ 5 s，59℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，同時(shí)做55～95℃溶解曲線。

表1 β-actin、Smad4和Cbfa1引物序列Table 1.The primer sequences of β-actin，Smad4 and Cbfa1

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較運(yùn)用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 rhTGF-β1促M(fèi)SCs增殖的最佳濃度

不同濃度rhTGF-β1對(duì)大鼠MSCs增殖結(jié)果表明，10 μg/L rhTGF-β1A值高于對(duì)照組(P＜0.05)，其余各組與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Effect of different concentrations of rhTGF-β1on the proliferation of MSCs.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs 0 μg/L.圖1 不同濃度rhTGF-β1對(duì)大鼠MSCs增殖的影響

2 rhTGF-β1促M(fèi)SCs骨向分化最佳濃度

2.1 ALP活性 ALP活性結(jié)果顯示，5 μg/L rhTGF-β1組ALP活性高于對(duì)照組及其它濃度組(P＜0.01)，而其它濃度組與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)，同時(shí)，其它濃度組與5 μg/L rhTGF-β1比較，其ALP活性顯著下降(P＜0.01)，說(shuō)明7個(gè)濃度梯度中5 μg/L rhTGF-β1促M(fèi)SCs分泌ALP能力最強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Effect of different concentrations of rhTGF-β1on ALP activity in MSCs.Mean±SD.n=8.＊＊P＜0.01 vs 0 μg/L;△△P＜0.01 vs 5 μg/L.圖2 不同濃度rhTGF-β1對(duì)ALP活性的影響

2.2 ALP染色 ALP染色陽(yáng)性率的結(jié)果顯示，各濃度rhTGF-β1均能提高ALP染色陽(yáng)性率，其中以5 μg/L rhTGF-β1ALP染色陽(yáng)性率最高(P＜0.01)，說(shuō)明7個(gè)濃度梯度中5 μg/L rhTGF-β1促ALP陽(yáng)性表達(dá)的能力最強(qiáng)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Effect on different concentrations of rhTGF-β1on the positive staining of ALP in MSCs.Mean±SD.n=8.＊＊P＜0.01 vs 0 μg/L;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 5 μg/L.圖3 不同濃度rhTGF-β1對(duì)ALP染色陽(yáng)性率的影響

3 rhTGF-β1對(duì)骨向分化指標(biāo)的影響

3.1 ALP活性 ALP活性結(jié)果顯示，3 d時(shí)C組、T組和T+C組的ALP值均顯著高于N組(P＜0.01); 7 d時(shí)T組的ALP活性高于N組(P＜0.05);10 d時(shí)C組、T組和T+C組的ALP活性高于N組(P＜0.05)，其中T組最為明顯(P＜0.01);14 d時(shí)T組和T+C組的ALP活性高于N組(P＜0.05)，說(shuō)明rhTGF-β1具有很好的促ALP分泌的功效，見(jiàn)表2。

表2 rhTGF-β1對(duì)ALP活性的影響Table 2.Effect of rhTGF-β1on activity of ALP(King unit.Mean±SD.n=6)

3.2 Col I水平 提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)Col I含量，結(jié)果顯示，7 d和14 d時(shí)C組和T組的Col I水平均高于N組，其中T組Col I水平高于N組和T+C組(P＜0.01)，但與C組比無(wú)顯著差異;21 d時(shí)T組的Col I水平顯著低于C組(P＜0.01)，說(shuō)明rhTGF-β1對(duì)Col I的影響在早、中期具有很好的促進(jìn)作用，見(jiàn)表3。

3.3 BGP水平 提取細(xì)胞上清液，檢測(cè)BGP含量，結(jié)果顯示，7 d時(shí)C組、T組和T+C組的BGP水平均顯著高于N組(P＜0.05);14 d時(shí)C組和T+C組的BGP水平均顯著高于N組(P＜0.05);21 d時(shí)C組和T組的BGP水平顯著高于N組(P＜0.05)，見(jiàn)表4。

表3 rhTGF-β1對(duì)各組Col I表達(dá)量的影響Table 3.Effect of rhTGF-β1on ColⅠ expression(mg/L.Mean ±SD.n=4)

3.4 體外鈣化能力 各組鈣化結(jié)節(jié)圖見(jiàn)圖4。第21天檢測(cè)各組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)結(jié)果顯示，C組和T+C組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目均高于N組(P＜0.05)，且T組鈣化化結(jié)節(jié)數(shù)顯著低于C組(P＜0.05)，見(jiàn)表5。

表4 rhTGF-β1對(duì)BGP釋放量的影響Table 4.Effect of rhTGF-β1on BGP release(μg/L.Mean±SD.n=6)

Figure 4.Effect of rhTGF-β1on calcium nodes in MSCs of rats.A:N group(×200);B:C group(×100);C:T group(×100); D:T+C group(×100).圖4 rhTGF-β1對(duì)大鼠MSCs鈣化結(jié)節(jié)的影響

表5 rhTGF-β1對(duì)鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目的影響Table 5.Effect of rhTGF-β1on calcium nodes(Mean±SD.n=30)

4 rhTGF-β1對(duì)BMP-2釋放的影響

BMP-2釋放結(jié)果顯示，7 d時(shí)C組、T組及T+C組的BMP-2水平均顯著高于N組(P＜0.01)，其中T組和T+C組顯著低于C組(P＜0.01);14 d時(shí)C組、T組及T+C組的BMP-2水平顯著高于N組(P＜0.05);21 d時(shí)T組及C組的BMP-2水平顯著高于N組(P＜0.05)，見(jiàn)表6。

表6 rhTGF-β1誘導(dǎo)BMP-2的表達(dá)量Table 6.Effect of rhTGF-β1on BMP-2 expression(ng/L.Mean±SD.n=6)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs N;▲▲P＜0.01 vs C.

5 rhTGF-β1對(duì)Smad4和Cbfa1 mRNA表達(dá)的影響

5.1 rhTGF-β1對(duì)Smad4 mRNA表達(dá)的影響 第7天檢測(cè)Smad4 mRNA表達(dá)的結(jié)果顯示，C組、T組和T+C組的 Smad4 mRNA均顯著高于 N組(P＜0.05)，其它組之間比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖5。

5.2 rhTGF-β1對(duì)Cbfa1 mRNA表達(dá)的影響 第7天時(shí)Cbfa1 mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，C組、T組和T+C組的Cbfa1 mRNA的表達(dá)均顯著高于N組(P＜0.05)，各誘導(dǎo)組之間比較無(wú)顯示差異(P＞0.05)，見(jiàn)圖6。

Figure 5.The expression of Smad4 mRNA in different groups.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs N.圖5 各組Smad4 mRNA的表達(dá)

Figure 6.The expression of Cbfa1 mRNA in different groups.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs N.圖6 各組Cbfa1 mRNA的表達(dá)

討論

1 rhTGF-β1對(duì)MSCs骨向分化能力的影響

BMPs是TGF-β超家族中強(qiáng)有力的生長(zhǎng)因子［2］，其中BMP-2是目前已知的對(duì)骨形成作用很強(qiáng)的生長(zhǎng)因子之一，是細(xì)胞外的骨基質(zhì)成分，具有特殊生物學(xué)活性［3］，主要通過(guò)增加ALP活性、BGP和膠原蛋白合成及分泌而發(fā)揮多種細(xì)胞促分化作用［4-5］，體外研究表明，通過(guò)上調(diào)BMP-2可以促進(jìn)BMSCs的成骨分化［6］。體內(nèi)研究表明［7］，BMP-2表達(dá)在去勢(shì)大鼠局部顯著降低，致使骨髓中許多可被BMP-2誘導(dǎo)成骨的基質(zhì)干細(xì)胞的增殖分裂明顯減少，骨小梁稀薄，認(rèn)為體內(nèi)BMP-2含量的減少是其重要病理過(guò)程之一。同時(shí)，BMP-2能促進(jìn)MSCs骨向分化，在臨床上已經(jīng)作為提高骨愈合的輔助治療［8-9］。研究表明，通過(guò)上調(diào)TGF-β1的表達(dá)，可以促進(jìn)rBMSCs向成骨細(xì)胞分化［10］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ALP活性和ALP染色對(duì)rhTGF-β1最佳促M(fèi)SCs骨向分化濃度顯示，5 μg/L rhTGF-β1具有最佳的促M(fèi)SCs骨向分化作用，并以此濃度作為MSCs進(jìn)行骨向分化干預(yù)濃度。

實(shí)驗(yàn)采用目前最為常用的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L維生素C、10%胎牛血清)為陽(yáng)性對(duì)照。其中，地塞米松可提高ALP的表達(dá)，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)膠原的合成。β-甘油磷酸鈉能提供磷酸根離子，作為ALP作用的底物，誘導(dǎo)和激活A(yù)LP，產(chǎn)生磷酸根離子，促進(jìn)有機(jī)磷向無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)化，加速鈣鹽沉積;維生素C能夠促進(jìn)膠原合成和基質(zhì)鈣化，調(diào)節(jié)ALP活性及非膠原基質(zhì)蛋白的合成。

rhTGF-β1對(duì)MSCs骨向分化能力研究顯示，成骨誘導(dǎo)劑能促進(jìn)ALP、Col I、BGP的表達(dá)和鈣化結(jié)節(jié)的生成;rhTGF-β1在增加ALP和促Col I分泌方面效果顯著，其中ALP活性高于成骨誘導(dǎo)劑，但在促進(jìn)BGP分泌和鈣化結(jié)節(jié)生成方面作用不明顯;而rhTGF-β1+成骨誘導(dǎo)劑增加ALP活性、促Col I分泌能力雖不如rhTGF-β1，但其14 d促BGP分泌與鈣化結(jié)節(jié)形成明顯高于rhTGF-β1，說(shuō)明rhTGF-β1具有很好的促M(fèi)SCs骨向分化能力，尤其是早期、中期效果明顯，而與成骨誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用后，對(duì)MSCs骨向分化的晚期效果更為顯著，可能是rhTGF-β1與成骨誘導(dǎo)劑發(fā)生了一定相互作用。同時(shí)，成骨誘導(dǎo)劑、rhTGF-β1、rhTGF-β1+成骨誘導(dǎo)劑均能促進(jìn)BMP-2的表達(dá)，說(shuō)明rhTGF-β1具有很好的促進(jìn)MSCs骨向分化能力。

2 rhTGF-β1對(duì)Smad4和Cbfa1 mRNA表達(dá)的影響

Smads分子是TGF-β超家族細(xì)胞因子在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信息的通道，Smad4作為Smads的公共遞質(zhì)，作用在Smad家族成員中十分重要。Cbfa1是成骨細(xì)胞(osteoblasts，OB)分化和骨形成的關(guān)鍵調(diào)控因子，它作為Smad蛋白通路的下游因子，在OB分化過(guò)程中，通過(guò)調(diào)控OB特異性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白基因的表達(dá)和OB周期參與OB的分化過(guò)程，它是骨形成過(guò)程中最早和最具特異性的標(biāo)志。在核內(nèi)，Smad異聚體復(fù)合物在其它DNA結(jié)合蛋白的參與下作用于特異性靶基因，再轉(zhuǎn)導(dǎo)至下游的Cbfal等轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，并進(jìn)一步激活成骨基因的表達(dá)，調(diào)節(jié) OB分化標(biāo)志如ALP、BGP等的表達(dá)［11］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，干預(yù)各組中Smad4和Cbfa1 mRNA的表達(dá)均高于空白組(P＜0.05)，各誘導(dǎo)組之間比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)，說(shuō)明各誘導(dǎo)組可能通過(guò)上調(diào)Smad4，從而通過(guò)TGF-β超家族/Smad4信號(hào)通路，進(jìn)一步促進(jìn)Cbfal mRNA的表達(dá)，啟動(dòng)成骨基因，促進(jìn)骨向分化指標(biāo)ALP、BGP等的表達(dá)。

rhTGF-β1具有很好的促M(fèi)SCs骨向分化能力，尤其是早期、中期效果明顯，而與成骨誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用后，對(duì)MSCs骨向分化的晚期效果更為顯著，可能是rhTGF-β1與成骨誘導(dǎo)劑產(chǎn)生了一定相互作用。同時(shí)，通過(guò)上調(diào)TGF-β超家族/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Smad4以及Cbfa1 mRNA水平，對(duì)骨向分化起到了啟動(dòng)和促進(jìn)作用。

［1］楊 麗，張榮華，謝厚杰，等.建立大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞穩(wěn)定分離培養(yǎng)體系與鑒定［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13(6):1064-1068.

［2］Hogan BL.Bone morphogenetic proteins:multifunctional regulators of vertebrate development［J］.Genes Dev，1996，10(13):1580-1594.

［3］Khan SN，Bostrom MP，Lane JM.Bone growth factors［J］.Orthop Clin North Am，2000，31(3):375-388.

［4］Spinella-Jaegle S，Roman-Roman S，F(xiàn)aucheu C，et al.Opposite effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-β1on osteoblast differentiation［J］.Bone，2001，29(4):323-330.

［5］Guicheux J，Lemonnier J，Ghayor C，et al.Activation of p38 mitogen-activated protein kinase and c-Jun-NH2-terminal kinase by BMP-2 and their implication in the stimulation of osteoblastic cell differentiation［J］.J Bone Miner Res，2003，18(11):2060-2068.

［6］王 瑒，李 正，王小娜，等.雷奈酸鍶通過(guò)上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的表達(dá)促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞［J］.中國(guó)病理生理雜志，2012，28(3):404-408.

［7］ 張 勇，馬 平，劉 健，等.去勢(shì)大鼠骨中BMP-2、BMP-7基因表達(dá)［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21 (1):125-126.

［8］Rutherford RB，Nussenbaum B，Krebsbach PH.Bone morphogenetic protein 7 ex vivo gene therapy［J］.Drug News Perspect，2003，16(1):5-10.

［9］Marcacci M，Kon E，Moukhachev V，et al.Stem cells associated with macroporous bioceramics for long bone repair:6-to 7-year outcome of a pilot clinical study［J］.Tissue Engineering，2007，13(5):947-955.

［10］王小娜，李 正，王 瑒，等.TGF-β1在雷奈酸鍶促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化中的作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2011，27(12):2357-2361.

［11］徐小良，戴克戎，湯亭亭.Smads及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與骨形態(tài)發(fā)生蛋白誘導(dǎo)成骨的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［J］.中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2003，17(5): 359-362.

Effects of rhTGF-β1on proliferation and osteogenic differentiation of MSCs in SD rats

YIN Su-juan1，ZHANG Rong-hua1，ZHU Xiao-feng2，WANG Pan-pan2，YANG Li
(1College of pharmacy，2The First Affiliated Hospital，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:doctormonkey @126.com)

AIM:To investigate the effects of recombinant human transforming growth factor β1(rhTGF-β1) on the ability of proliferation and osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs)，as well as its effects on the expression of bone morphogenetic protein 2(BMP-2)，Smad4 and core binding factor α1(Cbfa1).METHODS:SD rat MSCs were isolated and purified by the differential time adherent method.MTT assay was used to confirm the optimal concentration of rhTGF-β1for the proliferation of MSCs.The optimal concentration for differentiation of MSCs into osteoblast was also determined by observing the activity and positive staining of alkaline phosphatase.According to the different induction conditions，MSCs were divided into 4 groups:control group，classic group，rhTGF-β1group，and rhTGF-β1+classic group.Alkaline phosphatase，type I collagen，bone Gla protein and calcium nodes were detected to evaluate the osteogenic differentiation.BMP-2 was detected by ELISA and the mRNA expression of Smad4 and Cbfa1 was analyzed by real-time quantitative PCR.RESULTS:The optimal concentrations of rhTGF-β1for the proliferation of MSCs and for the osteogenic differentiation of MSCs were 10 and 5 μg/L，respectively.The MSCs in classical group and rhTGF-β1group were promoted to osteogenic differentiation，and the mRNA expression of BMP-2，Smad4 and Cbfa1 was increased.rhTGF-β1induced osteogenic differentiation of MSCs in the early and middle terms.However，in rhTGF-β1+ classic group，the osteogenic differentiation of MSCs was more obvious in the late term.CONCLUSION:The inductionconditions of classical group，rhTGF-β1group and rhTGF-β1+classical group promote the differentiation of MSCs by increasing BMP-2 secretion and starting the TGF-β superfamily/Smads signaling pathway to regulate the differentiation of MSCs.

Bone marrow mesenchymal stem cells;Osteogenic differentiation;Transforming growth factors

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.014

1000-4718(2014)03-0460-07

2013-12-04

2014-01-07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81173619);暨南大學(xué)科研培育與創(chuàng)新基金青年基金資助項(xiàng)目(No.21611323)

△通訊作者Tel:020-38374505;E-mail:doctormonkey@126.com