顏宇輝， 陳小華， 王冠明， 林 晨△， 李揚(yáng)秋

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)系，2血液研究所，廣東廣州 510632)

超抗原葡萄球菌腸毒素A拮抗伊馬替尼抑制T細(xì)胞活化作用的研究*

顏宇輝1， 陳小華1， 王冠明1， 林 晨1△， 李揚(yáng)秋2

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)系，2血液研究所，廣東廣州 510632)

目的：探討葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)對(duì)甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate，IM)抑制T淋巴細(xì)胞活化的影響。方法：2 mg/L SEA和50 nmol/L IM聯(lián)合作用于Jurkat細(xì)胞24 h后，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測CD3ε和ζ鏈mRNA表達(dá)水平變化;Western blotting技術(shù)檢測CD3ε和ζ鏈蛋白水平變化。結(jié)果：單純IM組CD3ε和ζ鏈mRNA及蛋白表達(dá)均表現(xiàn)下調(diào);SEA與IM聯(lián)合用藥組可以逆轉(zhuǎn)IM下調(diào)CD3ε和ζ鏈mRNA及蛋白表達(dá)水平作用。SEA拮抗IM抑制作用中，對(duì)CD3ε鏈mRNA表達(dá)上調(diào)的作用明顯大于CD3ζ鏈。結(jié)論：SEA能拮抗IM對(duì)T細(xì)胞CD3ε和ζ鏈表達(dá)的抑制作用。

超抗原;葡萄球菌腸毒素A;伊馬替尼;T淋巴細(xì)胞;抗原，CD3

材料和方法

1 材料

金黃色葡萄球菌腸毒素A(Sigma);伊馬替尼(Selleck Chemicals);Cell Counting Kit-8 CCK-8;(日本同仁化學(xué)研究所);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);Trizol試劑(北京康為世紀(jì)生物有限公司)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Real Master Mix試劑盒(日本東洋紡)。Jurkat細(xì)胞來源于暨南大學(xué)血液病研究所。

2 方法

2.1 IM對(duì)Jurkat細(xì)胞濃度的選擇 培養(yǎng)體系如下: Jurkat細(xì)胞1.0×109/L，含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素。各孔分別加入50、100、200和300 nmol/L IM，對(duì)照孔加RPMI-1640培養(yǎng)液，設(shè)置空白孔，每孔做3復(fù)孔，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔內(nèi)加入10 μL CCK-8試劑后，再繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用雙波長測定吸光度(A)，檢測波長為450 nm，參比波長為600 nm。各組抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)。

2.2 SEA聯(lián)合IM與Jurkat細(xì)胞培養(yǎng) 分4組:2 mg/L SEA組、50 nmol/L IM組、SEA+IM聯(lián)合組和對(duì)照組。將狀態(tài)良好的 Jurkat細(xì)胞調(diào)節(jié)為濃度為1.0×109/L，接種于12孔板中，分別加入相應(yīng)濃度的SEA與IM，總體積1.5 mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用Trizol試劑處理樣品細(xì)胞，氯仿、異丙醇常規(guī)提取RNA，合成cDNA鏈，利用SYBR Green I染料檢測各樣本的CD3ε和ζ鏈mRNA表達(dá)情況，并將β2M作為內(nèi)參照，采用相對(duì)定量法分析各組CD3ε和ζ鏈mRNA表達(dá)水平的差異［3］。根據(jù)文獻(xiàn)［5］設(shè)計(jì)CD3ζ鏈序列引物 (ACCESSION No.J04132)。CD3ζ鏈上游引物5＇-GCC AGA ACC AGC TCT ATA AC-3＇，下游引物5＇-TAG GCC TCC GCC ATC TTA TC-3＇，擴(kuò)增目的片段長度166 bp。根據(jù)CD3ε鏈的序列設(shè)計(jì)引物(ACCESSION No.NM_000f733)［3］。擴(kuò)增 CD3ε鏈上游引物5＇-TCC CAA CCC AGA CTA TGA GC-3＇，下游引物5＇-CAA GAC TAG CCC AGG AAA CAG-3＇，擴(kuò)增目的片段的長度為158 bp。β2M上游引物5＇-TAC ACT GAA TTC ACC CCC AC-3＇，下游引物5＇-CAT CCA ATC CAA ATG CGG CA-3＇，擴(kuò)增目的片段長度145 bp。

總反應(yīng)體積為20 μL，包括Real Master Mix 10 μL，0.5 mmol/L上、下游引物，1 μL cDNA，8 μL蒸餾水。在95℃、1 min預(yù)變性后，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，每一循環(huán)包括95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s。并在72℃讀板1次。隨后，以0.15℃/s變化速度從65℃到95℃每隔1 s記錄1次熒光值，獲得熔解曲線。反應(yīng)在MJ Research DNA Engine Opticon 2熒光定量PCR儀(Bio-Rad)中進(jìn)行。

以β2M為內(nèi)參照，利用Ct值計(jì)算各組CD3ε鏈和ζ鏈表達(dá)的相對(duì)量。并用相對(duì)定量公式:2-ΔΔCt計(jì)算誘導(dǎo)組與空白對(duì)照組CD3ε鏈和ζ鏈的表達(dá)差異，其中ΔΔCt=ΔCt(誘導(dǎo)組)-ΔCt(對(duì)照組)，ΔCt=Ct (ζ/ε)-Ct(β2M)，而基因差異表達(dá)的倍數(shù)即為2-ΔΔCt。

清水塘22號(hào)這座普通的平房，既是中共湘區(qū)委員會(huì)的機(jī)關(guān)所在地，又是毛澤東與楊開慧于1920年冬結(jié)成革命伴侶后所組建的第一個(gè)真正意義上的家。

2.4 Western blotting Jurkat細(xì)胞分4組:2 mg/L SEA組、50 nmol/L IM組、SEA+IM聯(lián)合組和對(duì)照組。24 h后收集細(xì)胞，加60 μL細(xì)胞裂解液，混勻，冰上裂解30 min，每隔10 min振蕩1次，4℃12 000 ×g離心10 min，取上清，與5×上樣液4∶1混合，沸水浴10 min，-20℃保存。BCA法測定樣品蛋白濃度，等量蛋白30 μg 10%SDS-PAGE，用半干轉(zhuǎn)方式將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜在含5%脫脂奶粉TBST中室溫封閉1 h，TBST洗3次，每次5 min。放入Ⅰ抗4℃過夜，TBST洗3次，每次5 min，將膜放入Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，ECL顯色。目的條帶用ImageJ分析軟件進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH內(nèi)參照進(jìn)行校正。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 IM對(duì)Jurkat細(xì)胞增殖影響

不同濃度IM作用于Jurkat細(xì)胞24 h，CCK-8測定其對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用的影響。結(jié)果顯示隨著IM濃度的增加，IM對(duì)Jurkat細(xì)胞的抑制逐漸增加，見圖1。

Figure 1.The effects of different concentrations of IM on the proliferation of Jurkat cells after 24 h.Mean±SD.n=3.圖1 不同濃度IM作用Jurkat細(xì)胞24 h對(duì)其增殖的影響

2 PCR產(chǎn)物鑒定

β2M、CD3ε和CD3ζ熔解曲線均只有單一峰，特異性良好，見圖2。

Figure 2. Real-time fluorescence quantitative PCR melting curves of β2M，CD3ε and CD3ζ。圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定β2M、CD3ε和CD3ζ的熔解曲線

3 SEA、IM及SEA+IM對(duì)Jurkat細(xì)胞CD 3ε和ζ鏈mRNA表達(dá)的影響

根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR的相對(duì)定量公式計(jì)算基因表達(dá)異常倍數(shù)值，2-ΔΔCt＞1表明表達(dá)量增高，2-ΔΔCt＜1表明表達(dá)量降低。單純SEA(2 mg/L)作用于Jurkat細(xì)胞，CD3ε和ζ鏈mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào);單純IM(50 nmol/L)作用，CD3ε和CD3ζ鏈mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào);而在SEA+IM作用下，與同組IM組比較，被抑制的CD3ε和ζ鏈mRNA表達(dá)水平得以逆轉(zhuǎn)(P＜0.05);并且，SEA+IM對(duì)CD3ε鏈mRNA表達(dá)影響明顯強(qiáng)于對(duì)CD3ζ鏈mRNA表達(dá)水平影響(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Effects of SEA，IM and SEA+IM on the mRNA expression of CD3ε and CD3ζ in Jurkat cells.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs IM group;#P＜0.05 vs CD3ζ in the same group.圖3 SEA、IM及SEA+IM對(duì)Jurkat細(xì)胞CD3ε鏈與CD3ζ鏈mRNA表達(dá)的影響

4 SEA、IM及SEA+IM對(duì)Jurkat細(xì)胞CD3ε和ζ鏈蛋白表達(dá)的影響

單獨(dú)SEA組CD3ε鏈蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.05); CD3ζ鏈變化不大;單獨(dú)IM組CD3ε和ζ鏈蛋白表達(dá)均下調(diào)(P＜0.05)。與單純IM組相比，SEA+IM組逆轉(zhuǎn)IM下調(diào)CD3ε和ζ鏈蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，結(jié)果類似于mRNA表達(dá)水平，見圖4。

Figure 4.The effects of SEA，IM and SEA+IM on protein expression of CD3ε and ζ chains measured by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs IM group.圖4 Western blotting測定SEA、IM及SEA+IM對(duì)Jurkat細(xì)胞CD3ε鏈與CD3ζ鏈蛋白表達(dá)的影響

討論

IM作為一線藥物治療CML獲得巨大成功，明顯改善了疾病的生存，但仍存在耐藥和復(fù)發(fā)，除了IM誘導(dǎo)性突變之外，病人免疫功能缺陷，缺乏清除殘留病能力，也可能是其中一個(gè)協(xié)同因素。研究表明，IM及隨后開發(fā)研制的新型靶向藥物(克服耐藥問題)，均具有抑制T細(xì)胞的免疫應(yīng)答作用［1］。如何增強(qiáng)特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答，徹底清除白血病干細(xì)胞是十分需要重視并加以研究的問題。

TCR/CD3復(fù)合體由TCR受體與CD3分子通過鹽橋連接而成，CD3分子在TCR信號(hào)傳遞中起關(guān)鍵作用，CD3分子由γ、δ、ε、ζ和η 5條肽鏈構(gòu)成，分別形成CD3γε、CD3δε和CD3ζζ二聚體，其胞漿區(qū)含有免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosinebased activation motif，ITAM)，負(fù)責(zé)介導(dǎo)T細(xì)胞激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［2-7］。CD3ε和ζ鏈表達(dá)水平下調(diào)均可影響T細(xì)胞活化水平，與臨床腫瘤［8-9］、自身免疫性疾?。?0］及慢性感染［11］等疾病發(fā)生相關(guān)。

目前，已有不少關(guān)于超抗原抗腫瘤研究的報(bào)道［12-13］，通過超抗原針對(duì)性地激活T淋巴細(xì)胞靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，以達(dá)到治療腫瘤的目的。我們也報(bào)道了SEA具有增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞殺傷急性粒細(xì)胞白血病和CML的作用［14-16］。據(jù)此，我們推測SEA具有拮抗IM導(dǎo)致T細(xì)胞抑制的可能性。Jurkat細(xì)胞株是一商品化的傳代T細(xì)胞系，本實(shí)驗(yàn)采用SEA與IM共同作用Jurkat細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測CD3ε和ζ鏈mRNA表達(dá);并采用Western blotting檢測這2種蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，單純SEA組T細(xì)胞CD3ε和ζ鏈mRNA表達(dá)水平升高，與之前的研究結(jié)果一致［3-4］。單純IM組T細(xì)胞CD3ε和ζ鏈mRNA表達(dá)水平降低，也證實(shí)IM通過抑制T細(xì)胞活化信號(hào)通路中上游信號(hào)分子的表達(dá)水平，導(dǎo)致T細(xì)胞活化受阻［17］。而在聯(lián)合組中，SEA+IM共同作用于T細(xì)胞后，表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)IM下調(diào)T細(xì)胞CD3ε和ζ鏈mRNA與蛋白表達(dá)水平的作用。本研究結(jié)果也顯示，各組在mRNA水平上CD3ε鏈表達(dá)受到的影響比CD3ζ鏈明顯，具體原因有待進(jìn)一步研究。TCR信號(hào)通過ITAM的激活轉(zhuǎn)導(dǎo)。TCR復(fù)合體中的ITAM分布在CD3ζζ和CD3γε/δε多肽鏈中。雖然CD3ζ具有3個(gè)ITAM，CD3ε鏈有1個(gè)ITAM。但有研究表明:即使在不存在TCRζζ的情況下，CD3γε/δε依然可以激活T細(xì)胞［18］，提示CD3γε/δε在T細(xì)胞激活過程中也具有重要的激活作用。

綜上所述，超抗原 SEA能拮抗 IM對(duì) T細(xì)胞CD3ε和ζ鏈的抑制作用，為逆轉(zhuǎn)IM臨床治療CML導(dǎo)致的免疫抑制提供了依據(jù)。為通過激活特異性T細(xì)胞進(jìn)一步清除CML微小殘留病變提供新的思路與治療手段。

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Superantigen SEA antagonizes inhibitory effect of imatinib on T cell activation

YAN Yu-hui1，CHEN Xiao-hua1，WANG Guan-ming1，LIN Chen1，LI Yang-qiu2
(1Department of Microbiology and Immunology，School of Medicine，2Institute of Hematology，Jinan University，Guangzhou 510632，China.E-mail:tlinc@jnu.edu.cn)

AIM:To investigate the effects of staphylococcal enterotoxin A(SEA)on the inhibition of T lymphocyte activation induced by imatinib mesylate(IM).METHODS:Jurkat cells were stimulated with SEA(2 mg/L)and IM(5 nmol/L)for 24 h.The mRNA expression of CD3ε and ζ chains was measured by real-time fluorescence quantitative PCR.The protein levels of CD3ε and ζ chains were detected by Western blotting.RESULTS:The expression of CD3ε and ζ chains at mRNA and protein levels was down-regulated in the Jurkat cells stimulated by IM alone.These down-regulations of CD3ε and ζ chains were reversed by the stimulation of IM combined with SEA.The antagonistic effect of SEA on IM-mediated inhibition of CD3ε mRNA expression was significantly greater than that on CD3ζ mRNA.CONCLUSION:SEA antagonizes imatinib-mediated inhibitory effect on T cell activation.

Superantigen;Staphylococcal enterotoxin A;Imatinib;T-lymphocytes;Antigens，CD3

R364

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.004

1000-4718(2014)03-0404-04

2013-10-21

2014-01-16

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81270604);廣東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.S2013020012863);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No.21612116)

△通訊作者Tel:020-85220257;E-mail:tlinc@jnu.edu.cn