王蘇雅，于慶功＊，谷 偉，張欣欣，楊子榮，李文哲

沉默F(xiàn)RAT1基因?qū)Y(jié)腸癌HT－29細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其機(jī)制研究

王蘇雅1，于慶功1＊，谷 偉1，張欣欣1，楊子榮1，李文哲2

（1．大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧大連116001；2．大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院免疫研究所，遼寧大連116622）

目的 探討沉默F(xiàn)RAT1基因?qū)Y(jié)腸癌HT－29細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其可能分子機(jī)制。方法 將成功轉(zhuǎn)染FRAT1基因RNA干擾序列的人結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖，雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，單染流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，免疫熒光法激光共聚焦顯微鏡下觀察β－catenin蛋白變化。結(jié)果 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減緩（P＜0．01），凋亡率明顯增加（P＜0．01），細(xì)胞周期出現(xiàn)G0／G1期阻滯，差異顯著（P＜0．01），胞質(zhì)β－catenin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論 FRAT1基因RNA干擾序列可以有效誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能通過(guò)下調(diào)β－catenin表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

結(jié)腸癌；FRAT1；β－catenin；增殖；凋亡

（Chin J Lab Diagn，2014：18：0195）

FRAT1（frequently rearranged inadvanced T－cell lymphomas 1）基因?yàn)橐环N鼠原癌基因類(lèi)似物［1］，研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中高表達(dá)［25］，其編碼蛋白是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的GSK（蛋白質(zhì)糖原合成酶激酶）－3β抑制蛋白，通過(guò)抑制GSK－3β對(duì)β－catenin磷酸化發(fā)揮作用，因而是Wnt／β－catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要激活分子。β－catenin是Wnt／β－catenin通路核心成員，胞質(zhì)內(nèi)β－catenin異常蓄積可激活Wnt／βcatenin通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制凋亡，最導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［6－8］。本研究通過(guò)對(duì)FRAT1基因沉默的人結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，來(lái)研究FRAT1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期分布的影響及其可能機(jī)制，為FRAT1基因治療的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 成功轉(zhuǎn)染FRAT1基因RNA干擾序列的人結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞由本研究組前期實(shí)驗(yàn)完成，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程公司，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、PI、4＇，6－diamidino－2－phenylindole（DAPI）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Annexin V－FITC／PI凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，兔抗人β－catenin單克隆抗體、FITC標(biāo)記羊抗兔熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)分組 前期通過(guò)陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)染方法，將有效干擾載體質(zhì)粒、空載體質(zhì)粒以及陰性對(duì)照質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞，并經(jīng)過(guò)G418篩選，建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，同時(shí)在HT－29細(xì)胞中單獨(dú)加入離子聚合物作為平行對(duì)照，四組依次命名為：HT－29－S、HT－29－neo、HT－29－NC以及HT－29。

1．2．2 MTT比色法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 取四組細(xì)胞分別調(diào)整細(xì)胞濃度至4×104／ml，將細(xì)胞懸液接種于96孔板。每孔加入200μl含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于5%CO2，37℃環(huán)境的培養(yǎng)箱中。接種后于24h、48h、72h各收集細(xì)胞一次。各組細(xì)胞在收集后棄上清，加入含0．5%MTT的培養(yǎng)基200μl繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清后加入DMSO 150μl震蕩至結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處各孔的吸光值（A值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)，根據(jù)各組吸光度繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1．2．3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將四組細(xì)胞以1×106／ml接種于25ml培養(yǎng)瓶，至80%融合時(shí)用胰酶輕微消化，冰PBS洗3遍，將單細(xì)胞懸液用一次性注射器針頭打入70%冰乙醇中，置4℃固定過(guò)夜。次日棄乙醇并用PBS洗2遍，加入含RnaseA的碘化丙啶（PI）染液，避光反應(yīng)30min，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞周期。

1．2．4 Annexin V－FITC／PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取四組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，收集培養(yǎng)基中懸浮死亡細(xì)胞，貼壁細(xì)胞用不含EDTA胰酶輕微消化后與之前收集的懸浮死亡細(xì)胞一起PBS洗2遍，濾網(wǎng)過(guò)濾并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以保證細(xì)胞密度在1－5×105／ml，加入500μl Binding Buffer懸浮細(xì)胞后加入5μl Annexin V－FITC和5μl PI，于室溫下避光反應(yīng)15min，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1．2．5 β－catenin免疫熒光染色 6孔板預(yù)置合適玻片，將四組細(xì)胞按4×105／ml密度分別接種于孔內(nèi)玻片，在5%CO2，37℃環(huán)境培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿玻片80%，取出PBS洗3遍，每次10min（以下PBS沖洗皆同此法），4%多聚甲醛固定20min，PBS沖洗，0．2%Triton－100在37℃通透打孔15 min，PBS沖洗，胎牛血清封片30min吸凈封片液，滴加β－catenin一抗（1∶100），置于濕盒4℃過(guò)夜。次日PBS沖洗，滴加FITC標(biāo)記的熒光二抗室溫避光孵育2h，PBS沖洗后DAPI染核，甘油封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1．2．6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以_x±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多樣本兩兩比較采用SNK－q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料率的比較用χ2檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線FRAT1基因沉默對(duì)HT－29細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用，并且抑制具有時(shí)間依賴(lài)性。HT－29－S組細(xì)胞生長(zhǎng)速度（吸光度A值）明顯低于HT－29組、HT－29－neo組和HT－29－NC組（P＜0．01），HT－29組、HT－29－neo組、HT－29－NC組三組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）（表1，圖1）。

表1 沉默F(xiàn)RAT1基因?qū)T－29細(xì)胞增殖的影響（A490吸光度值）（_x±s，n＝3）

圖1 四組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2．2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 結(jié)果顯示，與HT－29、HT－29－neo和HT－29－NC組細(xì)胞相比，HT－29－S組G0／G1期細(xì)胞明顯增加（P＜0．01），G2／M期細(xì)胞明顯減少（P＜0．01），S期無(wú)明顯改變，表明FRAT1基因沉默后HT－29細(xì)胞發(fā)生了G1期阻滯，并對(duì)細(xì)胞增殖能力產(chǎn)生了抑制作用。（表2，圖2）。

圖2 默F(xiàn)RAT1基因?qū)T－29細(xì)胞周期的影響

表2 染沉默F(xiàn)RAT1基因?qū)T－29細(xì)胞周期的影響（_x±s，n＝3）單位：%

2．3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 經(jīng)Annexin VFITC／PI雙染流式上機(jī)檢測(cè)結(jié)果顯示，HT－29、HT－29－neo、HT－29－NC和HT－29－S的早期凋亡率分別為（0．37±0．06）%，（0．40±0．11）%，（0．45±0．09）%，（40．05±2．59）%，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組HT－29－S凋亡率顯著高于其他3組（P＜0．01）（表3，圖3），轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)RAT1基因可明顯促進(jìn)HT－29細(xì)胞凋亡。

表3 沉默F(xiàn)RAT1基因?qū)T－29細(xì)胞凋亡率的影響（_x±s，n＝3）單位：%

圖3 轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)RAT1基因?qū)T－29細(xì)胞凋亡率的影響

2．4 免疫熒光檢測(cè)β－catenin蛋白的表達(dá) β－catenin蛋白在腫瘤細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)可見(jiàn)表達(dá)于胞核，而在正常細(xì)胞中只少量表達(dá)于細(xì)胞膜。免疫熒光共聚焦顯微鏡下圖片顯示，HT－29、HT－29－neo和HT－29－NC細(xì)胞爬片可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)強(qiáng)熒光，并表達(dá)于胞核。HT－29－S細(xì)胞爬片胞質(zhì)內(nèi)顯示微弱熒光，胞核幾乎不表達(dá)（圖4）。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染干擾RNA序列的HT－29細(xì)胞內(nèi)β－catenin表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)RAT1基因可能通過(guò)上調(diào)β－catenin表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡并由此促進(jìn)細(xì)胞增殖。FRAT1在包括食管鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種人類(lèi)惡性腫瘤中存在表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象。Guo等［4］發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤中FRAT1蛋白表達(dá)量低者預(yù)后明顯好于FRAT1蛋白表達(dá)量高者，Zhang等［5］研究表明非小細(xì)胞肺癌

圖4 β－catenin在HT－29細(xì)胞中的表達(dá)情況

3 討論

FRAT1是一種最初發(fā)現(xiàn)于進(jìn)展期T細(xì)胞淋巴瘤中的原癌基因，具有原癌結(jié)合蛋白屬性，在人染色體10q24．1處編碼一種分子量29kD（1Da＝0．9921u）的GSK－3β結(jié)合蛋白。多項(xiàng)研究證實(shí)，F(xiàn)RAT1mRNA量與腫瘤TNM分期密切相關(guān)。FRAT1蛋白通過(guò)與GSK－3β結(jié)合激活Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，屬于該通路的激活因子。研究證實(shí)多種腫瘤存在Wnt通路異?，F(xiàn)象，在Wnt經(jīng)典通路中，數(shù)種通路組成蛋白皆與β－catenin相互作用，因此βcatenin無(wú)疑是Wnt經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心成員。β－catenin是一條由多肽鏈組成的胞質(zhì)內(nèi)蛋白，Wnt信號(hào)缺失時(shí)，β－catenin在其他蛋白的輔助下形成復(fù)合物［6］然后迅速降解［7］而不至在細(xì)胞中累積。當(dāng)激活Wnt信號(hào)時(shí)，GSK－3β活性被抑制，導(dǎo)致β－catenin磷酸化異常，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量游離β－catenin，進(jìn)而β－catenin在胞核內(nèi)增加，與核內(nèi)T細(xì)胞因子／淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子（Tcelltranscriptional factor／Lymphoid enhancer factor，TCF／LEF）形成復(fù)合物，激活cmyc、Cox－2、cyclin D1等基因，使細(xì)胞周期發(fā)生改變或產(chǎn)生異常蛋白，隨之發(fā)生癌變。一些學(xué)者研究證實(shí)，β－catenin在食管鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌的胞質(zhì)胞核中均有顯著表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象［8，9］，更有深入研究表明，胃癌組織中β－catenin高表達(dá)可能與病理學(xué)分型有關(guān)［10］。而在結(jié)腸癌中，高達(dá)66－79%出現(xiàn)胞質(zhì)和胞核β－catenin異常表達(dá)［11］，但β－catenin高表達(dá)是否與FRAT1基因有關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究用siRNA靶向干擾結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞FRAT1基因，探討其對(duì)HT－29細(xì)胞增殖、凋亡的影響。采用MTT法檢測(cè)FRAT1蛋白表達(dá)降低或缺失的HT－29細(xì)胞增殖活性的變化，與空載體組、陰性對(duì)照組以及平行對(duì)照組比較，經(jīng)FRAT1基因沉默后的HT－29細(xì)胞增殖活性顯著下降，并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FRAT1基因沉默后其細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示FRAT1基因沉默對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生了顯著影響，有效沉默組的細(xì)胞較多地被阻滯于G0／G1期，而空載體組、陰性對(duì)照組以及平行對(duì)照組G2／M期比例較高，F(xiàn)RAT1的表達(dá)缺失使腫瘤細(xì)胞不能及時(shí)停留于G2／M期，削弱了細(xì)胞的自我修復(fù)，從而抑制HT－29細(xì)胞增殖。在Annexin V－FITC／PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的試驗(yàn)中：FRAT1基因沉默組的HT－29細(xì)胞早期凋亡率達(dá)（40．05±2．59）%，與其他3組細(xì)胞差異顯著。這些均提示了FRAT1對(duì)HT－29細(xì)胞凋亡的負(fù)向調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步的激光共聚焦顯微鏡下免疫熒光技術(shù)顯示，F(xiàn)RAT1基因的沉默干擾了Wnt／β－catenin信號(hào)通路中重要分子β－catenin的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。由此我們推測(cè)FRAT1對(duì)Wnt／β－catenin信號(hào)通路中βcatenin蛋白表達(dá)的上調(diào)作用可能激活了Wnt／βcatenin信號(hào)通路，從而抑制了細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)促進(jìn)其增殖。

我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持以下結(jié)論：采用RNA干擾技術(shù)沉默F(xiàn)RAT1基因能夠抑制結(jié)腸癌HT－29細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，其機(jī)制可能與下調(diào)β－catenin表達(dá)有關(guān)。這表明利用RNA干擾技術(shù)沉默F(xiàn)RAT1基因有望成為治療結(jié)腸癌的一種新途徑。但結(jié)腸癌作為一種多基因、多因素惡性疾病，以FRAT1作為靶基因治療的更多依據(jù)以及其安全有效性等問(wèn)題還需要在體內(nèi)試驗(yàn)中證實(shí)。

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Effect of FRAT1 gene Silencing on proliferation and apoptosis of Colon cancer HT－29 cells and possible relevant mechanism

WANG Su－ya1，YU Qing－gong1，GU Wei1，et al．
（1．Department of Gastroenterology，Affiliated hospital of Dalian University，Dalian116001，China；2．ImmunologyI nstitute，Life Science and Biotechnology College of Dalian University，Dalian116622，China）

Objective To investigate the influence of FRAT1gene on the proliferation and apoptosis of human colon cancer cell line HT－29cells，and explore its underlying molecule mechanism．Methods Flow cytometry with Annexin V－FITC／PI double staining was employed to detect cell apoptosis，and the changes in the cell cycle and proliferation of the cells were examined with flow cytometry with PI staining and MTT colorimetric assay，respectively．β－catenin protein localization was detected by indirect immunofluorescence．Results FRAT1siRNA could restrain HT－29cell proliferation，increase G0／G1phase cell ratio，induce tumor cell apoptosis（P＜0．01）．The expression ofβ－catenin at the cytoplasm was down regulated and inhibit the translocation into nucleus，Conclusion FRAT1siRNA effectively inhibits the expression of HT－29cells，and suppresses cell growth and improves cell apoptosis by up regulating the expressions ofβcatenin．

Colon cancer；FRAT1；β－catenin；proliferation；apoptosis

R735．3＋5

A

于慶功，男，主任醫(yī)師，碩士，研究方向：消化道腫瘤及內(nèi)鏡治療。

2013－02－08）

1007－4287（2014）02－0195－05

＊通訊作者