韓凌宇，劉麒麟，孫 賓，劉士維，盧 浩，張 偉

重組人促紅細(xì)胞生成素對兔耳皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響

韓凌宇，劉麒麟，孫 賓，劉士維，盧 浩，張 偉＊

（吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，吉林長春130021）

促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）是哺乳動物體內(nèi)的一種糖蛋白激素，其主要功能是促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖、分化及成熟。EPO主要由腎臟合成，除此以外，人類皮膚毛囊也可以合成EPO，并表達(dá)EPO受體（EPOR），可見皮膚不但是EPO的合成器官，也是EPO的靶器官。本實驗，我們通過建立兔耳皮膚缺損創(chuàng)面，將rHuEPO局部應(yīng)用于皮膚創(chuàng)面，與金因肽（重組人表皮生長因子）作對照，觀察rHuEPO對皮膚缺損創(chuàng)面愈合及上皮化的作用。為皮膚缺損創(chuàng)面愈合治療尋找一種新的藥物及給藥途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動物 清潔級健康日本大耳白兔24只，體重2．5－3．0kg，雌雄不限，由吉林大學(xué)動物實驗中心提供，動物分籠飼養(yǎng)，統(tǒng)一飼料。

1．1．2 藥物及試劑 濟(jì)脈欣（3000IUEPO注射液）華北制藥金坦生物技術(shù)有限公司，國藥準(zhǔn)字S20000026；金因肽（重組人表皮生長因子）2000IU深圳市華生元基因工程有限公司，國藥準(zhǔn)字S20010037．北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的VEGF血管內(nèi)皮生長因子羊抗兔多克隆抗體（編號：bs－0279R），抗體工作比例為1∶50。1．1．3 主要儀器 顯微鏡：日本奧林巴斯（BX51TPHD－J11）；多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)：美國Media Cybernetics公司Image－Pro Plus．

1．2 方法

1．2．1 動物模型制作及分組 速眠新0．1mg／kg肌注麻醉，顯效后，剔除兔耳腹側(cè)及背側(cè)毛發(fā)，碘伏消毒，常規(guī)鋪巾，于每只兔耳腹側(cè)面同一部位畫出直徑為1cm的圓，并切除圓內(nèi)皮膚全層，保留軟骨膜及軟骨。創(chuàng)面缺損模型共計48個，24只白兔每6只兔子為一組，隨機(jī)分為4組，其中A組為生理鹽水組1次／日，B組為低濃度300IUrHuEPO組1次／日，C組為3000IUrHuEPO組1次／日，D組為2000IU／ml金因肽（重組人表皮生長因子）組1次／日。

術(shù)后創(chuàng)面每日換藥一次，每次每創(chuàng)面均勻滴敷1滴（0．3ml），40萬IU慶大霉素注射液肌注5天，各組實驗動物喂養(yǎng)期間活動及進(jìn)食水良好。

1．2．2 取材 術(shù)后3d，12d用空氣栓塞法處死實驗用兔。沿創(chuàng)面邊緣外0．5cm切取兔耳全層組織，沿圓形創(chuàng)面中間縱行剖開，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，制片備用，行組織學(xué)檢查。

1．2．3 免疫組化 UltraSensitiveTM S－P法，采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及底物色素混合液來測定細(xì)胞和組織中的抗原。①石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（pH＝7．4）沖洗3次，3次×3min；②1%甲醇雙氧水，室溫10min，蒸餾水洗1次，0．1MPBS洗3次× 5min；③將切片放入抗原修復(fù)液中加熱至97度，保持15min后自然冷卻，PBS洗3次，3次×3min；④切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min。甩去多余液體，不洗；⑤切片上滴加切片上滴加一滴VEGF血管內(nèi)皮生長因子抗體（1∶50），4℃過夜，0．1MPBS洗3次×5min。⑥切片上滴加生物素化羊抗兔的IgG（1∶50），37℃20min，0．1MPBS洗3次×5min；⑦切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S－A／HRP），37℃20min，0．1MPBS洗3次× 5min；⑧DAB顯色。

1．3 檢測指標(biāo)

1．3．1 創(chuàng)面形態(tài)學(xué)觀察及創(chuàng)面愈合率 分別術(shù)后3d，12d隨機(jī)選取12只兔子對24個創(chuàng)面進(jìn)行攝影。應(yīng)用AUTO CAD軟件測出各創(chuàng)面面積，并計算傷口愈合率：傷口愈合率＝［（原始創(chuàng)面面積一未愈合創(chuàng)面面積）／原始創(chuàng)面面積］×100%［1］。

1．3．2 組織病理學(xué)觀察 造模后3d、12d光下觀察HE染色切片組織病理學(xué)變化，并參照Eldad等［2］與都義日［3］等所采用的方法。制定皮膚創(chuàng)面愈合的組織病理學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1 組織病理學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)

1．3．3 免疫組織化學(xué)檢測 VEGF陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：VEGF陽性表達(dá)以胞漿、胞膜有棕黃色顆粒為準(zhǔn)。VEGF含量的判定：采用計算機(jī)自動圖像分析系統(tǒng)，在高倍鏡下（400倍）隨選取創(chuàng)面及創(chuàng)周5個不同的視野，測定其陽性細(xì)胞所占比例，以及陽性細(xì)胞顯色的強(qiáng)度，以二者的乘積IHS＝A×B來表示抗原表達(dá)量［4］。評分標(biāo)準(zhǔn)：A為陽性細(xì)胞數(shù)分級0～1%＝0、1～10%＝1、10～50%＝2 50～80%＝3、80～100%＝4；B為陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級0（陰性）、1（弱陽性）、2（陽性）、3（強(qiáng)陽性）。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS17．0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以_x±s表示，組間比較采用One－way ANOVA。

2 結(jié)果

2．1 創(chuàng)面形態(tài)學(xué)觀察及創(chuàng)面愈合率

2．1．1 大體觀察 觀察期間（0－12d），皮膚創(chuàng)面隨時間增加愈合率在提高。造模后第3d，各組創(chuàng)面均有滲出并結(jié)痂，結(jié)痂下可見毛細(xì)血管新生，各個創(chuàng)面均未見明顯上皮覆蓋（如圖1）；造模后12d，B組，D組創(chuàng)面迅速縮小，愈合明顯較A組及D組快（如圖2）。

2．1．2 創(chuàng)面愈合率 造模后3d，各組創(chuàng)面愈合率差異不明顯（P＞0．05）。造模后12d，C組和B組的創(chuàng)面愈合率均明顯高于A組（P＜0．01），見圖3。

2．2 組織學(xué)檢查結(jié)果

2．2．1 HE光鏡檢查結(jié)果 造模后第3天，各組創(chuàng)面以滲出和出血為主，肉芽組織生長較少。各組創(chuàng)面組織學(xué)評分未見明顯差異；造模后第12天，D組較多肉芽均勻覆蓋創(chuàng)面，有大量膠原形成，上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增生明顯。C組上皮細(xì)胞沿創(chuàng)緣覆蓋部分創(chuàng)面，B組與A組上皮化速度較慢，但毛細(xì)血管增生活躍。B組C組及D組創(chuàng)面組織學(xué)評分均較A組高（P＜0．01）。造模后第3，12d，各組創(chuàng)面組織學(xué)評分見圖4。

圖1 造模后3 d各組創(chuàng)面愈合

圖2 造模后12 d各組創(chuàng)面愈合

圖3 各組創(chuàng)面愈合率

圖4 各組創(chuàng)面組織病理學(xué)評分比較

2．3 創(chuàng)面組織VEGF的表達(dá)情況 造模后3d創(chuàng)面周邊及創(chuàng)面內(nèi)部各組VEGF陽性細(xì)胞面積比B組C組明顯高于A組及D組（P＜0．01）（見圖5）；造模后12d，B組C組D組均較A組高（P＜0．01）（見圖6）。造模后3d，12d創(chuàng)面VEGF的表達(dá)評分結(jié)果見圖7。

3 討論

皮膚創(chuàng)面修復(fù)是機(jī)體應(yīng)答皮膚損傷所表現(xiàn)的一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，主要包括局部炎癥反應(yīng)階段，細(xì)胞增殖分化階段和組織重建階段。局部微環(huán)境的變化包括創(chuàng)傷局部各種細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)及生長因子等的相互作用，對創(chuàng)面愈合有極大影響。促紅細(xì)胞生成素（EPO）主要作用于監(jiān)管血細(xì)胞的生成，但也存在各種各樣的非造血功能。最近的數(shù)據(jù)顯示［5］，促紅細(xì)胞生成素與保護(hù)各種器官組織遭受缺血和再灌注損傷以及改進(jìn)組織再生有關(guān)，尤其是皮膚組織。

圖5 造模后3 d（100倍）光鏡下VEGF免疫組化染色結(jié)果

圖6 造模12 d（100倍）光鏡下VEGF免疫組化染色結(jié)果

圖7 各組VEGF陽性細(xì)胞面積×染色強(qiáng)度

本實驗結(jié)果證明：高劑量rHuEPO組可以加快創(chuàng)面上皮化。傷口愈合的早期（3d），各組間差異不大，此時創(chuàng)面以充血滲出為主，傷口愈合的中晚期（12d），傷口細(xì)胞處于快速增殖期，使用高劑量rHuEPO組創(chuàng)面封閉面積明顯大于生理鹽水組和使用低劑量rHuEPO組。研究證實，角質(zhì)細(xì)胞的再上皮化被認(rèn)為是皮膚傷口愈合過程中的重要環(huán)節(jié)，角質(zhì)細(xì)胞是高劑量應(yīng)用外源性促紅細(xì)胞生成素后最可能的靶細(xì)胞。Farhani和Kloth［6］認(rèn)為創(chuàng)面愈合率與由于EPO創(chuàng)造的抗凋亡環(huán)境可能解釋其加速愈合的能力。因此，局部使用高劑量rHuEPO能明顯加快上皮化，可能與它能降低凋亡程度和組織的凋亡敏感度有關(guān)。

通過創(chuàng)面各組織病理學(xué)觀察結(jié)果：造模后12d使用低劑量rHuEPO組創(chuàng)面肉芽組織較生理鹽水組生長良好，創(chuàng)面毛細(xì)血管腔明顯增多，較多深染的成纖維細(xì)胞，少量膠原纖維散在于新生肉芽組織之間。成功的組織修復(fù)需要在早期愈合階段有肉芽組織的生成，以及后期階段肉芽組織的吸收，目前大多學(xué)者［7］研究認(rèn)為EPO加速肉芽組織的吸收，加快新生真皮層的改建，這可能與減少細(xì)胞多樣性，特別是降低炎癥細(xì)胞水平有關(guān)。

VEGF是血管內(nèi)皮生長因子，其在創(chuàng)面的表達(dá)含量能夠反映新生血管及淋巴管的能力，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合［8］。具有新功能的毛細(xì)血管組織的形成包括內(nèi)皮細(xì)胞活化、遷移、細(xì)胞排列、增殖、小管形成，出現(xiàn)分支，吻合，成熟的間隙連接以及周圍的基底膜，這其中每個階段都受VEGF影響。Jaquet［9］的實驗表明EPO與VEGF具有相當(dāng)?shù)拇傺苄纬勺饔?，且在這一過程中，EPO可能作為一種直接的促血管新生物質(zhì)起作用。本實驗結(jié)果與Buemi［10］報道一致，局部使用rHuEPO可以提高創(chuàng)面VEGF的含量，并且隨濃度的增高而增加，并且認(rèn)為血管增生可以為創(chuàng)面膠原合成提供更多的氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)。本實驗表明rHuEPO通過刺激毛細(xì)血管新生，增加VEGF表達(dá)并抑制細(xì)胞凋亡來改善創(chuàng)面愈合。此外，EPO可能促進(jìn)創(chuàng)面愈合起著間接的作用，比如影響血液和免疫系統(tǒng)，需要進(jìn)一步實驗闡明確切機(jī)制。

綜上，局部使用rHuEPO能上調(diào)創(chuàng)面VEGF表達(dá)水平，提高創(chuàng)面愈合速度和質(zhì)量。

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2013－02－10）

1007－4287（2014）02－0191－04

＊通訊作者