李建光,韓松林,2,趙東升,張海波,耿晶,李新霞

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院,烏魯木齊 830054;2.阿克蘇職業(yè)技術學院,阿克蘇 843000;3.新疆比爾兄弟生物技術有限公司,烏魯木齊 830011)

一測多評法測定新疆兩種洋甘菊中5種化學成分含量*

李建光1,韓松林1,2,趙東升3,張海波1,耿晶1,李新霞1

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院,烏魯木齊 830054;2.阿克蘇職業(yè)技術學院,阿克蘇 843000;3.新疆比爾兄弟生物技術有限公司,烏魯木齊 830011)

目的 建立新疆兩種洋甘菊中木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的一測多評含量測定方法。方法采用超高效液相色譜法,以芹菜素為內標物,建立其與木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的相對校正因子,并進行含量測定,實現(xiàn)一測多評。同時采用外標法測定11批洋甘菊中木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的含量,驗證一測多評法的準確性。結果外標測定法5種化學成分在標準曲線范圍內均呈良好線性關系(r>0.999 3);平均加樣回收率分別為:木犀草苷99.7%、芹苷元-7-葡萄糖苷97. 5%、7-甲氧基香豆素98.8%、木犀草素100.9%、芹菜素99.1%,RSD分別為1.8%,0.6%,0.5%,1.8%,1.9%。一測多評法中芹苷元-7-葡萄糖苷、木犀草苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素相對芹菜素對照品的校正因子f分別為1.441,2.308,1. 117,1.490,RSD分別為0.07%,0.04%,0.09%,0.18%。采用一測多評法計算的含量值與外標法實測值之間無顯著差異。結論在對照品缺乏、昂貴的情況下,以外標法測定芹菜素,利用相對校正因子實現(xiàn)對木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的含量測定可行。

母菊;羅馬洋甘菊;色譜法,超高效液相;一測多評法

新疆有兩種常用洋甘菊,一種是德國洋甘菊,為一年生草本植物,即母菊,學名:Matricaria chamomillaL.,植物名:Matricaria recμtita[1];一種是羅馬洋甘菊,一至多年生草本,學名:Anthemis nobileL.,植物名: Chamaemelum nobile。兩種洋甘菊都具有藥用價值[2-6]。洋甘菊有很悠久的使用歷史,《德國藥典》[7]、《美國藥典》[8]收載為母菊,《歐盟藥典》[9]收載為羅馬洋甘菊。我國《國家藥品標準維吾爾藥分冊》收載為母菊,但只有顯微鑒別,沒有薄層鑒別和含量測定,現(xiàn)已列為國家藥品標準提高品種,本課題組擬建立母菊的藥材質量標準。

一測多評法(quantitativeanalysisofmulticomponents by single marker,QAMS)是一種用于多成分質量控制的研究思路,用于解決中藥質量控制中缺乏對照品這一瓶頸問題[10],并成功應用于中藥中同類型成分和不同類型成分的含量測定[11-15]。該方法已被《中華人民共和國藥典》2010年版一部收錄[16]。

筆者在本研究中首先建立兩種洋甘菊的超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography,UPLC)測定條件,然后以芹菜素對照品為內標建立兩種洋甘菊中5種化學成分含量測定的一測多評法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超高效液相色譜儀,Waters Acquity UPLC System,BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm) Empower色譜工作站;水浴鍋(PAIRSTIRRER PS-1000,50 Hz,0.75 kV,TOKYO RIKAKIKAI CO.,LTD); pH計(satRorius PB-10);離心機(MULTIFUGE X3R);分析天平(AB135-S)。

1.2 試藥 芹苷元-7-葡糖糖苷(成都普瑞科技有限公司,純度:99%,批號:A110222),芹菜素(成都普瑞科技有限公司,純度:99%,批號:A110605),7-甲氧基香豆素(美國西格瑪奧德里奇公司,SAFC,純度:98%,批號:11409PC),木犀草苷(中國食品藥品檢定研究院,純度:99.3%,批號:111720-200905),木犀草素(成都普瑞科技有限公司,純度:99%,批號:L120321);乙腈[Fisher Scientific,賽默飛世爾科技(中國)有限公司,純度:99.9%,批號:20120112],甲醇[Fisher Scientific,賽默飛世爾科技(中國)有限公司,純度: 99.9%,批號:20120217],甲醇(天津市富宇精細化工有限公司,分析純,批號:070911),N-N二甲基甲酰胺(天津市富宇精細化工有限公司,分析純,批號: 110713);磷酸二氫鉀(天津市光復精細化工研究所,純度:99.5%,批號:20100517),氫氧化鈉(天津市致遠化學試劑有限公司,純度:96%,批號:20111120),鹽酸(北京化工廠,分析純,批號:20111020),磷酸(天津永晟精細化工有限公司,純度:85%,批號:20120202)。母菊、羅馬洋甘菊均采自新疆各地區(qū)或購買于新疆各市場。烏魯木齊市場購樣1(批號:20120613),2(批號:20120605),3(批號:20120608),4(批號: 20120625)于2012年6月分別采于新疆昌吉呼圖壁縣、瑪納斯縣、吉木薩爾縣、奇臺縣。昌吉市場購樣(批號:20120706)于2012年7月采于昌吉市區(qū)。阜康樣、策勒樣均采于2012年5月。阜康樣(批號: 20120514)采于新疆昌吉阜康市;策勒第一批樣(批號:20120508)、策勒第2批樣(批號:20120514)采于和田策勒縣。維吾爾醫(yī)院樣、和田樣、伊犁樣采收時間均為2012年7月。維吾爾醫(yī)院樣(批號:20120703)來源于昌吉木壘縣,和田樣(批號:20120710)采于和田市區(qū),伊犁樣(批號:20120716)采于伊犁伊寧縣。所有樣品均保存于新疆醫(yī)科大學藥學院分析測試中心。按照《美國藥典》對性狀的描述,經新疆醫(yī)科大學藥學院胡君萍教授對11個批次樣品鑒定確認。其中阜康樣、策勒樣為母菊;烏魯木齊市場購樣、昌吉市場購樣、維吾爾醫(yī)院樣、和田樣、伊犁樣為羅馬洋甘菊。

2 方法與結果

2.1 方法學考察

2.1.1 色譜條件 稀磷酸:取磷酸5.0 mL置于含水50 mL的100 mL量瓶中,加水至刻度,混勻。流動相A:制備濃度為0.005 mol·L-1的磷酸二氫鉀溶液,用稀磷酸調節(jié)pH為2.55±0.05。流動相B:制備乙腈和甲醇的混合物(65∶35)。

色譜柱BEHC18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流速: 0.3 mL·min-1;檢測波長:335 nm;溫度為37℃;進樣量1.5 μL;按照表1程序進行洗脫。典型色譜圖見圖1。

表1 洗脫程序Tab.1 Elution program

2.1.2 對照品溶液的制備 取芹苷元-7-葡萄糖苷、芹菜素、木犀草苷,精密稱定后分別溶于適量N-N二甲基甲酰胺后以甲醇稀釋,使?jié)舛确謩e為1.317, 1.246,1.085 mg·mL-1,取7-甲氧基香豆素、木犀草素精密稱定后分別溶于甲醇,使?jié)舛确謩e為1.042和1.059 mg·mL-1。

2.1.3 供試品溶液的制備 取母菊1.0 g,精密稱定后置一裝有回流冷凝器和攪拌器的燒瓶中,加甲醇80 mL,攪拌下加熱回流1 h。冷至室溫,濾過,收集濾液于100 mL量瓶。用甲醇3 mL沖洗燒瓶,沖洗液過濾后并入量瓶中,加甲醇至刻度,混勻并過濾。取上述溶液25.0 mL置一裝有回流冷凝器和攪拌器的圓底燒瓶中,加氫氧化鈉溶液5.0 mL(將氫氧化鈉0.4 g溶于水5.0 mL制成),加熱回流25 min。冷卻,用36%～38%鹽酸調節(jié)該溶液pH至5.0～6.2。定量轉移此溶液于50 mL量瓶,用甲醇稀釋至刻度,混勻并過濾,棄去初濾液10 mL,取續(xù)濾液作為供試品溶液。同法制備羅馬洋甘菊供試品溶液。

1.木犀草苷;2.芹苷元-7-葡萄糖苷;3.7-甲氧基香豆素;4.木犀草素;5.芹菜素圖1 母菊(A)、羅馬洋甘菊(B)、混標(C)UPLC典型色譜圖1.galuteolin;2.apigenin-7-glucoside;3.7-methoxycoumarin; 4.luteolin;5.apigeninFig.1 Typical UPLC chromatograms of Chamomile, Roman Chamomile,and mixed reference substance

2.1.4 線性范圍、檢出限和定量限 分別精密吸取不同體積“2.1.2”項下(1.085 mg·mL-1木犀草苷、1.317 mg·mL-1芹苷元-7-葡萄糖苷、1.042 mg·mL-17-甲氧基香豆素、1.059 mg·mL-1木犀草素、1.246 mg·mL-1芹菜素)對照品貯備溶液,制成含木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素不同質量濃度的系列混合溶液。按上述色譜條件測定,以對照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)計算標準曲線回歸方程,得木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素回歸方程分別為:Y1=11 381X1-121.98(r=0.999 9),線性范圍0.054～10.85 μg·mL-1;Y2=17 149X2-422.28(r=0.999 9),線性范圍0.659～72.44 μg·mL-1;Y3=25 628X3+607.15(r=0.999 5),線性范圍0.010～10.42 μg·mL-1;Y4=21 425X4-887.50(r= 0.999 9),線性范圍0.021～10.59 μg·mL-1;Y5= 28 342X5-2 552.60(r=0.999 3)線性范圍0.125～12.46 μg·mL-1。結果表明各成分在各自濃度范圍內線性關系良好。當信噪比為3∶1和10∶1時,測得木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的檢出限分別為0.006,0.067,0.001, 0.002,0.013 μg·mL-1;測得木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的定量限分別為0.021,0.214,0.004,0.007,0.046 μg·mL-1。

2.1.5 精密度實驗 取同一混合對照品溶液,在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次,木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素含量的RSD分別為1.00%,0.75%,0.35%,1.10%,0.82%,表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性實驗 取同一批樣品1 g,6份,按供試品溶液的制備法制備并進樣測定洋甘菊中5種化學成分含量,RSD分別為1.10%,0.44%,0.37%,1.20%, 1.30%,表明本方法重復性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性實驗 取“2.1.6”項下同一供試品溶液在室溫下0,2,4,6,8,10,12 h分別進樣測定。結果,12 h內洋甘菊中5種化學成分色譜峰面積無明顯變化,RSD分別為0.96%,0.25%,0.76%,1.10%, 0.48%,表明被測樣品在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品約0.5 g,共9份,分為3組,按低、中、高濃度分別加入木犀草苷等5種對照品儲備液,按“2.1.3”項方法制備供試品溶液,進樣測定,計算加樣回收率,木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的加樣回收率分別為99.7%,97.5%,98.8%, 100.9%,99.1%,RSD分別為1.8%,0.6%,0.5%, 1.8%,1.9%。

2.2 校正因子測定及相對保留時間考察

2.2.1 校正因子的測定 將已知濃度的芹苷元-7-葡萄糖苷、木犀草苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素對照品混合溶液按低、中、高濃度1,1.5,2 μL(n=3)注入超高效液相色譜儀,記錄色譜圖,以芹菜素色譜峰為內標,計算相對響應值作為校正因子。結果表明:芹苷元-7-葡萄糖苷、木犀草苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素對照品對芹菜素對照品的相對校正因子分別為1.441,2.308,1.117,1.490。結果見表2。

表2 校正因子測定Tab.2 Determination on correction factor

2.2.2 相對保留時間的考察 本研究考察了Waters Acquity UPLC,Waters alliance HPLC液相色譜系統(tǒng),使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm× 50 mm,1.7 μm),Agilent(4.6 mm×250 mm,5 μm), Atlantic(4.6 mm×250 mm,5 μm),Phenomenex (4.6 mm×250 mm,5 μm)4種不同品牌和型號的色譜柱。取混合對照品溶液,注入液相色譜儀,測定,以芹菜素為內標物,計算木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的校正因子和相對保留值,結果見表3。

2.3 待測組分色譜峰的定位 本研究采用木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素與內標物芹菜素的相對保留值作為色譜峰定位標準,并考察了其在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱上的重復性。結果表明相對保留值波動較小,木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素相對芹菜素的平均值分別為0.257,0.385,0.684,0.73,RSD分別為1.2%,0.3%,0.19%,0.07%。因此本研究選用相對保留值作為目標色譜峰的定位指標比較合適。并且在此色譜條件下各批洋甘菊樣品的色譜峰相對簡單,因此在實際應用“一測多評”法時,可參考藥材典型色譜圖,利用相對保留值定位,根據內標物芹菜素的保留時間,通過相對保留值結合木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素色譜峰的紫外吸收特征,能夠正確判斷目標峰的準確峰位置。

2.4 一測多評法與外標法測定結果的比較 采用外標法和一測多評法,以“2.1.1”項色譜條件對11批洋甘菊中5種化學成分木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素進行含量測定。結果見表4。結果顯示,兩種方法所得含量值差異無統(tǒng)計學意義。說明一測多評法可用于洋甘菊的多成分質量評價研究。

3 討論

本實驗在對照品溶液的制備過程中發(fā)現(xiàn),芹苷元-7-葡萄糖苷、芹菜素、木犀草苷對照品不易溶于甲醇,故在制備過程中先溶于適量N-N二甲基甲酰胺后再用甲醇稀釋。

一測多評法與外標法測定結果的相對偏差＜0.5%,表明上述兩種方法差異無統(tǒng)計學意義,說明本實驗中建立的以芹菜素對照品為內標的一測多評法具有可行性,只需用芹菜素對照品,即可進行多指標同步測定,可替代外標測定法用于兩種洋甘菊的質量分析。本實驗中尤其木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷價格昂貴,以兩種洋甘菊中均含成分、價格相對便宜的芹菜素為內標,同時測定木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的含量,從而實現(xiàn)以一種對照品對多個成分進行質量控制,在質量評價中,能較大降低測定成本。本實驗選用UPLC色譜系統(tǒng)一測多評法同時分析5種成分,分離效果較HPLC更好,分離時間更短。

表3 相對保留時間考察Tab.3 Test on relative retention time

表4 外標法和QAMS測定洋甘菊中木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素、芹菜素的含量Tab.4 Content determination on galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin in Chamomiles by external standard method and QAMS mg·g-1,n=2

《美國藥典》中測定芹苷元-7-葡萄糖苷的含量,同時規(guī)定7-甲氧基香豆素,芹菜素,順式螺醚、反式螺醚的相對保留時間。本實驗中以芹菜素為對照,同時測定木犀草苷、芹苷元-7-葡萄糖苷、7-甲氧基香豆素、木犀草素的含量,更適用于中藥材的質量控制。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.025

Determination of Five Compounds from Two Species of Chamomiles from Xinjiang by QAMS

LI Jian-guang1,HAN Song-lin1,2,ZHAO Dong-sheng3,ZHANG Hai-bo1,GENG Jing1,LI Xin-xia1
(1. Pharmaceutical College,Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China;2.AKSu Vocational And Technical College,AKSu 843000,China;3.Xinjiang Bill Brother Biotechnology Company.,LTD,Urumqi 830011,China)

ObjectiveTo establish a method of simultaneously quantitative analysis for multi-components by single marker(QAMS)of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin in two species ofChamomilesfromXinjiang.MethodsBy using apigenin as the internal standard,the relative correction factors(RCF)of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin and luteolin were set and determined by UPLC.The contents of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin in 11 samples ofChamomileswere authentically determined by the external standard method,to verify the accuracy of QAMS.ResultsThere is a good linear relationship within the range of standard curve for five compounds by the external standard method(r>0.999 3);the average recovery was 99.7%,97.5,98.8%,100.9%,99.1%,for galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin and apigenin,respectively,with RSD as 1.8%,0.6%,0.5%, 1.8%and 1.9%,respectively.The RCF for pigenin-7-glucoside,galuteolin,7-methoxycoumarin and luteolin to apigenin was 1. 441,2.308,1.117,1.490,respectively,with RSD as 0.07%,0.04%,0.09%and 0.18%,respectively.No significant difference between the quantitative results by QAMS and external standard method was observed.ConclusionIt is practical to determine content of galuteolin,apigenin-7-glucoside,7-methoxycoumarin,luteolin with RCF and apigenin by using external standard method,for the deficiency and expensive of the standard reference.

Chamomile;Roman chamomile;UPLC;Quantitative analysis of multi-components by single marker

R286;R927.2

B

1004-0781(2014)11-1491-05

2013-10-25

2013-12-02

*新疆維吾爾自治區(qū)科技廳高技術研究項目(201316102);新疆醫(yī)科大學2011-2012學年博士(后)科研啟動金配套資助項目

李建光(1977-),男,新疆烏魯木齊人,副教授,博士,主要從事藥物分析與天然藥物化學研究。電話:0991-4361362,E-mail:L77117@163.com。

李新霞(1968-),女,新疆烏魯木齊人,教授,博士,主要從事分析測試技術與新藥研發(fā)工作。電話:0991-4365034,E-mail:lxx6668@163.com。