李梅云，劉 勇，肖炳光，冷曉東，李永平

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煙草黑脛病抗性的漂浮苗鑒定方法

李梅云，劉 勇，肖炳光，冷曉東，李永平

（云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，中國煙草育種研究南方中心，云南 玉溪 653100）

煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)上的毀滅性病害之一。建立煙草黑脛病抗性的漂浮苗接種鑒定方法，對抗病育種具有重要意義。通過分離菌株的致病性測定，確定了用于抗病性鑒定等后續(xù)研究的黑脛病菌162#菌株。研究了煙草黑脛病菌漂浮苗接種鑒定方法，分析了不同接種條件對煙草黑脛病溫室鑒定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，40 d苗齡接種、池內(nèi)水溫28 ℃、創(chuàng)傷接種鑒定方法比較適宜品種的抗性鑒定與評價。分別采用漂浮苗接種法、溫室盆栽接種法和田間病圃接種鑒定法對煙草品種進(jìn)行了黑脛病的抗性鑒定，對比了3種不同鑒定方法的鑒定效果和優(yōu)缺點，建立了水培接種鑒定方法。

煙草；黑脛?。豢剐澡b定；漂浮苗

煙草黑脛病是煙草（L.）生產(chǎn)上的毀滅性病害之一，是制約我國各煙區(qū)煙葉生產(chǎn)的最重要因素之一，可以危害烤煙、晾煙、曬煙、白肋煙、香料煙等所有的栽培煙草[1-4]。美國北卡羅萊納州每年因煙草黑脛病損失的煙葉約占總產(chǎn)量的1%～2%，1995—1996年兩年間因黑脛病造成的損失達(dá)3610萬美元，占病害總損失的35.13%，居各病害之首。該病在我國分布范圍很廣，除黑龍江省尚未發(fā)現(xiàn)之外，其余各植煙省區(qū)（含臺灣省）均有發(fā)生。平均發(fā)病率為5%～12%，嚴(yán)重田塊發(fā)病率高達(dá)75%，甚至造成絕收[5-6]。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國煙草黑脛病平均每年發(fā)病面積高達(dá)76 373 hm2，產(chǎn)量損失28 69.26萬kg，產(chǎn)值損失超過1.23億元[5]。生產(chǎn)實踐表明，選育抗病品種是防治黑脛病最經(jīng)濟(jì)、有效、環(huán)保的措施[7]，抗性鑒定自然成為抗源挖掘利用、抗病育種、抗性監(jiān)測等工作中重要的一環(huán)。

現(xiàn)有的煙草抗性鑒定方法主要有溫室苗期鑒定接種法和病圃活體菌株人工接種鑒定法。苗期鑒定法通常采用游動孢子或菌絲體懸浮液浸根接種，病圃活體菌株人工接種鑒定是目前常用的鑒定方法，缺點是移栽緩苗后接種，時間長，工作量大。

目前我國煙草普遍采用漂浮育苗，漂浮育苗是當(dāng)前國際上先進(jìn)的育苗技術(shù)，具有壯苗率高、操作簡便、專業(yè)化程度高、省工節(jié)時、方便管理、有利環(huán)境保護(hù)等許多優(yōu)點，近年來，在全國得到了大面積推廣應(yīng)用。因此，在漂浮育苗基礎(chǔ)上，建立煙草黑脛病抗性的漂浮苗水培接種鑒定方法，對抗病種質(zhì)資源篩選、抗性遺傳特性研究和抗病育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草材料為革新三號、G28、K326、KM10、NC89、金星6007、小黃金1025和紅花大金元。所有菌株均采自云南各主要產(chǎn)煙地州，于2004—2005年間先后分離純化。

1.2 致病性測定

2008年溫室內(nèi)進(jìn)行。供試菌種于燕麥瓊脂培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)7 d。煙苗移栽前兩周，挑取菌絲體接種培養(yǎng)液，120 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)兩周，驟然降溫，制成游動孢子懸浮液。調(diào)節(jié)游動孢子懸浮液濃度1×108cfu/mL，備用。

供試煙草品種采用漂浮育苗，待煙苗長到6~8葉期移栽到塑料花盆（Φ16 cm）中，緩苗生長10 d。

用孢子懸浮液灌根接種紅花大金元10葉期左右大小煙株。采用莖基部創(chuàng)傷接種法：在煙苗莖基部劃一傷口，游動孢子懸浮液灌根接種于傷口處，脫脂棉保濕。每株15 mL，每菌株設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)16株，設(shè)清水對照。接種3 d后開始進(jìn)行調(diào)查，按照嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級，計算發(fā)病率與病情指數(shù)。

1.3 室內(nèi)苗期抗性鑒定

1.3.1 漂浮苗接種鑒定 2009—2011年在溫室內(nèi)進(jìn)行。池水保溫循環(huán)漂浮池建造方法：池底墊一層厚約4 cm的泡沫塑料板，鋪2層池膜，整個池壁四周用泡沫塑料板保溫。苗池一端設(shè)控溫電加熱棒和池水循環(huán)泵，通過控溫裝置聯(lián)動，設(shè)置水溫為28 ℃。煙苗一次剪葉后（苗齡40~50 d），每個材料挑選45株，移植到新的漂浮盤中。將保存的黑脛病菌株使用前在燕麥培養(yǎng)基上活化后，接種燕麥液體培養(yǎng)基28 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)2周，加0.1%硝酸鉀溶液。采用莖基部創(chuàng)傷接種法，方法同1.2。接種后將育苗盤放入恒溫池，及時噴水保持較高濕度，誘發(fā)病害產(chǎn)生。接種后5 d開始調(diào)查病情，每隔3 d調(diào)查1次，計算發(fā)病率與病情指數(shù)，以感病對照病情指數(shù)達(dá)到60以上的調(diào)查結(jié)果作為品種抗性評價標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 土壤盆栽傷根接種鑒定 2009—2011年在溫室內(nèi)進(jìn)行。苗齡50 d，每材料30株，移栽入直徑12 cm的一次性塑料花盆。緩苗后采用莖基部創(chuàng)傷接種法，方法同1.2致病性測定。通過通風(fēng)簾控制室內(nèi)溫度。接種后每周觀察一次發(fā)病情況，以感病對照病情指數(shù)達(dá)到60以上的調(diào)查結(jié)果作為品種抗性評價標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 病圃接種發(fā)病鑒定

2009—2011年在煙田黑脛病圃中進(jìn)行。田間設(shè)計隨機(jī)排列，每品種設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)種植15株。行株距為1.2 m×0.50 m。其他田間栽培管理按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行。

1.5 病情調(diào)查與抗性評價

病害嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 23222—2008的規(guī)定[8]?？剐栽u價標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 23224—2008的規(guī)定[9]。

2 結(jié) 果

2.1 致病性測定

對現(xiàn)有菌株致病力的測定結(jié)果表明（表1），分離自云南文山的162#菌株致病力最強(qiáng)。

2.2 漂浮苗接種黑脛病抗性鑒定方法發(fā)病情況

在塑料拱棚溫室內(nèi)漂浮苗接種試驗中，不同抗性品種的病情指數(shù)差異明顯。創(chuàng)傷接種的煙苗病情指數(shù)明顯高于非創(chuàng)傷接種病指，且接種濃度高發(fā)病重。說明用病原培養(yǎng)原液接種并同時采用創(chuàng)傷接種法效果最好（表2）。

表1 分離菌株的致病力測定

在塑料拱棚溫室內(nèi)漂浮苗接種試驗中，感病對照紅花大金元、小黃金1025接種后第3天開始零星發(fā)病，隨后發(fā)病迅速，且無其他病害干擾。40 d苗齡接種、池內(nèi)水溫28 ℃比較適宜品種的抗性鑒定與評價（表3）。

2.3 漂浮苗接種、土壤盆栽接種與田間病圃接種的抗性結(jié)果比較

在漂浮苗接種抗性鑒定中，已知抗黑脛病的G28、革新三號、K326表現(xiàn)為中抗，中抗品種NC89、金星6007表現(xiàn)中抗，感病對照紅花大金元和小黃金1025表現(xiàn)為感病，高感的KM10表現(xiàn)為高感。在苗期土壤盆栽傷根接種抗性鑒定中，已知抗黑脛病的G28、革新三號、K326表現(xiàn)為中抗，中抗品種NC89、金星6007表現(xiàn)中抗，感病對照紅花大金元和小黃金1025表現(xiàn)為感病，高感的KM10表現(xiàn)為高感。漂浮苗接種法與苗期土壤盆栽傷根接種法得到的供試品種的病情指數(shù)表現(xiàn)為正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9160。田間病圃接種抗性鑒定中，已知抗黑脛病的G28、革新三號、K326表現(xiàn)為中抗，中抗品種NC89、金星6007表現(xiàn)中抗，感病對照紅花大金元和小黃金1025表現(xiàn)為感病，高感的KM10表現(xiàn)為高感。漂浮苗接種、土壤盆栽傷根接種和田間病圃接種鑒定的結(jié)果與品種本身抗性基本吻合（表4）。

表2 不同方法和不同濃度接種對黑脛病病情指數(shù)的影響

表3 不同溫度和不同苗齡接種對黑脛病病情指數(shù)的影響

3 討 論

漂浮苗接種鑒定方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下的優(yōu)點：1）在塑料拱棚溫室中均勻提高土壤溫度難度大，恒溫溫室造價高。本發(fā)明通過在普通漂浮池基礎(chǔ)上，增加簡單的保溫材料、加熱控溫設(shè)備和水循環(huán)泵，以低成本成功解決了溫度問題。2）采用市售的肥料和自來水配制營養(yǎng)液，與MS營養(yǎng)液和無菌水相比，成本大幅度降低。3）漂浮苗鑒定可在一個月之內(nèi)完成，使得提高煙苗密度、減少水培面積可行，從而大幅度減少接種菌的數(shù)量。

表4 漂浮苗接種、土壤盆栽接種與田間病圃接種的抗性

Table 4 The resistance comparison of three inoculation methods

注：HS（高感），S（感?。?，MS（中感），MR（中抗），R（抗?。?/p>

漂浮苗接種鑒定方法的實用性在于：發(fā)病迅速，從接種到調(diào)查結(jié)束可在1個月內(nèi)完成；占地面積小，在幾十平方米的面積上，一次可同時鑒定上千株煙苗；結(jié)果重復(fù)性高，能有效排除土壤溫度差異和其他病害對抗性結(jié)果的干擾，有利于年度間和不同實驗室間結(jié)果重現(xiàn)和比較；結(jié)果可靠性高，抗感品種的發(fā)病率和病情指數(shù)差異明顯，品種的抗性評價結(jié)果與他人多年的抗性評價結(jié)果基本一致。該方法在抗病資源和育種中間材料的抗性鑒定、抗性遺傳規(guī)律研究中應(yīng)用潛力較大。

4 結(jié) 論

漂浮苗接種鑒定方法具有很強(qiáng)的實用性，具有省工節(jié)時、結(jié)果可靠等優(yōu)點。其技術(shù)要點為：池底和池壁鋪保溫性能高的泡沫塑料板；設(shè)置池水加熱控溫棒、池水循環(huán)泵，使池水溫度穩(wěn)定、均勻控制在黑脛病適宜發(fā)病的溫度28 ℃；在池水中加入黑脛病菌至濃度1×108cfu/mL；采用苗齡40 d 左右煙苗創(chuàng)傷接種法進(jìn)行鑒定。

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[9] 孔凡玉，王鳳龍，張成省，等. GB/T 23224—2008 煙草品種抗病性鑒定[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社出版，2008.

A Float System Resistant Identification Method of Tobacco Black Shank

LI Meiyun, LIU Yong, XIAO Bingguang, LENG Xiaodong, LI Yongping

(Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Breeding Research Southern Center, Yuxi, Yunnan 653100)

Tobacco black shank is one of the most destructive diseases in tobacco. It is highly significance to establish an identification method on resistant of tobacco black shank using inoculation in a float seeding system. Pathogenicity determination was conducted and No 162 isolate was screened to study resistant identification of tobacco black shank disease. A resistant identification method in float seeding system was studied and the influence was analysized for different inoculation condition on identification results. The results showed that 40 d seedling inoculation, water temperature 28 ℃ and wound inoculation was fit to resistant identification and evaluation of tobacco varieties. Three inoculation methods (float system, pot experiment, and field nursery) were compared with regard to resistant identification. An identification method on resistant of tobacco black shank using inoculation in a float seeding system was established.

tobacco; black shank disease; resistant identification; float system

S572.08

1007-5119（2014）01-0076-04

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.014

中國煙草總公司資助項目（110201002001）；云南省科技廳資助項目（2012BB006）；云南省煙草公司計劃資助項目（05-06，2010YN02，2011YN06）

李梅云，女，碩士，副研究員，主要從事煙草病害研究。E-mail：630701256@qq.com

2012-08-24

2013-10-10