譚 軍，劉雨虹，劉 影，薩 爽，王 瑞*，趙秀云

?

不同條件對煙草青枯雷爾氏菌生長的影響

譚 軍1，劉雨虹2，劉 影2，薩 爽2，王 瑞1*，趙秀云2

（1.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070）

青枯雷爾氏菌（）是煙草青枯病的病原菌。為有效防治青枯病，研究了不同培養(yǎng)條件對青枯雷爾氏菌生長的影響；并測定了在不同pH、溫度以及在培養(yǎng)基中添加不同濃度的N、P、K、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、HCO3-、SO42-對青枯雷爾氏菌生長的影響。結(jié)果表明，青枯雷爾氏菌在偏酸和偏堿條件下生長較好，青枯雷爾氏菌最適生長溫度為25~45 ℃；高濃度的Zn2+和Cu2+能夠有效抑制青枯雷爾氏菌的生長，其他因素對青枯雷爾氏菌的生長無明顯作用。

青枯雷爾氏菌；影響；生長條件；煙草

煙草青枯病是由雷爾氏菌屬的茄假單胞桿菌（）引起的熱帶亞熱帶地區(qū)煙草的重要病害，是一種典型的維管束病害，一旦發(fā)病即可造成全株死亡，對煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量影響極大，是煙草的毀滅性病害[1]。目前對煙草青枯病的防治，仍無十分有效的措施[2]，生產(chǎn)上主要采用農(nóng)業(yè)防治、藥劑防治和生物防治，但效果均不顯著，缺乏特效的藥劑和抗性品種。

本研究詳細(xì)分析了不同培養(yǎng)條件、礦質(zhì)元素、微量元素等對青枯病菌生長的影響，為在生產(chǎn)中控制土壤中青枯雷爾氏菌病原而達(dá)到控制病害奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 儀器有搖床、分光光度計、pH計、電子分析天平、滅菌鍋、超凈工作臺等。

1.1.2 供試菌株 實(shí)驗(yàn)菌株是采用組織分離法，從感染青枯病的煙草根莖部分離獲得青枯勞爾氏菌的。

1.1.3 試劑 實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，所用試劑均為分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基 使用NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏1.5 g，酵母膏0.5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，dH2O 1000 mL，pH為7.2。PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，蔗糖20 g，dH2O 1000 mL[3]。

1.2 培養(yǎng)條件

1.2.1 青枯雷爾氏菌的培養(yǎng) 固體培養(yǎng)：無菌條件下，用接種環(huán)將保存于-20 ℃的青枯勞爾氏菌菌種劃線接種至涂有TTC的PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃避光條件下活化24 h備用。

液體培養(yǎng)：將經(jīng)平板活化的青枯勞爾氏菌菌種接種至NA培養(yǎng)液中，于28 ℃、200 r/min避光條件下進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得細(xì)菌懸浮液。

1.2.2 青枯雷爾氏菌培養(yǎng)特性試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)要求，分別設(shè)置不同的培養(yǎng)溫度、pH以及營養(yǎng)條件對青枯勞爾氏菌的培養(yǎng)特性進(jìn)行檢測和分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)均為同一條件下3次重復(fù)的平均值。

2 結(jié) 果

2.1 青枯雷爾氏菌生長曲線的測定

對青枯雷爾氏菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，每隔4 h取樣，測定各培養(yǎng)時間菌液的OD600。繪制青枯雷爾氏菌的生長曲線（圖1）。

圖1 青枯雷爾氏菌的生長曲線

由圖1中可以得知，4~16 h青枯雷爾氏菌的生長處于對數(shù)期，16~24 h青枯雷爾氏菌的生長處于穩(wěn)定期。24 h后青枯雷爾氏菌開始衰亡。一般來說選定對數(shù)期的菌種作為種子液，因?yàn)槠渖L最快，性質(zhì)穩(wěn)定，同時延遲期短。在本次試驗(yàn)中，選定培養(yǎng)15 h的菌液，通過測定菌液的OD600值代表菌種的生長量，通過比較OD值來分析各種因素對青枯雷爾氏菌生長的影響。

2.2 pH對青枯雷爾氏菌生長的影響

將培養(yǎng)基的初始pH分別設(shè)置為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，將對數(shù)生長期的菌液按1%的接種量接種于10 mL培養(yǎng)液中，于28 ℃，200 r/min進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)，15 h后測定培養(yǎng)液的OD600（圖2）。

圖2 初始pH對青枯雷爾氏菌生長的影響

2.3 溫度對青枯雷爾氏菌生長的影響

將培養(yǎng)溫度設(shè)置為15、20、25、30、33、35、37、40、45、50 ℃。將處于對數(shù)生長期的菌液按1%的接種量接種于10 mL培養(yǎng)液中，于28 ℃，200 r/min進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)，15 h后測定各培養(yǎng)液的OD600（圖3）。

圖3 溫度對青枯雷爾氏菌生長的影響

2.4 氮、磷、鉀濃度對青枯雷爾氏菌生長的影響

分別用蒸餾水配制（NH4）2SO4、NaNO3、磷酸鹽（NaH2PO4/K2HPO4）、KCl母液，加入培養(yǎng)基中使其終濃度為0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、5、8、10 g/L。每處理設(shè)3次重復(fù)。將處于對數(shù)生長期的菌液按1%的接種量接種于10 mL培養(yǎng)液中，于28 ℃，200 r/min進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)，15 h后測定各培養(yǎng)液的OD600（圖4）。

圖4 不同氮、磷、鉀含量對青枯雷爾氏菌生長的影響

2.5 微量元素（鋅、銅、鈣、鎂）對青枯雷爾氏菌生長的影響

Zn2+(ZnSO4·7H2O)，Cu2+(CuSO4·5H2O)，Ca2+(Ca Cl2·2H2O)，Mg2+(MgSO4·7H2O) 4種微量元素貯備液的配制均為分析純，用蒸餾水配制成1 mol/L的母液備用。分別加入不同微量元素貯備液，使其終濃度為0、0.01、0.05、0.1、1、1.5、2 mmol/L。每處理設(shè)3次重復(fù)。將對數(shù)生長期的菌液按1%的接種量接種于各處理的培養(yǎng)液中，于28 ℃，200 r/min進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)，15 h后用720可見分光光度計測定培養(yǎng)液的OD600。觀察不同濃度的不同微量元素對青枯雷爾氏菌生長的影響（圖5）。

2.6 碳酸氫根和硫酸根離子濃度對青枯雷爾氏菌生長的影響

在培養(yǎng)基中加入NaHCO3或Na2SO4，使培養(yǎng)基終濃度為0、0.5、1、2、3、4、5 g/L，每處理設(shè)3次重復(fù)。將對數(shù)生長期的菌液按1%的接種量接種于各處理的培養(yǎng)液中，于28 ℃，200 r/min進(jìn)行恒溫振蕩培養(yǎng)，15 h后，用720可見分光光度計測定培養(yǎng)液的OD600。觀察不同濃度的碳酸氫根離子對青枯雷爾氏菌生長的影響（圖6）。

圖5 鋅、銅、鎂、鈣濃度對青枯雷爾氏菌生長的影響

圖6 碳酸氫根和硫酸根離子對青枯雷爾氏菌生長的影響

3 討 論

由所得數(shù)據(jù)可知，本次實(shí)驗(yàn)所用青枯雷爾氏菌對偏酸或偏堿性的環(huán)境下皆能生長，在pH為6.0~10.0范圍內(nèi)生長良好，隨著pH的降低或升高，菌體生長量都會明顯降低。溫度是影響植物細(xì)菌性青枯病發(fā)生和流行的關(guān)鍵氣象因子之一，它通過影響細(xì)胞膜的流動性及運(yùn)輸系統(tǒng)的生理活性（酶催化反應(yīng)等）來影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力，從而影響細(xì)胞的生長繁殖[4]。隨著溫度的降低或升高，酶活性都會受到影響，菌體生長量都較低，在30~33 ℃生長良好，菌體能有效利用營養(yǎng)物質(zhì)生長。在培養(yǎng)時間不少于12 h，溫度為30 ℃，pH為7左右，培養(yǎng)瓶中空氣含量60%以上，青枯菌的菌液濃度較高，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也相對較高[4]。

不同氮含量對青枯雷爾氏菌生長的影響不大，菌體對銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的利用明顯不好。添加有磷和鉀的培養(yǎng)基，青枯雷爾氏菌的生長量與對照組的相比差距很小，隨著濃度的增加生長量變化小且沒有規(guī)律，說明其對青枯雷爾氏菌的生長影響不大。在煙草生產(chǎn)中適當(dāng)提高鉀肥施用量可以減輕病害的發(fā)生[5]，青枯病是典型的維管束病害，KNO3可以促進(jìn)植物維管組織的生長，增強(qiáng)植物的抗逆性[6]。在添加有微量元素的培養(yǎng)基中，鋅和銅對青枯雷爾氏菌的生長影響較大，在低濃度時與對照組相比生長量基本一致，而在高濃度時對青枯雷爾氏菌有明顯的抑制作用，鋅、銅濃度分別為2、1.5 mmol/L時，青枯雷爾氏菌的生長量最低。而鈣濃度為2 mmol/L時，青枯雷爾氏菌的生長量最低，與對照組相比效果明顯，但相比鋅和銅其降低值不明顯。青枯雷爾氏菌一旦進(jìn)入植物體，在導(dǎo)管中快速生長的同時，向胞外分泌多種細(xì)胞壁降解酶，而果膠酶就是其中一種。研究表明，鈣對青枯雷爾氏菌產(chǎn)果膠酶有一定的影響，低濃度鈣（5 mmol/L）能夠影響青枯雷爾氏菌產(chǎn)果膠酶，且隨鈣濃度的加大，總酶活性及酶量越低[7]。在生長實(shí)踐中可以通過抑制青枯雷爾氏菌的生長，來影響煙草青枯病的發(fā)病程度。隨著碳酸氫根離子濃度的增加，菌體的生長量有所降低，但是降低值不明顯。對青枯雷爾氏菌生長有抑制作用，但是效用不大。不同硫酸根離子濃度對青枯雷爾氏菌生長的影響不突出，與對照組相比生長量差距不明顯。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中，添加的礦質(zhì)元素鋅和銅對青枯雷爾氏菌生長影響較大。今后防治煙草青枯病，應(yīng)遵循農(nóng)業(yè)防治、生物防治和化學(xué)防治相結(jié)合；“控氮、穩(wěn)磷、增鉀、補(bǔ)微”平衡施肥的原則。適量添加礦質(zhì)元素鋅和銅，既能增加植物抗逆性，又能減少青枯雷爾氏菌數(shù)量，可有效緩解青枯病給煙葉帶來的危害，是防治煙草青枯病的有效措施。

[1] 朱賢朝，王彥亭，王智法. 中國煙草病蟲害防治手冊[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[2] 孔凡玉. 煙草青枯病的綜合防治[J]. 煙草科技，2003（4）：42-43.

[3] 楊生玉，王剛，沈永紅. 微生物生理學(xué)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007.

[4] 劉星. 青枯菌培養(yǎng)特性及廣蕃香抗病性鑒定方法的研究[D]. 廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2009.

[5] 盧洪興，邱志丹，曾軍，等. 煙草青枯病發(fā)生與防治研究[J]. 煙草科技，1995（5）：42-45.

[6] 謝建輝，賀紅，劉丹，等. 廣藿香青枯病菌培養(yǎng)特性的研究[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報，2011，27（1）：39-43.

[7] 李洪. CaCO3對青枯病菌生長的影響及土壤中青枯病菌的定量PCR分析[D]. 重慶：西南大學(xué)，2012.

Effects of Different Conditions on Growth of Tobacco

TAN Jun1, LIU Yuhong2, LIU Ying2, SA Shuang2, WANG Rui1*, ZHAO Xiuyun2

(1. Enshi Tobacco Company of Hubei Province, Enshi, Hubei 445000, China; 2. College of Life Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

is a one of tobacco bacterial wilt pathogens. In order to identify strategies of effective prevention and treatment of bacterial wilt, the effects of different culture conditions, including pH, temperature, N, P, K, Zn2+, Cu2+, Ca2+, Mg2+, HCO3-, SO42-on the growth ofwere investigated. The results showed thatgrew better in slight acidic or alkali condition. The optimum growth temperature ofwas between 25 and 45 ℃. High concentrations of Zn2+and Cu2+could inhibit the growth of.

; effect; growth conditions; tobacco

S572.08

1007-5119（2014）01-0085-04

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.016

湖北省煙草公司（專賣局）項(xiàng)目“煙草青枯病病原菌生物學(xué)特性及綜合防控技術(shù)研究與示范”（027Y2013-002）

譚 軍，男，農(nóng)藝師，主要從事煙草栽培與病蟲害綜合防治。E-mail：kjzx709@126.com。

通信作者，E-mail：wangrui2999@126.com

2013-05-30

2013-12-04