于會(huì)泳，申國(guó)明，高欣欣,2

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連作煙田土壤根系分泌物的變化和分解

于會(huì)泳1，申國(guó)明1，高欣欣1,2

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，農(nóng)業(yè)部煙草生物學(xué)與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

為闡明煙田土壤中根系分泌物的變化規(guī)律及確定具有化感作用的根系分泌物種類(lèi)，研究分析了種煙1年、連作2年和連作3年0~20 cm、20~40 cm煙田土壤中根系分泌物的含量變化，并通過(guò)室內(nèi)試驗(yàn)研究了煙草根系分泌物的分解轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明：（1）煙田土壤中含量較高的根系分泌物種類(lèi)有苯甲酸、4-羥基苯乙酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸和鄰苯二甲酸二辛酯，其中4-羥基苯乙酸含量最高，含量較低的種類(lèi)有4-羥基丁酸和甘油；（2）羥基丁酸、3-甲基-2-羥基丁酸、4-羥基丁酸、肉桂酸、油酸、硬脂酸酰胺和煙堿對(duì)煙草無(wú)直接化感作用；（3）室內(nèi)試驗(yàn)表明，肉桂酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸、鄰苯二甲酸、3-羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸二辛酯、4-羥基苯乙酸和肉豆蔻酸的分解轉(zhuǎn)化率均小于50%；（4）初步判定具有化感作用的根系分泌物種類(lèi)包括：苯甲酸、3-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、月桂酸、鄰苯二甲酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、9,12-十八碳二烯酸、苯丙酸、東良菪素、肉桂酸、鄰苯二甲酸二辛酯和4-羥基苯乙酸。

煙草；土壤；化感物質(zhì)；分解轉(zhuǎn)化

化感物質(zhì)幾乎全為植物的次生代謝物質(zhì)，主要種類(lèi)有簡(jiǎn)單不飽和脂肪酸、長(zhǎng)鏈脂肪酸和多炔、醌類(lèi)、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素類(lèi)、類(lèi)黃酮類(lèi)、單寧、內(nèi)萜、氨基酸和多肽、生物堿和氰醇、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷等14類(lèi)，其中低分子量有機(jī)酸、酚類(lèi)和萜類(lèi)化合物最為常見(jiàn)，其在植物體內(nèi)的合成途徑模型由Rice[1]最早得出，Birkett等[2]對(duì)一些化感物質(zhì)進(jìn)入根際的途徑進(jìn)行了詳細(xì)闡述?；形镔|(zhì)對(duì)作物生理[3-8]、土壤理化性質(zhì)[9-11]具有重要影響?；行?yīng)在一定的濃度基礎(chǔ)上才能表現(xiàn)出來(lái)，自然狀態(tài)下根系分泌物的化感物質(zhì)含量極少，不足以發(fā)揮化感效應(yīng)[2]。根系分泌的化感物質(zhì)首先進(jìn)入根際土壤，隨土壤水分進(jìn)行遷移，受土壤質(zhì)地、粒徑結(jié)構(gòu)及有機(jī)質(zhì)等多種因素影響，在土壤中的行為極其復(fù)雜，包括吸附解析過(guò)程、轉(zhuǎn)化和降解與滯留過(guò)程?？状谷A等[12]發(fā)現(xiàn)勝紅薊產(chǎn)生的重要化感物質(zhì)勝紅薊素的轉(zhuǎn)化與土壤營(yíng)養(yǎng)水平顯著相關(guān)，在營(yíng)養(yǎng)條件好的土壤中首先聚合成二聚體，26 d后解聚為勝紅薊素，然后降解為無(wú)活性的小分子物質(zhì)，在低營(yíng)養(yǎng)水平的土壤中直接降解為小分子物質(zhì)。

煙草根系分泌物中的化感物質(zhì)被認(rèn)為是造成連作障礙的重要原因[13-15]。研究煙田土壤中根系分泌物的分布與轉(zhuǎn)化規(guī)律有助于闡明化感物質(zhì)種類(lèi)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤于2011年10月中旬采自于山東省日照市五蓮縣于里鎮(zhèn)現(xiàn)代煙草農(nóng)業(yè)科技示范園“山東基本煙田綜合治理”項(xiàng)目土壤質(zhì)量長(zhǎng)期定位監(jiān)測(cè)點(diǎn)，土壤類(lèi)型為潮棕壤。煙草根系分泌物降解研究取連作3年0~20 cm耕層土壤進(jìn)行試驗(yàn)；不同連作年限煙田土壤根系分泌物變化研究試驗(yàn)所用土壤為種煙1年、連作2年和連作3年的0~20 cm、20~40 cm土壤。

取樣方法：在煙葉收獲后，用土鉆在相應(yīng)的處理地塊中沿“S”形多點(diǎn)取樣，每個(gè)樣品取土約2 kg，在實(shí)驗(yàn)室用四分法分取，所得土壤樣品經(jīng)處理后待用。土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)如表1。

1.2 方法

1.2.1 煙草根系分泌物降解試驗(yàn)土壤處理方法 撿除新鮮土壤中的石塊和植物殘?bào)w，過(guò)2 mm篩，調(diào)節(jié)含水量，達(dá)到手感濕潤(rùn)但不結(jié)塊，混勻，此時(shí)土壤含水量約為飽和持水量的40%。取處理好的鮮土1 kg，放置于25 ℃、黑暗環(huán)境中，放置1小杯1 mol/L NaOH溶液用于吸收土壤呼吸釋放的CO2，1小杯水用于保持土壤濕度，3次重復(fù)，每3 d取樣1次，每次取25 g，共取5次，即檢測(cè)土壤15 d內(nèi)根系分泌物的含量變化，其中取處理好的土壤25 g做為初始樣品。

1.2.2 土壤根系分泌物檢測(cè)方法 取25 g鮮土置于50 mL離心管中，3次重復(fù)，加入25 mL、1 mol/L NaOH放置過(guò)夜，次日180 r/min振蕩30 min，用高速離心機(jī)（6000 r/min）對(duì)振蕩液進(jìn)行離心7 min，過(guò)濾液用12 mol/L的HCl酸化至pH 2.5，2 h后用高速離心機(jī)（6000 r/min、7 min）除去胡敏酸，而后上清液過(guò)0.22 μm的纖維素薄膜，濾液用Agilent 1290—6430超高壓液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)。其中煙堿采用正離子模式進(jìn)行檢測(cè)，其他物質(zhì)采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 檢測(cè)條件 儀器：Agilent 1290—6430超高壓液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×150 mm×1.8 μm）；流動(dòng)相：A為5%乙腈·H2O；B為乙腈；流速0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL，梯度洗脫條件見(jiàn)表2。MS條件：離子源ESI，掃描范圍50~500 m/z；毛細(xì)管電壓：正離子模式4 KV，負(fù)離子模式-4 KV；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化氣壓力40 psi。

表1 供試土壤理化性質(zhì)

表2 梯度洗脫條件

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用SAS 9.1.3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同連作年限煙田土壤根系分泌物的含量變化

表3為不同連作年限煙田0~20 cm和20~40 cm土壤根系分泌物的含量變化，從中可看出：（1）不同連作年限的土壤中不包含2-羥基丙酸和硬脂酸；（2）煙田土壤中含量較高的根系分泌物種類(lèi)包括苯甲酸、4-羥基苯乙酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸和鄰苯二甲酸二辛酯，其中4-羥基苯乙酸含量最高；含量較低的種類(lèi)有4-羥基丁酸和甘油；（3）0~20 cm耕層土壤中隨著連作年限增加而增加的根系分泌物種類(lèi)有：苯甲酸、硬脂酸酰胺和鄰苯二甲酸二丁酯，其中苯甲酸在20~40 cm也隨連作年限的增加而增加。煙草隨著連作年限增加所受到的不良影響越大[16]，所以苯甲酸很可能為隨著濃度增加而對(duì)煙草產(chǎn)生不良影響的化感物質(zhì)。苯甲酸和肉桂酸以及水楊酸也已在番茄、辣椒、西瓜、甜瓜和楊樹(shù)的根系分泌物中被鑒定出來(lái)具有化感作用，通過(guò)影響離子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白質(zhì)和DNA合成等多種途徑影響作物生長(zhǎng)[17-19]。（4）羥基丁酸、丁二酸、油酸、硬脂酸酰胺和3-甲氧基-4-羥基苯乙酸含量在0~20 cm和20~40 cm的土壤中以連作2年最高；4-羥基苯乙酸的含量連作2年最低；3-甲基-2-羥基丁酸、肉桂酸含量在0~20 cm土壤中以連作2年最高，在0~40 cm土壤中的含量隨連作年限增加而減少，因?yàn)殡S著連作年限的增加，煙草連作障礙越嚴(yán)重，直接產(chǎn)生化感作用的物質(zhì)含量應(yīng)越來(lái)越高，所以排除這幾種物質(zhì)是直接起化感作用的物質(zhì)。（5）煙堿含量是采用正離子模式檢測(cè)的，含量無(wú)法與其他物質(zhì)進(jìn)行對(duì)比，連作2年的土壤煙堿含量較第1年種煙與連作3年低，排除其作為直接化感物質(zhì)的可能性。

表3 不同連作年限煙田土壤根系分泌物的含量變化

Table 3 The Variation in contents of root exudates in different tobacco planting systems

注：表中數(shù)據(jù)無(wú)單位，為粒子流強(qiáng)度，是波面積的積分，代表物質(zhì)含量大小。表4同。

2.2 煙草根系分泌物的分解轉(zhuǎn)化

為了進(jìn)一步確定煙草根系分泌物中的化感物質(zhì)種類(lèi)，通過(guò)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究了根系分泌物的分解轉(zhuǎn)化。表4為經(jīng)培養(yǎng)0、3、6、9、12、15 d后根系分泌物的含量變化?？煽闯鼋?jīng)培養(yǎng)15 d后，所有根系分泌物均被不同程度分解轉(zhuǎn)化，其中甘油完全被分解轉(zhuǎn)化，NC89與K326共有的根系分泌物2-羥基丙酸和硬脂酸在本試驗(yàn)中未被檢測(cè)到，所以排除這3種物質(zhì)作為化感物質(zhì)的可能性；丁二酸是三羧酸循環(huán)中一種有機(jī)酸，不是化感物質(zhì)；其他種類(lèi)的分解轉(zhuǎn)化率為24.6%～79.5%，超過(guò)50%的13種，其中肉桂酸最低，油酸最高。

表4 煙草根系分泌物的分解轉(zhuǎn)化

注：同一物質(zhì)不同時(shí)間數(shù)據(jù)間均呈顯著性差異（<0.5）。

化感效應(yīng)的發(fā)揮必須建立在一定濃度基礎(chǔ)之上，從濃度的角度可認(rèn)為越易分解轉(zhuǎn)化的物質(zhì)作為化感物質(zhì)的可能性越小。根系分泌物中分解轉(zhuǎn)化率超過(guò)70%的種類(lèi)有油酸、硬脂酸酰胺、煙堿，認(rèn)為它們是化感物質(zhì)的可能性小，煙草根系分泌物分解轉(zhuǎn)化率小于50%的種類(lèi)有肉桂酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸、鄰苯二甲酸、3-羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸二辛酯、4-羥基苯乙酸和肉豆蔻酸，認(rèn)為它們是化感物質(zhì)的可能性大。

各種物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化規(guī)律不同，其中第3~6天轉(zhuǎn)化較快的根系分泌物種類(lèi)包括9，12-十八碳二烯酸、硬脂酸酰胺和己二酸二辛酯；鄰苯二甲酸和鄰苯二甲酸二丁酯在第9~12天分解轉(zhuǎn)化較快；3-甲基-2-羥基丁酸、4-羥基苯乙酸和苯基酸在第6~9天分解轉(zhuǎn)化最快。化感物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化有理化與生物學(xué)過(guò)程，根系分泌物可為土壤微生物提供營(yíng)養(yǎng)，生物作用可能在根系分泌物的轉(zhuǎn)化過(guò)程中起主要作用。本研究主要考慮了土壤生物學(xué)過(guò)程對(duì)根系分泌物分解轉(zhuǎn)化的影響，其他因素如晝夜溫差、土壤含水量和光照等變化對(duì)根系分泌物也有顯著影響。

3 結(jié) 論

化感物質(zhì)應(yīng)具有累積性，因?yàn)闊煵菀蜻B作年限的增加所受到的影響越大，所以化感物質(zhì)在連作時(shí)間長(zhǎng)的土壤中含量越高，化感物質(zhì)也應(yīng)具有不易轉(zhuǎn)化性，這樣才能體現(xiàn)出化感作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，最可能對(duì)煙草具有化感作用的物質(zhì)為苯甲酸；其次為3-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、月桂酸、鄰苯二甲酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、9,12-十八碳二烯酸、鄰苯二甲酸二辛酯、4-羥基苯乙酸、苯丙酸和東良菪素以及煙堿；對(duì)煙草不直接起化感作用的物質(zhì)包括羥基丁酸、3-甲基-2-羥基丁酸、4-羥基丁酸、肉桂酸、油酸、硬脂酸酰胺，但不能排除他們的間接作用。

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The Changes and Degradation of Tobacco Root Exudates in Tobacco Field with Continuous Cropping

YU Huiyong1, SHEN Guoming1, GAO Xinxin1,2

(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing, Ministry of Agriculture, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081,China)

We analyzed contents of tobacco root exudates in 0-20 cm and 20-40 cm soil where tobacco had grown for 1 year, 2 years, and 3 years in order to investigate variation of exudates in tobacco field and identify allelochemicals. The results showed that the content of benzoic acid, 4-hydroxyphenylacetic acid, 3-oxygen-4-hydroxyphenylacetic acid and phthalic acid dioctyl ester in tobacco field were high, of which 4-hydroxyphenylacetic acid was the highest, and the content of 4-hydroxybutyric acid and glycerin were low. Hydroxybutyric acid, 3-methyl-2-hydroxy butyric acid, 4-hydroxybutyric acid, cinnamic acid, oleic acid, stearic acid amide and nicotine had no direct allelopathic influence to tobacco. The decomposition rates of cinnamic acid, 3-methoxy-4-hydroxyphenyl acetic acid, phthalic acid, 3-hydroxy benzoic acid, dioctyl phthalate, 4-hydroxyphenyl acetic acid and myristic acid were less than 50%. We proposed that the following acids were allelochemicals, including benzoic acid, 3-hydroxybenzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, lauric acid, oterephthalic acid, 3-methoxy-4-hydroxyphenyl acetic acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid, myristic acid, palmitic acid, 9,12-octadecadienoic acid, acrylic acid, scopoletin, cinnamic acid, phthalic acid dioctyl phthalate and 4 - hydroxyphenylacetic acid.

tobacco; soil; allelochemical; decomposition

S572.01

1007-5119（2014）01-0043-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.008

青島市科技局，青島市公共領(lǐng)域科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目“煙草根系分泌物對(duì)土壤生物學(xué)性質(zhì)的影響規(guī)律研究”（12-1-3-47-nsh）；山東省煙草專(zhuān)賣(mài)局重大科技專(zhuān)項(xiàng)“山東基本煙田土壤綜合治理研究”{魯煙科[2010]19號(hào)}

于會(huì)泳，男，助理研究員，主要研究領(lǐng)域?yàn)闊煵菰耘唷-mail：110138406@qq.com

2012-06-15

2013-05-07