喬 進(jìn)，竇志華，吳 鋒，孟國(guó)梁，陳 惠，鄭惠華

糖尿病心肌病作為糖尿病（diabetes mellitus，DM）的慢性并發(fā)癥之一，是獨(dú)立于心臟大血管病變的一種特異性疾病，其發(fā)病的可能機(jī)制包括代謝障礙、心肌纖維化、胰島素抵抗及細(xì)胞因子異常［1］。心肌纖維化在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。糖尿病狀態(tài)下，由于基質(zhì)的大量增生和膠原的降解異常，導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展。其病理學(xué)表現(xiàn)為心臟成纖維細(xì)胞數(shù)量的增加，心肌間質(zhì)中膠原沉積增多、各型比例失調(diào)和排列紊亂［2］。靈芝多糖（GLPs）是靈芝中最有效的成分之一，一系列的研究表明靈芝多糖具有降血糖、抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性［3］。吳鋒等［4］研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖能抑制大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激。二甲雙胍（metformin，Met）為臨床常用降糖藥，具有明顯降糖和改善胰島素抵抗的作用，近年來研究證實(shí)了其具有一定的防治糖尿病血管并發(fā)癥和保護(hù)心血管的作用［5］。它們聯(lián)合應(yīng)用治療糖尿病心肌病具有某些理論上的優(yōu)點(diǎn)，在降低血糖的同時(shí)抑制體內(nèi)氧化應(yīng)激水平和AGEs水平。但兩種藥合用的療效是否優(yōu)于單用，尚未見靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍治療糖尿病的報(bào)道，本研究建立2型糖尿病大鼠模型，觀察靈芝多糖和二甲雙胍聯(lián)合應(yīng)用對(duì)2型糖尿病大鼠心肌AGEs和CTGF的抑制作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠80只，♀♂各半，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)：FYXK（蘇）2007－0021。

1.2 藥品與儀器 靈芝多糖（江蘇安惠生物科技有限公司，批號(hào)：100601）；二甲雙胍（上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)：67100507）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma公司），臨用前用 0.1 mol·L－1檸檬酸緩沖液配成濃度為1%的STZ溶液；過氧化氫酶（CAT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所產(chǎn)品）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。即用型第2代免疫組化Elivision TM plus廣譜試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；兔抗AGEs、CTGF多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔及羊抗小鼠IgG（上海康成生物工程有限公司）；小鼠抗β-actin多克隆抗體（上?？党缮锕こ逃邢薰荆?；預(yù)染蛋白Marker（分子質(zhì)量6.5～175.0 ku，New England Biolabs）。One Touch血糖儀購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司；BH-NIC-B型倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；蛋白電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；SH-100型凝膠圖像分析儀購(gòu)自上海復(fù)旦四星高科技技術(shù)公司。

1.3 分組與給藥 80只SD大鼠分籠喂養(yǎng)，自由飲水，分為正常對(duì)照組和造模組。正常對(duì)照組（CON）10只，給予普通飼料喂養(yǎng)。造模組70只給予高脂飲食（脂肪20%、奶粉5%、蛋黃粉5%、基礎(chǔ)飼料70%），喂養(yǎng)4周后禁食12～14 h，予 STZ 30 mg·kg－1腹腔注射。1周后，空腹血糖值≥11.1 mmol·L－1即造模成功，繼續(xù)高脂飲食。取40只成模大鼠隨機(jī)分為 4組：糖尿病組（DM）；靈芝多糖組（GLPs），靈芝多糖 600 mg· kg－1；二甲雙胍組（Met），二甲雙胍 600 mg· kg－1；聯(lián)合用藥組（COM），靈芝多糖300 mg·kg－1＋二甲雙胍300 mg·kg－1。每日上午11∶00時(shí)灌胃給藥1次，正常對(duì)照組和糖尿病組予生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥12周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 血糖測(cè)定 給藥12周末，禁食14～16 h后，經(jīng)尾靜脈取血測(cè)空腹血糖。

1.4.2 心肌組織飽和苦味酸天狼猩紅染色 將組織按常規(guī)沖洗，不同濃度乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片（厚度5μm）。切片脫蠟至水，在0.1%苦味酸天狼猩紅溶液中染1 h，自來水沖洗，再經(jīng)Harris蘇木精染核，常規(guī)脫水，透明，樹膠封片。在普通顯微鏡下，觀察心肌間質(zhì)及血管周圍纖維化情況。

1.4.3 血清糖基化終末產(chǎn)物含量測(cè)定 取0.2 ml血清用雙蒸水稀釋10倍，即稀釋成2 ml放入比色皿中，設(shè)置熒光分光光度計(jì)激發(fā)光波長(zhǎng)370 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)440 nm，狹縫間隙3nm，測(cè)定熒光強(qiáng)度。AGEs含量以每毫升樣品中所含熒光強(qiáng)度為一個(gè)任意單位，用 AU（arbitary unit）表示，即 kAU·L－1。

1.4.4 心肌CAT、GSH-Px檢測(cè) 分離心肌組織，使用測(cè)試盒分別測(cè)定心肌組織CAT、GSH-Px含量。

1.4.5 免疫組織化學(xué)法測(cè)定心肌組織AGEs、CTGF的表達(dá) 取部分心肌組織，常規(guī)固定，石蠟包埋。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌組織中AGEs、CTGF的含量，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。各抗體按1∶50的方法稀釋，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，將切片置于高倍鏡下（×200），每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒即為陽(yáng)性信號(hào)。采用JEDA801D型形態(tài)學(xué)圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性信號(hào)所占面積及平均灰度，二者乘積（即積分光密度值）越大表明組織中該抗原含量越高。

1.4.6 免疫印跡AGEs、CTGF蛋白的表達(dá) 取心肌組織100 mg，加入含有蛋白酶抑制劑的組織裂解液冰上提取蛋白，BCA法蛋白定量。8%的 SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，電流100 V；300 mA轉(zhuǎn)膜150 min；含有5%脫脂奶粉TBST室溫封閉1 h，分別加入AGEs、CTGF和β-actin抗體4℃過夜。滴加相應(yīng)的二抗室溫反應(yīng)1 h，掃膜并使用Image J進(jìn)行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Stata 7.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以ˉx±s表示，比較采用單因素方差分析，q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠空腹血糖 糖尿病組空腹血糖水平高于正常對(duì)照組，差異有顯著性（P＜0.01）。用藥組空腹血糖水平均低于糖尿病組性（P＜0.01），其中聯(lián)合用藥組下降幅度最大，見Tab 1。

Tab 1 Blood glucose in rats of each group（ˉx±s，n＝10）

2.2 心肌組織天狼猩紅染色 血管纖維化和間質(zhì)纖維化是心肌纖維化病變的兩種主要形式。在飽和苦味酸－天狼猩紅染色下，心肌細(xì)胞呈黃色，膠原纖維呈紅色。Fig 1A～E顯示了各組大鼠左室心肌壁內(nèi)血管周圍纖維化情況，可見CON組血管周圍有少許紅色膠原增生，不向周圍間質(zhì)發(fā)射；DM組血管周圍有大量的束狀、片狀紅色膠原纖維異常堆積，并向周圍心肌組織間隙延伸；與DM組相比，其余各治療組大鼠心肌壁內(nèi)血管周圍膠原明顯減少，其中聯(lián)合用藥組減少最為明顯。Fig 1a～e顯示了各組大鼠左室心肌間質(zhì)纖維化情況，可見CON組大鼠左室心肌間質(zhì)內(nèi)僅有少量膠原；而DM組間質(zhì)膠原明顯增多，纖維條索較粗；與DM組相比，其余各治療組大鼠心肌間質(zhì)膠原增生明顯減輕，其中聯(lián)合用藥組減輕最為明顯。

2.3 大鼠血清AGEs含量測(cè)定 糖尿病組大鼠血清AGEs含量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01），靈芝多糖組和二甲雙胍組較模型組明顯下降（P＜0.05），聯(lián)合用藥組血清AGEs含量明顯低于模型組（P＜0.01），見 Tab 2。

Tab 2 AGEs levels of serum in rats of each group（ˉx±s，n＝10）

Fig 1 Myocardium of left ventricle collagen of rats（Picro-sirius red staining）（×400）

2.4 大鼠心肌CAT、GSH-Px變化 與正常對(duì)照組相比，糖尿病組心肌組織CAT和GSH-Px水平明顯降低（P＜0.01），靈芝多糖組和二甲雙胍組較模型組略有升高（P＜0.05），聯(lián)合用藥組明顯高于模型組（P＜0.01），見 Tab 3。

Tab 3 CAT and GSH-Px levels on myocardium in rats of each group（ˉx±s，n＝10）

2.5 免疫組化檢測(cè)心肌組織中AGEs、CTGF的表達(dá) 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IH）結(jié)果如Fig 2所示：大鼠心肌組織AGEs和CTGF免疫組化結(jié)果，細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒即為陽(yáng)性信號(hào)。Fig 2可見，CON組大鼠左室心肌組織AGEs和CTGF低表達(dá)，陽(yáng)性顆粒散在，染色較淺；DM組高表達(dá)，棕黃色信號(hào)強(qiáng)，融合成片，而各治療組表達(dá)均明顯降低，其中聯(lián)合用藥組降低更為明顯。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野，采用JEDA801D型形態(tài)學(xué)圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性信號(hào)所占面積及平均灰度，二者乘積（即積分光密度值）越大表明組織中該抗原含量越高。結(jié)果見 Tab 4：與 CON組相比，AGEs和CTGF的表達(dá)在DM組中明顯升高（P＜0.01）；與DM組相比，3個(gè)治療組AGEs和CTGF的表達(dá)明顯降低（P＜0.01），其中聯(lián)合用藥組的兩種蛋白表達(dá)最低（P＜0.01）。

Tab 4 Expression of AGEs and CTGF in myocardium of diabetic rats（ˉx±s，n＝10）

2.6 蛋白印記檢測(cè)心肌組織中AGEs、CTGF的表達(dá) 蛋白印跡結(jié)果見 Fig 3，β-actin（42 ku）作為內(nèi)參，在各組中有較均一的表達(dá)；AGEs和CTGF在各組中的蛋白條帶深淺不一。

用四星圖像處理系統(tǒng)測(cè)出各組AGEs和CTGF蛋白表達(dá)量與β-actin的表達(dá)量，并計(jì)算出其比值。DM組的AGEs和CTGF蛋白表達(dá)明顯高于CON組（P＜0.01），與DM組相比，3個(gè)治療組的兩種蛋白表達(dá)均下調(diào)，聯(lián)合用藥組組下調(diào)最為明顯（Tab 5）。

Tab 5 AGEs and CTGF in myocardium of diabetic rats by Western blot（ˉx±s，n＝10）

3 討論

Fig 2 Myocardium of left ventricle of rats by immunohistochemistry（×200）

Fig 3 AGEs and CTGF in myocardium of diabetic rats by Western blot

糖尿病心肌病變是由糖尿病所致的一種心臟疾病，隨著病情的發(fā)展逐漸出現(xiàn)心肌收縮力減弱，心肌舒張受限，每搏心輸出量減少，并出現(xiàn)代償性的左心室肥厚，心肌纖維化，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭。糖尿病時(shí)，機(jī)體的高糖環(huán)境是糖尿病心肌病發(fā)生和發(fā)展的始動(dòng)因素［6］。臨床研究表明，持續(xù)的高血糖狀態(tài)可引起蛋白質(zhì)的 AGEs增多［7］，而 AGEs水平與糖尿病患者左室舒張功能呈正相關(guān)［8］。

AGEs是 Yamamoto等［9］首先提出來的，糖尿病的慢性持續(xù)高血糖狀態(tài)，可導(dǎo)致血液中葡萄糖醛基或酮基與體內(nèi)蛋白質(zhì)分子中賴氨酸或羥賴氨酸的ε－氨基進(jìn)行非酶糖基化反應(yīng)［10］。該反應(yīng)生成的AGEs是一種不可逆的大分子產(chǎn)物。AGEs主要通過兩個(gè)途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)：（1）通過對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等的直接修飾改變其結(jié)構(gòu)功能。（2）通過與特異受體結(jié)合導(dǎo)致機(jī)體的病理改變，而后者則在其所致的損傷中發(fā)揮更重要的作用［11］。有研究表明［12］，AGEs一旦在高糖環(huán)境下形成，此后再嚴(yán)格控制血糖，也無法阻止AGEs交聯(lián)過程的繼續(xù)進(jìn)行，所以抑制AGEs的生成對(duì)治療糖尿病并發(fā)癥有重要意義。我們證實(shí)靈芝多糖聯(lián)合二甲雙胍具備抑制血清中AGEs的含量和降低心肌組織中AGEs的表達(dá)，并且效果優(yōu)于單獨(dú)用藥組。

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）廣泛存在于人類多種組織器官，在生理狀況下，表達(dá)水平比較低。而在病理情況下，特別是在纖維化組織中表達(dá)上升。它通過促進(jìn)細(xì)胞增殖，直接誘導(dǎo)膠原生成，促進(jìn)細(xì)胞黏附等自身的生物學(xué)效應(yīng)參與纖維化的發(fā)生與發(fā)展［13－14］。CTGF的檢測(cè)可能是判斷心肌纖維化預(yù)后的一個(gè)有用指標(biāo)，其水平增加往往先于心肌纖維化的臨床癥狀，而對(duì)于確診心肌纖維化的患者來說，它又有預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的價(jià)值［15］。我們研究證實(shí)2型糖尿病心肌纖維化同時(shí)伴隨著CTGF蛋白表達(dá)的上調(diào)，表明CTGF與糖尿病心肌纖維化密切相關(guān)。聯(lián)合用藥治療12周后，大鼠心肌CTGF的表達(dá)明顯減少（P＜0.01），大鼠心肌纖維化明顯減輕。

Kakkar等［16］學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠的心臟脂質(zhì)過氧化程度明顯增加，Cai等［17］也在2型糖尿病患者的血液和心肌組織中發(fā)現(xiàn)有氧化應(yīng)激標(biāo)志物的存在。在高糖環(huán)境下，機(jī)體一方面清除氧自由基的酶（CAT、GSH-Px）活性降低，另一方面體內(nèi)的氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)，造成了體內(nèi)大量活性氧自由基的積聚，導(dǎo)致活性氧連鎖反應(yīng)，從而促進(jìn)糖尿病心腦血管以及其他一系列并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展［18］。本研究中，糖尿病組大鼠心肌CAT和GSH-Px活性明顯降低。聯(lián)合用藥組的CAT和GSH-Px活性明顯升高，效果優(yōu)于單獨(dú)用藥組，說明靈芝多糖和二甲雙胍聯(lián)合使用能更好的增強(qiáng)心肌抗氧化能力。

本實(shí)驗(yàn)提示，在2型糖尿病大鼠模型中，聯(lián)合應(yīng)用靈芝多糖和二甲雙胍在改善心肌纖維化方面明顯優(yōu)于單用，可能與調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激水平，降低血清AGEs的含量，減少糖尿病心肌纖維化過程中AGEs和CTGF的表達(dá)有關(guān)。在總的劑量不變的情況下聯(lián)合兩種藥物可以減少其中一種藥物的劑量。本研究中聯(lián)合用藥減少了二甲雙胍的劑量，同時(shí)也降低了二甲雙胍對(duì)降血糖可能帶來的副作用。一定劑量的靈芝多糖能對(duì)抗對(duì)大鼠機(jī)體氧化應(yīng)激水平，兩種藥物起到了互補(bǔ)的作用。聯(lián)合使用靈芝多糖和二甲雙胍可能會(huì)成為今后臨床治療糖尿病心血管疾病的一個(gè)新的方向。

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