劉燦仿，祁金龍，張海林，賈慶忠

QO-58化合物是河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)高通量篩選發(fā)現(xiàn)一個(gè)結(jié)構(gòu)全新的鉀通道開(kāi)放劑，對(duì)電壓依賴性M通道（KCNQ2／3通道）有良好開(kāi)放活性。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示QO-58開(kāi)放KCNQ213通道的 EC50為0.06μmol·L－1，優(yōu)于國(guó)外已上市的第一個(gè)抗癲癇KCNQ通道開(kāi)放劑retigabine（EC50，0.43μmol·L－1）［1－2］。初步藥理毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該化合物對(duì)小鼠戊四唑誘發(fā)的癲癇和電刺激引發(fā)的驚厥均有較好的治療作用，對(duì)緩激肽誘導(dǎo)的炎性疼痛也有效［3］，且未見(jiàn)明顯毒性。QO-58為吡唑并［1，5-a］嘧啶酮類化合物，由于其結(jié)構(gòu)新穎，生物活性高，我們已經(jīng)申請(qǐng)了中國(guó)及美國(guó)專利保護(hù)［4－5］，繼續(xù)研究有望獲得一種具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗癲癇、鎮(zhèn)痛一類新藥。為了弄清楚該化合物在體內(nèi)的吸收、分布規(guī)律，并指導(dǎo)進(jìn)一步的藥理毒理學(xué)研究中動(dòng)物給藥劑量及方式，同時(shí)作為新藥臨床前研究的一部分，我們建立RP-HPLC法，對(duì)QO-58在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和器材 島津LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)：包括 LC-20AT二元泵，CTO-20A柱溫箱，SPD-M20A檢測(cè)器，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，LC-solution色譜工作站。Eppendorf centrifuge 5417R型高速離心機(jī)。

1.1.2 主要試劑［6］QO-58結(jié)晶高純品由河北醫(yī)科大學(xué)新藥開(kāi)發(fā)研究室提供（批號(hào)：2010003），純度為99.5%；色譜純乙腈和甲醇由德國(guó)Merck（Honeywell）公司提供；聚氧乙烯蓖麻油為注射級(jí)（Cremophor ELP），由河北醫(yī)科大學(xué)藥廠提供；尼群地平標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品鑒定所提供（批號(hào)：100585-200602）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年的清潔級(jí)SD大鼠，共24只，♀♂各半，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：110305。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。

1.2 方法

1.2.1 灌胃用QO-58溶液 取QO-58原料藥適量，用適量溶劑（N，N-二甲基乙酰胺 ∶聚氧乙烯蓖麻油＝1∶9）溶解，得到備用溶液。

1.2.2 色譜條件［7］色譜柱：Shim-pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；乙腈 ∶0.2 mol·L－1乙酸銨 ＝43∶57等度洗脫；流速 1 ml·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μl。

1.2.3 給藥與血漿樣品采集 大鼠禁食12 h，取“1.2.1”所配 QO-58溶液按25、50、100 mg·kg－1劑量灌胃，分別于給藥后 0.5、1、2、4、6、9、12、18、24、36、48、72 h由眼眶靜脈叢取血0.5 ml，收集于肝素化的離心管內(nèi)，4 000 r·min－1離心 10 min，分離出血漿并于－20℃凍存待測(cè)。

為計(jì)算灌胃不同劑量的QO-58的絕對(duì)生物利用度，按15 mg·kg－1大鼠尾靜脈注射給予QO-58溶液，于給藥后 0.083、0.167、0.333、0.666、1、1.5、2、3、4、8、12、24 h由眼眶靜脈取血0.5 ml，處理過(guò)程同上。另取同批次大鼠6只，制備空白血漿。

1.2.4 血漿樣品處理 取大鼠血漿200μl，加入內(nèi)標(biāo)尼群地平的乙腈溶液（220 mg·L－1）30μl，加入乙腈 800μl，渦旋混勻，12 000 r·min－1離心 10 min，取上清液900μl，室溫氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00μl乙腈溶解，超聲處理5 min，12 000 r·min－1離心 10 min，取上清20μl進(jìn)樣分析。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 將所得血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)用藥動(dòng)學(xué)軟件DAS2.1.1版軟件處理進(jìn)行擬合，求算QO-58在大鼠體內(nèi)經(jīng)灌胃給藥和靜脈給藥后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 方法的專屬性 取大鼠空白血漿，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按照“1.2.4”項(xiàng)下方法處理并分析，獲得空白樣品的色譜圖（Fig 1A）；將規(guī)定濃度的QO-58標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入大鼠空白血漿，獲得模擬生物樣本色譜圖。QO-58的保留時(shí)間7.8 min，內(nèi)標(biāo)尼群地平保留時(shí)間為10.0 min（Fig 1B）；取大鼠灌胃給藥后的血漿樣品，同法操作，得色譜圖（Fig 1C），樣品峰和內(nèi)標(biāo)完全分離，且血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)及其他雜質(zhì)不影響樣品的分離及測(cè)定。

Fig 1 HPLC chromatograms of QO-58 in rat plasma

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 取空白血漿200μl，精密加入含計(jì)算量QO-58的等體積對(duì)照品貯備液，配制成質(zhì)量濃 度為0.1、0.5、2、5、10、20、40、160mg·L－1的樣品。按血漿樣品的處理項(xiàng)下方法依法操作，進(jìn)樣20μl，記錄色譜圖。以藥物的濃度為橫坐標(biāo)X，藥物和內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)Y，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Tab 1 Pharmacokinetic parameters of QO-58 in four groups（ˉx±s）

在0.1～160 mg·L－1范圍內(nèi)，QO-58血漿藥物濃度與QO-58和內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：Y＝0.0337X－0.0018，（r＝0.9989）。

2.3 最低定量限（LOQ） QO-58的檢測(cè)限、定量限分別在信噪比 S／N＝3和S／N＝10的標(biāo)準(zhǔn)下測(cè)定，該方法的定量限為0.1 mg·L－1，檢測(cè)限為0.025 mg·L－1。

2.4 精密度和準(zhǔn)確度 制備低、中、高（0.3、20、160 mg·L－1）3種濃度的 QO-58的質(zhì)控（QC）樣品，每個(gè)濃度平行測(cè)定5份，連續(xù)測(cè)定5 d。日內(nèi)精密度RSD（n＝5）分別為 6.89%、4.06%、6.01%；日間精密度 RSD（n＝5）分別為 17.06%、5.69%、11.34%，準(zhǔn)確度RE%均小于20%，符合藥動(dòng)學(xué)研究要求［8］。

2.5 提取回收率實(shí)驗(yàn) 按“1.2.4血漿樣品處理”項(xiàng)下方法配制QO-58在血漿中的低、中、高3個(gè)濃度的QC樣品，以提取后的色譜峰面積與未經(jīng)提取直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積之比，考察樣品的提取回收率。每一濃度進(jìn)行6樣本分析。3種濃度下提取平均回收率分別為89.56%、101.38%、99.42%，符合藥動(dòng)學(xué)研究要求。

2.6 穩(wěn)定性 按照前述血漿樣品處理方法制備低、中、高3種濃度的QO-58的QC血漿樣品各3份，測(cè)定濃度的平均值，分別考察在室溫放置2 h、4℃放置1周和－20℃放置18 d，及3次凍融循環(huán)處理后在室溫條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：低、中、高3個(gè)濃度血漿樣品濃度的RSD均小于9.38%，表明血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.7 QO-58在大鼠體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué) 大鼠分別按照 25、50、100 g·kg－1劑量灌胃和 15 mg·kg－1劑量尾靜脈注射給予QO-58后，不同時(shí)間點(diǎn)取血測(cè)量得到血藥濃度數(shù)據(jù)。血藥濃度－時(shí)間曲線圖見(jiàn)Fig 2、3。DAS2.1.1版軟件擬合QO-58在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)均符合二室模型，處理所得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)Tab 1。

Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of QO-58 after oral administration of 25 mg·kg－1，50 mg·kg－1 and 100 mg·kg－1 QO-58（n＝6）

Fig 3 Mean plasma concentration-time curves of QO-58 after intravenous administration of 15 mg·kg－1 QO-58（n＝6）

大鼠灌胃 25、50、100 mg·kg－1劑量 QO-58與相對(duì)靜脈注射15 mg·kg－1劑量QO-58的絕對(duì)生物利用度分別為24.84%、26.49%、18.20%。

3 討論

血漿樣品中QO-58的含量測(cè)定采用乙腈直接沉淀蛋白，操作簡(jiǎn)單、方便、回收率達(dá)到生物樣品分析要求。經(jīng)過(guò)流動(dòng)相配比及選擇后確定采用乙腈∶0.2 mol·L－1乙酸銨 ＝43∶57等度洗脫，不但可以獲得較短的保留時(shí)間，同時(shí)又可以與雜質(zhì)峰分離。QO-58經(jīng)紫外掃描，在285 nm處有最大吸收峰，且在此波長(zhǎng)處內(nèi)標(biāo)尼群地平也有很強(qiáng)吸收，所以選擇285 nm作為色譜檢測(cè)紫外測(cè)定波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定QO-58含量。該方法具有靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可作為QO-58血藥濃度檢測(cè)的常規(guī)手段。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥具有重要的指導(dǎo)意義，QO-58的消除半衰期較長(zhǎng)，特別是口服達(dá)到了8.24 h，Tmax大于4 h，提示該化合物吸收及代謝均較慢，因此可以適當(dāng)減少給藥次數(shù)?？诜o藥劑量由 50 mg·kg－1提高到 100 mg·kg－1體重后Cmax未見(jiàn)明顯增大，且AUC0－t僅僅增大約37%左右，提示在50 mg·kg－1以后單純靠提高給藥劑量可能藥效學(xué)效果不佳?？诜汀⒅?、高3個(gè)劑量QO-58的生物利用度均相對(duì)較低，推測(cè)可能與QO-58在水中溶解度極低有關(guān)?？傊?，藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果表明，該化合物起效較慢，藥效持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，在進(jìn)一步的臨床研究過(guò)程中我們需要通過(guò)化合物成鹽或者通過(guò)制劑等手段來(lái)改善其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Qi J，Zhang F，Mi Y，F(xiàn)u Y，et al.Synthesis and biological activity of pyrazolo［1，5-a］pyrimidin-7（4H）-ones as novel Kv7／KCNQ potassium channel activators［J］.Eur J Med Chem，2011，46（3）：934－43.

［2］ Jia C，Qi JL，Zhang F，et al.Activation of KCNQ2／3 potassium channels by novel Pyrazolo［1，5-a］pyrimidin-7（4H）-OneDerivatives［J］.Pharmacology，2011，87（5－6）：297－310.

［3］ Zhang F，Mi Y，Qi JL，et al.Modulation of Kv7 potassiumchannels by a novel opener pyrazolo［1，5－a］pyrimidin-7（4H）-one compound QO-58［J］.British J Pharmacol，2013，168：1030－42.

［4］ 張海林，祁金龍，張嫡群，等.吡唑并［1，5－a］嘧啶酮衍生物及其藥物組合物以及其用途［P］.ZL：200910074653.3，2013－01－16.

［4］ Zhang H L，Qi JL，Zhang D Q，et al.Pyrazolo［1，5－a］Pyrimidones Derivatives and Pharmaceutical Compositions and Uses Thereof［P］.ZL：200910074653.3，2013－01－16.

［5］ Zhang H L，Qi JL，Zhang DQ，et al.Pyrazolo［1，5－a］Pyrimidones Derivatives and Pharmaceutical Compositions and Uses Thereof US［P］.PubNo：2012／0088775 A1

［6］ 劉燦仿，祁金龍，張海林，賈慶忠.新型鉀通道開(kāi)放劑（QO-58）在大鼠體內(nèi)組織分布研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（1）：66－9.

［6］ Liu C F，Qi JL，Zhang H L，Jia Q Z.Study of tissue distribution on a new potassium channel opener（QO-58）in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（1）：66－9.

［7］ Singh A K，Chaurasiya A，Jain GK，et al.High performance liquid chromatography method for the pharmacokinetic study of bicalutamide SMEDDSand suspension formulations after oral administration to rats［J］.Talanta，2009，78（4-5）：1310－4.

［8］ 楊秀偉，桂方晉，田建明.人參皂苷-Rg2在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（7）：967－70.

［8］ Yang X W，Gui F J，Tian JM，et al.Pharmacokinetics of ginsenoside Rg2 in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（7）：967－70.