戴國(guó)梁，劉史佳，李長(zhǎng)印，吳 磊，馬世堂，居文政，談恒山

燈盞細(xì)辛注射液（DI）為燈盞細(xì)辛的干燥全草經(jīng)提取制成的中藥注射液，收載于2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部［1］，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛的功效，是目前臨床上使用較為廣泛的治療心腦血管疾病的傳統(tǒng)中藥之一。

以往研究表明燈盞細(xì)辛的有效成分主要為黃酮類(lèi)成分——燈盞乙素。通過(guò)深入研究，發(fā)現(xiàn)酚酸類(lèi)成分也具有擴(kuò)張血管和抑制血栓形成的藥理活性［2］。中藥酚酸類(lèi)成分（如咖啡酸），因其明顯的抗炎、抗氧化、抗凝血等多種生物活性而被國(guó)內(nèi)外廣泛研究［3－6］。

臨床上，阿司匹林常與DI等中藥制劑合用于治療心腦血管疾病，并取得了良好的療效［7］。

DI中咖啡酸成分檢測(cè)及藥動(dòng)學(xué)研究較少，阿司匹林對(duì)DI藥動(dòng)學(xué)的影響未見(jiàn)研究報(bào)道。本文以DI中咖啡酸為指標(biāo)，初步研究阿司匹林對(duì)大鼠體內(nèi)咖啡酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響。

1 材料

1.1 試藥 燈盞細(xì)辛注射液（云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20120740，規(guī)格：10 ml／支）；阿司匹林腸溶片（沈陽(yáng)奧吉娜藥業(yè)有限公司，批號(hào)：120502，規(guī)格：100 mg／片）；對(duì)照品咖啡酸（批號(hào)：110885－200102）和替硝唑（批號(hào)：100336－200402）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀；API 4 000 LC-MS／MS三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧化離子源（ESI），色譜工作站：Analyst 1.4.2；AE240電子天平（上海梅特勒－托利多有限公司）；MICRO-17R冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；WH-2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；Drict-Q5超純水機(jī)（法國(guó)Millipore公司）。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠，♂♀各半，12只，體質(zhì)量250～270 g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（浙）2008－0033。

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜檢測(cè)條件 Agilent ZOBAX SB C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.2 mmol·L－1醋酸銨水溶液（65∶35）；流速：400 μl·min－1；柱溫：30℃。離子源：ESI；離子化模式：負(fù)離子；定量模式：多反應(yīng)檢測(cè)模式（MRM）；離子源電壓：4 000 V；離子源溫度：400℃；咖啡酸的 DP、EP、CE及CXP值分別為－50 V、－10 V、－25 V、－5 V；替硝唑的DP、EP、CE及CXP值分別為－25 V、－10 V、－15 V、－8 V；檢測(cè)對(duì)象：咖啡酸 m／z 178.9→m／z 135.0；替硝唑 m／z 246.0→m／z 125.8。

2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取適量咖啡酸對(duì)照品，用甲醇配制成濃度為1.28 mg·L－1的儲(chǔ)備液；精密吸取適量，用甲醇分別稀釋成25、125、250、500、1 000、2 000、3 000μg·L－1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以上溶液于4℃保存，備用。

2.3 內(nèi)標(biāo)物溶液的配制 精密稱取適量替硝唑?qū)φ掌?，用甲醇溶解并稀釋?.2 mg·L－1，于4℃保存，備用。

2.4 血漿樣品處理 取血漿樣品50μl，加入1.2 mg·L－1替硝唑溶液（內(nèi)標(biāo)）10μl，1 mol·L－1鹽酸溶液50μl，渦旋30 s，再加入乙酸乙酯800μl，渦旋振搖 3 min，12 000 r·min－1離心 5 min。取上清液750μl，40℃氮?dú)饬鞔蹈?，?00μl 50%甲醇復(fù)溶，12 000 r·min－1離心 5 min，取上清液 5μl進(jìn)樣分析。若血樣中的待測(cè)藥物濃度超出了標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度上限，用空白血漿稀釋該血樣，混勻后，取50μl按上述步驟進(jìn)行血樣前處理。

2.5 給藥劑量的確定 DI靜脈注射臨床給藥劑量為20～40 ml·d－1，每天 1～2次，人的平均體重按60 kg計(jì)算，則其臨床給藥劑量為0.33～1.33 ml·kg－1。按大鼠每千克體重的臨床等效量是人的6倍計(jì)算，則DI大鼠尾靜脈注射給藥劑量為1.98～7.98 ml·kg－1，確定大鼠給藥劑量為 4 ml·kg－1。經(jīng)測(cè)定，咖啡酸濃度為271.1 mg·L－1。阿司匹林的給藥量成人每日100 mg，則阿司匹林臨床給藥劑為（5／3）mg·kg－1。因此大鼠給藥劑量為 10 mg·kg－1。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究 大鼠12只，♀♂各半，隨機(jī)分為2組，即實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只，給藥前禁食不禁水12 h。實(shí)驗(yàn)組先尾靜脈注射DI，之后立即灌胃給予阿司匹林；對(duì)照組只尾靜脈注射DI。2組大鼠分別于給藥前及給藥后 5、10、20、30、45 min、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12和24 h經(jīng)眼眶后靜脈叢取血約 0.3 ml，置于肝素化試管中，以 4 000 r·min－1離心10 min，取上層血漿于－40℃保存待測(cè)。

2.7 數(shù)據(jù)處理 大鼠靜脈給藥后測(cè)得的血藥濃度（C）－時(shí)間（T）數(shù)據(jù)應(yīng)用DAS 1.0軟件進(jìn)行處理。選擇適宜的數(shù)學(xué)模型擬合，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 本色譜條件下，咖啡酸和替硝唑的保留時(shí)間約為2.72 min和4.01 min（Fig 1）。咖啡酸和內(nèi)標(biāo)互不干擾，峰形良好，無(wú)雜峰干擾，基線平穩(wěn)。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取空白血漿50μl，分別加入咖啡酸對(duì)照品系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各10μl，配制成相當(dāng)于咖啡酸血漿質(zhì)量濃度分別為 5、25、50、100、200、400、600μg·L－1的血漿樣品。按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，取5μl進(jìn)樣分析。以各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y對(duì)血漿質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，求得的回歸方程即為標(biāo)準(zhǔn)曲線?？Х人峄貧w方程：Y＝1.2386X－0.9121（r＝0.9986），定量下限為5μg·L－1。

3.3 準(zhǔn)確度和精密度 取空白血漿50μl，按上述“血漿樣品處理”項(xiàng)下制備綠原酸和咖啡酸低、中、高3個(gè)濃度（咖啡酸血漿質(zhì)量濃度為25、100、400 μg·L－1）的質(zhì)量控制（QC）樣品，每個(gè)濃度平行做5份，連續(xù)測(cè)定3 d。根據(jù)隨性標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測(cè)濃度。實(shí)測(cè)濃度的RSD即為精密度，加入濃度和實(shí)測(cè)濃度的比值即為準(zhǔn)確度。結(jié)果表明：咖啡酸日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別為94.7%～103.1%（RSD≤7.6%，n＝5）和95.5%～102.7%（RSD≤8.4%，n＝15），實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合生物樣品分析方法的要求。

3.4 提取回收率 取空白血漿50μl，配制“準(zhǔn)確度和精密度”項(xiàng)下低、中、高3個(gè)不同濃度含藥血漿質(zhì)控樣品，按上述“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作后進(jìn)樣分析，以血漿中咖啡酸的峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液中咖啡酸峰面積的比值計(jì)算出上述3種質(zhì)量濃度的提取回收率，每個(gè)濃度平行做5份。經(jīng)LCMS／MS測(cè)定后，低、中、高3種濃度下的提取回收率分別為咖啡酸：84.2%±2.1%、85.7% ±5.8%和90.1%±5.3%。采用同樣的方法考察了內(nèi)標(biāo)的提取回收率為91.3%±3.1%。

3.5 穩(wěn)定性考察 取空白血漿50μl，配制“準(zhǔn)確度和精密度”項(xiàng)下低、中、高3個(gè)不同濃度含藥血漿質(zhì)控樣品，按上述“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作方法處理樣品。考察含藥血漿樣品處理好后溶液中分析物在室溫放置24 h、含藥血漿樣品－20℃反復(fù)凍融3次、含藥血漿樣品－40℃長(zhǎng)期冷凍28 d的穩(wěn)定性，每個(gè)濃度平行3份。結(jié)果表明，經(jīng)處理后的血漿樣品室溫放置24 h后咖啡酸血藥濃度的RSD均小于9.23%，－40℃保存28 d血藥濃度的RSD均小于8.44%，經(jīng)過(guò)3個(gè)凍融周期后兩個(gè)分析物的血藥濃度RSD均小于8.97%。

3.6 介質(zhì)效應(yīng)考察 取離心管數(shù)只，分別精密加入低、中、高的3個(gè)濃度咖啡酸對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液（125、500、2 000μg·L－1）各10μl，再分別加入內(nèi)標(biāo)替硝唑溶液 10μl，水 80μl，旋搖 1 min，于 12 000 r·min－1離心 5 min，進(jìn)行 LC-MS-MS分析，進(jìn)樣量 5 μl，記錄峰面積A1。另按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作提取空白血漿數(shù)管，揮干后同上操作，記錄峰面積A2。A1和A2的比值（A2／A1×100%）即為介質(zhì)效應(yīng)ME（%）。咖啡酸血漿樣品低、中、高3種濃度LC-MS-MS介質(zhì)效應(yīng)（n＝3）分別為 89.63%、101.26%、92.19%，內(nèi)標(biāo)替硝唑介質(zhì)效應(yīng)（n＝9）為84.62%。

Fig 1 Representative MRM of chromatograms of caffeic acid and IS in rat plasma samples

3.7 大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué) 給大鼠單獨(dú)靜注DI 4 ml·kg－1和聯(lián)合灌胃阿司匹林 10 ml·kg－1后的濃度－時(shí)間曲線見(jiàn)Fig 2。用DAS 1.0軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)Tab 1。由分析結(jié)果可知，DI聯(lián)合阿司匹林使用前后，咖啡酸的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程均為二室開(kāi)放模型。聯(lián)合阿司匹林使用后，咖啡酸的消除半衰期明顯增大；血藥濃度－時(shí)間曲線下面積AUC（0－t）和表觀分布容積Vd有所增大；清除率CL有所減小。

4 討論

大鼠實(shí)驗(yàn)限制了血漿樣本的取樣量，因此，在取樣量為50μl的條件下，本文對(duì)血樣中酚酸類(lèi)成分的提取方法進(jìn)行了考察：甲醇沉淀、乙腈沉淀、乙酸乙酯提取、乙酸乙酯／乙醚提取，每個(gè)提取或沉淀?xiàng)l件考察了不同的酸化條件（加不同量的1 mol·L－1鹽酸：10、20、30、50、100μl），發(fā)現(xiàn) 50μl 1 mol·L－1鹽酸酸化乙酸乙酯提取時(shí)，咖啡酸的介質(zhì)效應(yīng)最小，同時(shí)提取回收率也較高。

Tab 1 Main pharmacokinetic parameters of caffeic acid in rats of control group and experimental group（ˉx±s，n＝6）

Fig 2 Mean concentration-time profiles of caffeic acid in rats of DI group and combination group

在DI中，已證實(shí)黃酮類(lèi)與酚酸類(lèi)協(xié)同發(fā)揮藥效作用［8－9］，而燈盞乙素在體內(nèi)代謝過(guò)程已有較多文獻(xiàn)報(bào)道［10－12］，對(duì)酚酸類(lèi)成分的體內(nèi)代謝過(guò)程研究卻比較少。因此，深入研究酚酸類(lèi)成分對(duì)明確DI的藥動(dòng)藥效至關(guān)重要。而咖啡酸是DI中較小的酚酸類(lèi)化合物，可與奎寧酸組成注射液中其他酚酸類(lèi)成分。所以，明確咖啡酸在體內(nèi)的代謝過(guò)程對(duì)研究DI中其他酚酸類(lèi)的藥動(dòng)學(xué)有一定的借鑒作用。在本實(shí)驗(yàn)中初步研究了阿司匹林對(duì)咖啡酸在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特性的影響。無(wú)論單獨(dú)給予注射液，還是與阿司匹林合用，咖啡酸的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程均為二室開(kāi)放模型。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組咖啡酸的β明顯增大和CL有所減??；而 AUC（0－t）與 Vd有所增大，說(shuō)明阿司匹林可減慢咖啡酸在體內(nèi)的代謝過(guò)程，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 國(guó)家藥典委員會(huì).《中國(guó)藥典》Ⅰ部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：707.

［1］ State Pharmacopoeia Commission.Chinese Pharmacopoeia 2010（Volume 1）［S］.Beijing：Chinese Medical Science and Technology Press，2010：707.

［2］ 孫漢董，趙勤實(shí).防治心腦血管疾病藥物——燈盞細(xì)辛酚的研究與開(kāi)發(fā)［J］.化學(xué)進(jìn)展，2009，21（1）：77－83.

［2］ Sun H D，Zhao Q S.A drug for treating cardio－cerebrovascular diseases－－phenolic compds of Erigeron breviscapus［J］.Prog Chem，2009，21（1）：77－83.

［3］ Park W H，Kim SH，Kim C H.A new matrix metalloproteinase-9 inhibitor 3，4-dihydroxycinnamic acid（caffeic acid）from methanol extract of Euonymus alatus：isolation and structure determination［J］.Toxicology，2005，207（3）：383－90.

［4］ Jang D S，Yoo N H，Kim N H，et al.3，5-Di-O-caffeoyl-epi-quinic acid from the leaves and stems of Erigeron annuus inhibits protein glycation，aldose reductase，and cataractogenesis［J］.Biol Pharm Bull，2010，33（2）：329－33.

［5］ 張鞍靈，馬 瓊，高錦明，等.綠原酸及其類(lèi)似物與生物活性［J］.中草藥，2001，32（2）：173－6.

［5］ Zhang A L，Ma Q，Gao J M，et al.Studies on bioactivities of chlorogenic acid and its analogues［J］.Chin Tradit Herbal Drugs，2001，32（2）：173－6.

［6］ 黃 硯，楊俊卿，謝靈瑤.咖啡酸對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元鋁鹽損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25（12）：1605－9.

［6］ Huang Y，Yang JQ，Xie L Y.Protective effect of caffeic acid on damage induced by aluminum－overload in primary cultured rat hippocampal neuron［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（12）：1605－9.

［7］ 李 明，趙高峰.燈盞細(xì)辛注射液聯(lián)合拜阿司匹林治療急性腦梗死50例療效觀察［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2010，19（8）：1314－5.

［7］ Li M，Zhao G F.50 acute cerebral infarction cases treated by Dengzhanxixin Injection combined with Bayaspirin［J］.J Emerg Traditl Chin Med，2010，19（8）：1314－5.

［8］ Wang Y F，Hu L M，Liu Y N，et al.A rapid method for qualitative and quantitative analysis of major constituentsin dengzhanxixin injection by LC-DAD-ESI-MSn［J］.Chromatographia，2010，71（9-10）：845－53.

［9］ Hung T M，Na M，Thuong PT，et al.Antioxidant activity of caffeoyl quinic acid derivatives from the roots of Dipsacus asper Wall［J］.J Ethnopharmacol，2006，108（2）：188－92.

［10］黃 勇，何 峰，鄭 林，等.UPLC-MS／MS同時(shí)測(cè)定Beagle犬血漿中原兒茶酸、異葒草素和野黃芩苷［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（5）：716－9

［10］Huang Y，He F，Zheng L，et al.Simultaneous determination of protocatechuic acid，isoorientin and scutellarin in Beagle dog plasma by UPLC-MS／MS［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（5）：716－9.

［11］蔣學(xué)華，李素華，蘭 軻，等.燈盞花素在家犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38（5）：371－3.

［11］Jiang X H，Li SH，Lan K，et al.Study on the pharmacokinetics of scutellarin in dogs［J］.Acta Pharm Sin，2003，38（5）：371－3.

［12］高慧敏，王智民，田 娟.燈盞花素在正常和模型大鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)及代謝物研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（11）：1024－7.

［12］Gao H M，Wang Z M，Tian J.Pharmacokinetics and metabolites of scutellarin in normal and model rats［J］.Acta Pharm Sin，2005，40（11）：1024－7.