曾軍英，胡 興，伍賢進(jìn)，李勝華，皮建輝

腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）被認(rèn)為是存在于腫瘤細(xì)胞系或腫瘤組織中的具有自我更新、多向分化潛能、高耐藥性及高致瘤性等特點(diǎn)的一群細(xì)胞，約占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的0.01%～2.00%，在腫瘤形成、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著關(guān)鍵性的作用［1］。1997年 Bonnet等［2］首次從急性髓系白血病 （acute myeloid leukemia，AML）患者中分離獲得CSC。研究人員隨后相繼在一些實(shí)體瘤，如肺癌、乳腺癌、黑素瘤、前列腺癌、結(jié)直腸癌、腦腫瘤、頭頸部鱗癌、卵巢癌及子宮內(nèi)膜癌等癌組織中分離獲得了 CSC［3－5］。2007年 Li等［6］從xenograft模型中分選出CSC，但是從胰腺癌細(xì)胞株中分離獲得CSC的相關(guān)報(bào)道目前尚較少。因此，本研究嘗試分離和培養(yǎng)胰腺癌干細(xì)胞，并鑒定其生物學(xué)特性，以期為將來(lái)進(jìn)行胰腺癌靶向干預(yù)治療及新藥篩選提供研究模型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 MEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和干細(xì)胞培養(yǎng)添加劑B27均購(gòu)自Gibco公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生長(zhǎng)因子 （epidermal growth factor，EGF）購(gòu)自 Pepro-Tech Inc；胰島素、L-谷氨酰胺購(gòu)自 Sigma公司；胰蛋白酶購(gòu)自Amresco公司；低黏附培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司；FITC-anti CD24、FITC-anti CD44和 FITC-anti ESA購(gòu)自 eBioscience公司；兔抗 c-Met、RON、CD24、CD44、ESA單克隆抗體購(gòu)自Abcam或Cell Signaling公司；IVISSpectrum小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)（美國(guó)，Life Sciences公司）；Eclipse TE200熒光倒置顯微鏡（日本，Nikon）。

1.2 磁性細(xì)胞分選技術(shù)純化 CD24＋CD44＋ESA＋細(xì)胞L3.6pl細(xì)胞用EDTA消化液（含2.5 mmol·L－1乙二胺四乙酸鈉及1% 胎牛血清的PBS，pH 7.4），在4℃培育30 min；收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×1010·L－1，加入兔抗人CD24（每106個(gè)細(xì)胞加1μg抗體），4℃培育30 min；用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液離心洗滌1次，加入羊抗兔IgG免疫磁珠（德國(guó)MACS公司產(chǎn)品，每105個(gè)細(xì)胞加1μl磁珠），4℃培育30 min；用含1%胎牛血清的MEM-F12培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品）離心洗滌1次；按照德國(guó)MACS公司提供的操作指南，用MiniMACS分離柱分選并分別收集CD24＋陽(yáng)性細(xì)胞。再依次重復(fù)以上操作，獲得CD44＋ESA＋陽(yáng)性細(xì)胞。通過(guò)3次磁性細(xì)胞分選，最終獲得CD24＋CD44＋ESA＋3陽(yáng)性細(xì)胞。

1.3 CD24＋CD44＋ESA＋細(xì)胞的體外培養(yǎng) 收集磁性細(xì)胞分選的CD24＋CD44＋ESA＋3陽(yáng)性細(xì)胞，用無(wú)血清、含生長(zhǎng)因子EGF和bFGF的MEM-F12培養(yǎng)基重懸、培養(yǎng)，收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以1×105·L－1接種于低黏附96孔細(xì)胞板內(nèi)的無(wú)血清MEM-F12培養(yǎng)基，以獲得CSC CD24＋CD44＋ESA＋干細(xì)胞球單克隆。

1.4 免疫熒光 收集二代細(xì)胞球，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，制備細(xì)胞涂片，固定后加入一抗（抗人CD24、抗人CD44、抗人ESA，均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，濃度為1∶100）溫育1 h，PBS沖洗，加入熒光標(biāo)記的二抗（濃度為1∶50），沖洗、封片，熒光顯微鏡觀察。根據(jù)熒光顯示的亮度，測(cè)定其灰度值，代表蛋白的相對(duì)表達(dá)量，檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)志物。

1.5 CD24＋CD44＋ESA＋細(xì)胞體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn) 收集二代懸浮細(xì)胞球，用0.25%胰蛋白酶消化獲得單個(gè)細(xì)胞懸液，PBS洗滌 細(xì)胞2次。取8周齡NOD／SCID♀小鼠24只，飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境。分為3組，每組8只，分別接種102、103、104數(shù)量級(jí)的細(xì)胞于小鼠左側(cè)腹部皮下，每周用IVIS Spectrum小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)（美國(guó)，Life Sciences公司）觀察成瘤情況及腫瘤大小，12周后處死小鼠。移植瘤取出后切片，進(jìn)行免疫組化染色。

1.6 免疫組化 采用二步法免疫組化染色（EnVision System），c-Met與RON（美國(guó)Santa Cruz公司）一抗的工作濃度均為1∶100。常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復(fù)，一抗和二抗分別溫育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)脂封片觀察。用非免疫血清代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.7 耐藥實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞球用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，1×104個(gè)細(xì)胞 ／孔接種96孔板，每組細(xì)胞設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng) 24 h后分別加入終濃度均為0.01、0.1、1、10、100、1 000 nmol·L－1的紫杉醇和吉西他濱，對(duì)照組不加任何藥物；培養(yǎng)至d 3時(shí)，加入20μl MTT（5 g·L－1）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，800×g離心20 min，小心吸去上液，加入150μl DMSO振蕩20 min，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)各孔吸光度OD值，按照公式計(jì)算各組細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率／% ＝（OD對(duì)照組－OD實(shí)驗(yàn)組）／OD對(duì)照組×100% 。

1.8 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用1%NP40冰上裂解細(xì)胞球30 min，4℃條件下6 500×g離心30 min提取細(xì)胞總蛋白，BCA試劑進(jìn)行蛋白定量。取各組細(xì)胞總蛋白20μg上樣，行8%SDS-PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯 （polyvinylidene difluoride，PVDF）膜上。5%脫脂奶封閉2 h后，分別加入一抗 Bmi-1、E-cadherin、Vimentin、β-actin（1∶1 000稀釋），室溫反應(yīng)2 h，TBST洗滌后加入相應(yīng)二抗再反應(yīng)1 h，膜經(jīng)TBST洗滌后與電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑反應(yīng)，X線膠片壓片曝光，顯示結(jié)果。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，組間差異比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 L3.6pl細(xì)胞在無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基中的成球生長(zhǎng)L3.6pl細(xì)胞在用無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基和普通培養(yǎng)皿培養(yǎng)時(shí)，仍貼壁生長(zhǎng)，即使添加成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子也不能形成細(xì)胞球。當(dāng)使用經(jīng)Poly-Hema包被過(guò)的培養(yǎng)皿或低黏附板和無(wú)血清干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時(shí)，有一定比例的細(xì)胞球形成。經(jīng)對(duì)成球培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，L3.6pl細(xì)胞在d 3出現(xiàn)折光性強(qiáng)的較小細(xì)胞球，至d 10長(zhǎng)成較大的細(xì)胞球，細(xì)胞球經(jīng)機(jī)械打散后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代細(xì)胞仍能懸浮球狀生長(zhǎng)。在30、60 d具有更強(qiáng)的成球能力（Fig 1）。

Fig 1 Tumor spheres derived from isolated L3.6pl cancer cells cultured in tumor sphere medium

2.2 干細(xì)胞表面標(biāo)志檢測(cè) CD24＋CD44＋ESA＋腫瘤細(xì)胞球形成干細(xì)胞的特征性標(biāo)志分子。磁性細(xì)胞分選技術(shù)純化CD24＋CD44＋ESA＋細(xì)胞，收集磁性細(xì)胞分選的CD24＋CD44＋ESA＋3陽(yáng)性細(xì)胞，用無(wú)血清、含生長(zhǎng)因子B27、EGF、bFGF的MEM-F12培養(yǎng)基重懸、培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，與L3.6pl細(xì)胞相比，這些來(lái)源于懸浮細(xì)胞球的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞黏附分子CD24＋、CD44＋和上皮特異性抗原（epithelial specific antigen，ESA）明顯增強(qiáng)（如 Fig 2所示，CD24＋、CD44＋和ESA＋分別是P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05），表明磁性細(xì)胞分選技術(shù)純化得到高純度的CD24＋CD44＋ESA＋細(xì)胞。

2.3 腫瘤干細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路因子的表達(dá) “自我更新”與上皮細(xì)胞間質(zhì)化轉(zhuǎn)變（epithelial mesenchymal transformation，EMT）是腫瘤干細(xì)胞的兩個(gè)重要特性。Western blot檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞球中 Bmi-1、E-Cadherin和 Vimentin的表達(dá)（Fig 3）。結(jié)果表明，與L3.6pl細(xì)胞相比，CSC細(xì)胞的Bmi-1的表達(dá)在成球30 d的時(shí)候表達(dá)最強(qiáng)，分別是L3.6pl對(duì)照的12.4倍和成球15 d的1.8倍（P＜0.05）；Vimentin的表達(dá)分別是L3.6pl對(duì)照的18.2倍和成球15 d的2.1倍（P＜0.05）；與此相反，CSC細(xì)胞E-Cadherin的表達(dá)則下調(diào)了6.3倍和24.5倍（P＜0.05）。研究結(jié)果提示，分離得到的CSC細(xì)胞具有“自我更新”與EMT兩個(gè)重要的干細(xì)胞特性。

2.4 腫瘤干細(xì)胞球的致瘤性分析 將CD24＋CD44＋ESA＋細(xì)胞接種于NOD／SCID小鼠右側(cè)腹部，CD24－CD44－ESA－細(xì)胞接種于小鼠左側(cè)腹部皮下，觀察小鼠成瘤率。102組：CD24－CD44－ESA－細(xì)胞均未成瘤（0／8），CD24＋CD44＋ESA＋細(xì)胞有4例成瘤（4／8）；103組：CD24－CD44－ESA－細(xì)胞均未成瘤（0／8），CD24＋CD44＋ESA＋細(xì)胞均成瘤（8／8）（P＜0.05）；104組：CD24－CD44－ESA－細(xì)胞有3例成瘤（3／8），CD24＋CD44＋ESA＋細(xì)胞均成瘤（8／8）。移植瘤取出后切片，進(jìn)行HE染色及c-Met、RON免疫組化染色。免疫結(jié)果顯示（Fig 4），與L3.6pl組相比，CSC組中RON的表達(dá)成強(qiáng)陽(yáng)性，c-Met的表達(dá)成中度陽(yáng)性，提示CSC細(xì)胞具有很強(qiáng)的致瘤性，具有很強(qiáng)的侵襲、遷移和惡化的能力。

Fig 2 Molecular markers expressed in CSC spheres analyzed by fluorescence microscope

Fig 3 Expression levels of EMT and self-renewal indicated proteins in the spheriod cells examined by immunoblotting

2.5 干細(xì)胞球細(xì)胞分化潛能檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞球細(xì)胞置于含10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)0、3、6、12 h，使其貼壁生長(zhǎng)并分化。Western blot檢測(cè)CSC球細(xì)胞分化前后“自我更新”EMT表達(dá)變化。結(jié)果顯示，Bmi-1和Vimentin在分化后表達(dá)水平降低，而E-cadherin在分化后表達(dá)水平升高（Fig 5），表明細(xì)胞球細(xì)胞具有分化潛能。

Fig 4 Tumorigenic assay of tumor sphere forming cells

Fig 5 CSC differentiation in epithelial culture conditions

2.6 干細(xì)胞球耐藥性 能夠耐受化療藥物的殺傷作用是癌的惡性特征之一，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其基礎(chǔ)是癌細(xì)胞群中包含癌干細(xì)胞，提示癌干細(xì)胞可有較強(qiáng)耐藥特性。吉西他濱和紫杉醇是治療胰腺癌的臨床藥物。CSC細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)吉西他濱和紫杉醇具有一定的耐藥性（Fig 6）。L3.6pl對(duì)吉西他濱的IC50為2.7 nmol·L－1，而 CSC對(duì)吉西他濱的 IC50為54.8 nmol·L－1，增加了 20.3倍（P＜0.01）；L3.6pl對(duì)紫杉醇的IC50為 12.1 nmol·L－1，而 CSC對(duì)紫杉醇的 IC50為 192.2 nmol·L－1，增加了 15.9倍（P＜0.01），提示 CSC對(duì)吉西他濱和紫杉醇均具有明顯的耐藥性（Tab 1）。

3 討論

傳統(tǒng)放化療針對(duì)的是多數(shù)無(wú)或低分化潛能的腫瘤細(xì)胞，無(wú)法根除其中的CSC，而這些殘留的CSC是惡性腫瘤復(fù)發(fā)、放化療抵抗、侵襲轉(zhuǎn)移的根源［7］。自我更新能力、表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志、耐藥基因表達(dá)和免疫缺陷鼠體內(nèi)成瘤等是腫瘤干細(xì)胞的“干性”標(biāo)志［8］。分離胰腺癌干細(xì)胞的方法主要有兩種：（1）特異的細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分選［6］，如CD44＋CD24＋ESA＋、CD133＋、ALDH1、c-Met等；②特有的細(xì)胞功能結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分選［9］，如SP（sidepopulation）細(xì)胞以及DiI＋／SCC細(xì)胞。Li等［6］于2007年首次從手術(shù)標(biāo)本分離到了 CD44＋CD24＋ESA＋胰腺癌干細(xì)胞。Hermann等［10］研究采用磁珠分選系統(tǒng)，分別從胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞株L3.6pl中分離出了約1.8%CD133＋細(xì)胞；將500個(gè)該類細(xì)胞注入到NOD／SCID小鼠皮下，3周就能從小鼠皮下分離到肉眼可見(jiàn)的腫瘤，且該移植瘤與初始胰腺癌的組織學(xué)特性相同。本研究采用無(wú)血清與低黏附細(xì)胞培養(yǎng)板誘導(dǎo)胰腺癌L3.6pl細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞球，采用磁性細(xì)胞分選技術(shù)純化胰腺癌L3.6pl細(xì)胞株中的CD24＋CD44＋ESA細(xì)胞，并將其植入非肥胖糖尿?。匕Y聯(lián)合免疫缺陷NOD／SCID小鼠皮下具有很強(qiáng)的致瘤性，表明分離得到的細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的特性。本研究結(jié)合了目前分離胰腺癌干細(xì)胞的兩種方法，方法簡(jiǎn)單實(shí)用，是一種有益的方法學(xué)補(bǔ)充。

Tab 1 Compared with L36pl group，CSCs were significantly increased drug resistance to gemcitabine and paclitaxel，respectively

Fig 6 Result of drug sensitivity of pancreatic cancer cell lines L36pl and CSC

上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上向成纖維細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變并獲得遷移能力的過(guò)程，它是上皮來(lái)源腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制。發(fā)生播散的腫瘤細(xì)胞需要經(jīng)EMT離開(kāi)原發(fā)部位，同時(shí)這些細(xì)胞還必須有自我更新及重新分化形成新腫瘤細(xì)胞的能力，因此CSC與EMT有密切聯(lián)系［11］。Dembinski等［11］發(fā)現(xiàn)源于細(xì)胞株 BxPC-3、Panc03.27的 DiI＋／SCC高表達(dá)Twist、Vimentin和N-Cadherin等EMT相關(guān)分子，提示 EMT主要發(fā)生在 DiI＋／SCC中，說(shuō)明具有CSC特性的DiI＋／SCC更易出現(xiàn)EMT而發(fā)生轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果表明，分離得到的胰腺癌干細(xì)胞球CD24＋CD44＋ESA＋具有EMT現(xiàn)象，主要的EMT標(biāo)志分子Vimentin明顯表達(dá)上調(diào)，而E-Cadherin則明顯表達(dá)下調(diào)。并且，此過(guò)程可隨著干細(xì)胞的分化而逆轉(zhuǎn)。

Sonic Hedgehog及BMI-1等信號(hào)通路在胰腺癌干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮著重要的作用。原癌基因BMI-1是轉(zhuǎn)錄抑制因子基因Polycomb家族成員，它通過(guò)調(diào)節(jié)端粒酶的活性控制細(xì)胞的增殖和凋亡。Lee等［12］首次發(fā)現(xiàn)BMI-1 mRNA在胰腺癌中高表達(dá)，尤其高表達(dá)于CD44＋CD24＋ESA＋，與正常胰腺上皮之間有明顯差異，提示BMI-1可能與胰腺CSC自我更新相關(guān)。本研究表明，與L3.6pl細(xì)胞相比，CSC球細(xì)胞的BMI-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并且此過(guò)程可隨著干細(xì)胞的分化而逆轉(zhuǎn)。

越來(lái)越多的研究顯示胰腺癌干細(xì)胞介導(dǎo)了其對(duì)放化療的抵抗。Hermann等［10］在利用吉西他濱干預(yù)CD133＋CSC、CD133－細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)CD133＋CSC對(duì)吉西他濱明顯耐藥，干預(yù)5 d后其比例反而升高，達(dá)細(xì)胞總數(shù)的50%。Wang等［13］用含吉西他濱的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞株P(guān)anc-1時(shí)發(fā)現(xiàn)，吉西他濱的持續(xù)作用可以富集CD133＋CSC；加大吉西他濱的劑量不能誘導(dǎo)CD133＋CSC凋亡或死亡，而其他細(xì)胞則全部死亡。我們的研究結(jié)果亦顯示，CSCCD44＋CD24＋ESA＋細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)吉西他濱和紫杉醇具有很強(qiáng)的耐藥性，但其內(nèi)在分子機(jī)制尚不清楚。

研究表明，CSCCD44＋CD24＋ESA＋細(xì)胞具有很強(qiáng)的致瘤特性。特別有趣的是，免疫組化分析表明，CSCCD44＋CD24＋ESA＋細(xì)胞所誘導(dǎo)的腫瘤中RON和c-Met的表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性。RON（recepteur d’origine nantais，RON）與其同源基因 Met（proto-oncogene tyrosine kinase，Met）構(gòu)成人類受體酪氨酸激酶家族（receptor tyrosine kinase，RTK）中的Met原癌基因亞家族。RON信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管生成與化療藥物耐藥性的影響［14］。Li等［15］研究表明c-Met介導(dǎo)了胰腺癌干細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，可作為一種表面標(biāo)志進(jìn)行CSC的分選。Ma等［16］報(bào)導(dǎo)MSP刺激人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29后，使其受體RON磷酸化激活，上調(diào)EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記Vimentin的蛋白水平，抑制E-Cadherin的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)向間質(zhì)細(xì)胞樣轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)HT-29的轉(zhuǎn)移潛能。本研究發(fā)現(xiàn)RON／c-Met的過(guò)表達(dá)，與胰腺癌干細(xì)胞的特性存在密切相關(guān)性，其內(nèi)在機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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