魏玉杰，劉惠亮，李 屹，張 蛟，徐 麗，張雪潔

研究表明［1］，吸煙是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，它可致凝血功能異常，血栓形成。但是，目前吸煙導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成的機(jī)制仍不明確。血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TM）是內(nèi)皮細(xì)胞表面一種強(qiáng)的抗凝活性糖蛋白，它和凝血酶1∶1結(jié)合導(dǎo)致凝血酶底物發(fā)生特異性改變，從而起到抗血栓作用。TM與凝血酶結(jié)合，不但受TM量表達(dá)的影響，同時(shí)也受其與凝血酶在單分子間相互作用的影響。關(guān)于生物分子間相互作用的研究，原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）具有獨(dú)特的優(yōu)勢，因?yàn)樗梢詼y定活細(xì)胞表面單分子間相互作用力。在活細(xì)胞表面直接測定單對生物分子（如膜蛋白受體／配體）的相互作用力，可以更真實(shí)地反映生理?xiàng)l件下生物分子間的相互作用性質(zhì)［2］。近年來關(guān)于活細(xì)胞表面單分子力譜測量的研究開展逐漸增多，但是關(guān)于TM與凝血酶單分子間相互作用的研究目前尚未見報(bào)道，而吸煙是否會(huì)影響二者間在單分子水平的結(jié)合尚不清楚。

本研究采用5%香煙提取物（cigarette smoke extract，CSE）孵育經(jīng)轉(zhuǎn)染 TM-GFP質(zhì)粒的 COS-7細(xì)胞，利用AFM單分子力譜法檢測凝血酶與TM在單分子水平的相互作用，從而探討吸煙致血管內(nèi)血栓形成的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）從人臍帶的臍靜脈中分離獲得。實(shí)驗(yàn)用第2～3代細(xì)胞。非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞COS-7由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院八所提供。

1.2 試劑 （1）CSE：取紅梅牌香煙（含焦油12 mg／支，煙氣煙堿量1.1 mg／支，煙氣一氧化碳量13 mg／支）自制。（2）質(zhì)粒小提試劑盒購自Promega公司，BamHI、HindIII限制性核酸內(nèi)切酶及購自TaKa-Ra公司，鼠抗人TM單克隆抗體購自英國Abcam公司，實(shí)驗(yàn)用凝血酶粉劑購自美國Sigma公司，Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、Medium 200培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，無水乙醇、氫氟酸、丙酮、二甲基亞砜等購自北京化學(xué)試劑公司。

1.3 主要儀器 原子力顯微鏡：美國PicoSPM公司。AFM探針：上海愛建納米科技有限公司。PCR儀：德國 Biometra公司。熒光倒置顯微鏡：Olympus公司。激光共聚焦顯微鏡：UltraView PerkinElmer公司等。

2 方法

2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng) 按照郭卿等［3］方法，取剖宮產(chǎn)后新鮮臍帶（武警總醫(yī)院婦產(chǎn)科提供）應(yīng)用0.1%Ⅰ型膠原酶消化得到HUVEC原代，細(xì)胞（80～90）%融合時(shí)傳代；實(shí)驗(yàn)用第2～3代。

2.2 參照 Nakamura［4］方法制備 CSE 兩支去過濾嘴香煙于一個(gè)注射器驅(qū)動(dòng)裝置連續(xù)點(diǎn)燃。注射器經(jīng)三通裝置連續(xù)抽吸，吸入的煙霧經(jīng)三通的另一個(gè)出口通入50 ml PBS溶液制成懸液，1 mol·L－1NaOH調(diào)制pH值至7.4，用0.22μm的微孔濾器過濾除去細(xì)菌和大顆粒物質(zhì)30 min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 重組質(zhì)粒pTM-GFP的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞 從HUVEC中提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后得到TM的cDNA片段，通過RT-PCR擴(kuò)增目的片段TM（1700 bp），設(shè)計(jì)上游引物包含HindⅢ酶切位點(diǎn)：5′-CGA AGC TTA TGC TTG GGG TCC TGG TC-3′；下游引物包含BamHⅠ酶切位點(diǎn)：5′-ATGGAT CCGAGT CTC TGC GGC GTC GC-3′（由寶生物工程大連有限公司合成上述引物；人TM全長cDNA序列于NCBI基因庫檢索獲得，NM＿000361.2）。將目的基因與載體連接轉(zhuǎn)化、雙酶切鑒定，提取獲得重組質(zhì)粒pTM-GFP，轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞，37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)6 h后更換完全培養(yǎng)基（10%FBS和青霉素、鏈霉素各100 kU·L－1的MEM培養(yǎng)液），轉(zhuǎn)染24 h內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

2.4 利用AFM測定TM與凝血酶的相互作用

2.4.1 AFM探針的修飾（參照 Yang等［5］方法）將AFM探針置于 Plasma（PDC-32G-2，Harrick Scientific Corp，NY）反應(yīng)器中，在1mbar的高純氧氣氛中最高功率條件下反應(yīng)120 s，在甲苯溶液中（含1%3-巰基丙基三甲氧基硅烷，V／V）室溫下孵育1 h，再以丙酮、無水乙醇、雙蒸水沖洗，氮?dú)獯蹈?，浸? g·L－1N-羥基琥珀酰亞胺－聚乙烯乙二醇－馬來酰亞胺（DMSO）液中2 h，將針尖浸入凝血酶蛋白溶液中（2 mg·L－1）室溫下反應(yīng)0.5 h，固定好蛋白樣品針尖4℃保存，1周內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 功能化硅片制備 參照文獻(xiàn)［6－7］，取 1 cm×1 cm單晶體硅片在室溫下浸入堿性溶液（NH4OH∶H2O2∶H2O＝1∶1∶5，V／V）清洗表面30 min；在 piranha溶液 （98%H2SO4∶H2O2＝7∶3，V／V）中加熱到90℃保溫30 min以獲得清潔和羥基化的硅片表面。將洗凈的硅片轉(zhuǎn)移至含1.0%APTES的甲苯溶液中，在室溫下反應(yīng)2 h后，用甲苯反復(fù)沖洗硅片表面，以除去表面沒有反應(yīng)的硅烷化試劑；并依次用丙酮、乙醇清洗，氮?dú)獯蹈?，硅烷化的硅片轉(zhuǎn)移至0.1%的戊二醛溶液中 （選用PBS緩沖溶液：10 mmol·L－1Na2HPO4，1.8 mmol·L－1KH2PO4，2.7 mmol· L－1KCl，140 mmol· L－1NaCl，pH 7.4），室溫下反應(yīng)0.5 h，然后用 PBS緩沖溶液沖洗。經(jīng)過戊二醛活化后的硅片浸入到TM-ECD蛋白溶液中 （1 mg·L－1緩沖溶液中），室溫放置3 h。處理后用緩沖溶液清洗，在4℃下緩沖液中保存待用。

2.4.3 單分子力譜測定TM與凝血酶相互作用力

2.4.3.1 活細(xì)胞表面實(shí)驗(yàn)分組 ①空白質(zhì)粒對照組（GFP-thr group）；② TM-GFP對照組（TM-thr group）；③5%CSE孵育TM-GFP細(xì)胞1 h組（CSETM-thr group）；④ 5%CSE孵育空白質(zhì)粒細(xì)胞組（CSE-GFP-thr group）；每組測力后均加入鼠抗人特異單克隆抗TM抗體（2 mg·L－1封閉30 min）行封閉阻斷實(shí)驗(yàn)。

2.4.3.2 硅片表面實(shí)驗(yàn)分組 ① TM-凝血酶對照組（TM-Thr-SGroup）；② 5%CSE孵育硅片1 h組（CSE-TM-thr-Sgroup）；每組測力后均行封閉阻斷實(shí)驗(yàn)。

2.4.3.3 原子力顯微鏡測力 采用AFM及倒置熒光顯微鏡的聯(lián)用系統(tǒng)，在AFM的接觸模式下，針尖反復(fù)在COS-7細(xì)胞表面或TM-ECD修飾的硅片表面下壓－回拉，隨機(jī)獲得力－距離曲線，用同一個(gè)針尖在6～10個(gè)細(xì)胞表面（每組實(shí)驗(yàn)條件下）進(jìn)行測力，每個(gè)細(xì)胞隨機(jī)選取4～6個(gè)位置共記錄1 000條力－距離曲線，所得力 －距曲線采用 MATLAB R2009a軟件分析。分析所得黏附力值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，求出力的高斯分布。同時(shí)，可以求得在所有曲線中發(fā)生特異性黏附的成鍵幾率。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Origin 7.0和SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以ˉx±s表示，各組間結(jié)合幾率比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）；阻斷前后比較采用配對t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 TM與凝血酶在細(xì)胞表面的相互作用 TM與凝血酶（TM-thr group）在細(xì)胞表面單分子水平相互作用力的大小為（60.90±0.82）皮牛（pN）（Fig 1），成鍵幾率為（22.58±3.95）%；抗體阻斷后成鍵幾率為（2.58±2.0）%較阻斷前明顯降低，P＜0.05。

3.2 四組間成鍵幾率比較 GFP-Thr group成鍵幾率在抗體阻斷前后分別為（3.74±3.42）%，（2.52±0.51）%；CSE-TM-Thr group為（6.30±4.20）%，（2.70±2.19）%；CSE-GFP-Thr group為（4.40±1.48）%，（1.12±1.06）%。3組與 TM-Thr group比較，P＜0.05；但3組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組經(jīng)抗體阻斷成鍵幾率雖有降低，但是阻斷前后無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Fig 2）。

3.3 5%CSE孵育前后TM與凝血酶在硅片表面的相互作用 TM與凝血酶在硅片表面單分子水平相互作用力的大小為（45.30±1.37）pN，成鍵幾率為（23.25±7.02）%；抗體阻斷后成鍵幾率為（4.64±2.31）%，較阻斷前明顯降低，P＜0.05。5%CSE孵育硅片1 h后TM與凝血酶的成鍵幾率為（8.31±1.06）%，與TM-Thr-S組比較，P＜0.05，特異抗體封閉后成鍵幾率為（5.17±2.96）%，見Fig 3。

Fig 1 Histogram of the binding forces of TM／Thr

Fig 2 Single-molecule binding probabilities of TM／Thr obtained by thrombin modified AFM tips in different experiments

4 討論

TM主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞，在平滑肌細(xì)胞，單核細(xì)胞、白細(xì)胞、角蛋白細(xì)胞及一些腫瘤細(xì)胞也有少量表達(dá)［9－10］，而非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞COS-7未見報(bào)道有TM表達(dá)。因此本研究把成功構(gòu)建的TM-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞，可以起到兩方面的作用：一方面可使AFM掃描時(shí)達(dá)到可視化；另一方面可排除由于掃描細(xì)胞本身存在TM的表達(dá)會(huì)干擾AFM檢測凝血酶與TM之間的作用力。TM有5個(gè)功能區(qū)，其中在第2個(gè)功能區(qū)類表皮生長因子結(jié)構(gòu)區(qū)有6個(gè)重復(fù)序列，5和6區(qū)是凝血酶結(jié)合部位［11］。當(dāng)TM與凝血酶在結(jié)合相互作用發(fā)生改變會(huì)影響到TM的抗凝作用。本研究利用表位在類表皮生長因子5區(qū)特異性單克隆鼠抗人TM抗體進(jìn)行封閉，這個(gè)部位恰恰是TM與凝血酶的結(jié)合部位，研究結(jié)果顯示每組阻斷實(shí)驗(yàn)阻斷后的結(jié)合幾率均明顯減少（除GFP-Thr組變化不明顯外），表明抗體封閉阻斷特異且效果比較好。而GFP-Thr組沒有變化，提示空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞沒有TM和凝血酶特異性結(jié)合。

Fig 3 Single-molecule binding probabilities of TM／Thr-S obtained by thrombin modified AFM tips in different experiments

由于AFM可以在活細(xì)胞上直接檢測單對生物分子如膜蛋白受體／配體的相互作用力，被廣泛應(yīng)用于生物研究領(lǐng)域。它的工作模式主要有接觸模式和輕敲模式。輕敲模式也就是探針?biāo)綊呙杩梢垣@得高分辨率成像，本課題組前期利用此模式清晰地觀察到兔動(dòng)脈粥樣硬化不同時(shí)期血管內(nèi)皮的超微結(jié)構(gòu)變化［12］。接觸模式也就是探針豎直掃描可檢測到單分子間相互作用力，本研究采用接觸模式可使針尖在樣品表面豎直方向上下運(yùn)動(dòng)，系統(tǒng)記錄在針尖反復(fù)下壓－接觸－提拉的循環(huán)過程中微懸臂彎曲方向和程度的改變，并將此變化轉(zhuǎn)化為分子間相互作用的力值，即為針尖固有的彈性常數(shù)與形變程度的乘積，此作用力值可精確到皮牛級。Lee等［13］利用AFM皮牛級的測力靈敏度來研究生物分子間的非共價(jià)作用，為在單分子水平上分子間相互作用力的測定奠定了基礎(chǔ)。本研究采用AFM測得凝血酶與TM之間的相互作用力約為60pN，從高斯擬合的結(jié)合力分布圖顯示為單峰圖譜；TM與凝血酶的AFM成鍵幾率為（22.58±3.95）%，而利用特異抗體阻斷后成鍵幾率明顯減低；并且有文獻(xiàn)報(bào)道［5］，成鍵幾率在（10～30）%時(shí)認(rèn)為所得力值為單分子間作用力，綜合以上3點(diǎn)提示60pN是凝血酶與TM之間特異性的結(jié)合力。

本研究結(jié)果顯示，在COS-7細(xì)胞表面：與TMThr對照組比較，5%CSE孵育1 h后，TM與凝血酶結(jié)合幾率明顯降低。同樣，在等量TM修飾的硅片表面：與TM-Thr-S對照組比較，5%CSE孵育1 h后TM與凝血酶結(jié)合幾率也是明顯減少的。表明CSE明顯影響了TM與凝血酶在單分子水平的結(jié)合，降低兩者之間的結(jié)合幾率，并不是通過影響TM量的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。TM與凝血酶結(jié)合幾率降低，從而使得抗凝系統(tǒng)減弱，血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加。關(guān)于CSE減少TM與凝血酶結(jié)合的機(jī)制是通過類似抗體封閉的方式阻斷了兩者的相互結(jié)合，還是通過改變TM的分子構(gòu)象，這有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

以上結(jié)果表明，CSE有可能是通過降低了TM與凝血酶在單分子水平的結(jié)合幾率，降低抗凝系統(tǒng)功能，從而導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加。

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