吳文寧，王玉嬋，董六一，陳志武

缺血性腦損傷是腦缺血、腦外傷、腦缺氧性疾病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病所共有的病理過程，具有高致殘率和致死率的特點，嚴重威脅人類的生命健康，但目前臨床上對于該類疾病的有效治療手段仍然很有限，因此，尋找新的缺血性腦損傷的治療藥物和治療途徑一直備受關注。

青藤堿是從中國傳統(tǒng)藥用植物青風藤中提取的生物堿，長期以來一直作為治療風濕和類風濕藥物用于臨床，具有多種藥理作用，包括抗炎抗氧化、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、減輕成癮大鼠戒斷癥狀、細胞保護等作用［1－5］。較早之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，青藤堿能對抗急性心肌缺血／再灌注損傷，保護心肌細胞［6］；我們之前研究證實青藤堿能減少腦缺血面積，具有神經(jīng)保護作用［7］，但其對海馬神經(jīng)元缺氧／缺血損傷的作用研究還比較少。所以我們建立原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元OGD-R模型，模擬腦缺氧缺血損傷的病理過程，觀察SN對OGD-R引起海馬神經(jīng)元損傷的保護作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 新生SD乳鼠（24 h內），安徽醫(yī)科大學動物中心提供。

1.2 藥品與試劑 青藤堿（中國藥品生物制品檢定所，純度大于0.99），DMEM／F12培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco公司），四甲基偶氮唑鹽 MTT、Hoechst 33258和胰酶（Sigma公司），LDH試劑盒（南京建成生物工程研究所），F(xiàn)ura-2／AM（Biotium，美國），Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體購自 Santa Cluz公司，PcTx1購自（Alomone labs，以色列），其他試劑均為分析純。細胞外液（mmol·L－1）：NaCl 150，KCl 5，MgCl21，CaCl22，HEPES 10，glucose 10，pH調至 7.4。電極內液 （mmol·L－1）：KCl 140，NaCl 10，MgCl21，EGTA 5，Mg-ATP 2，HEPES 10，pH調至7.2。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Sheldon Manufacturing Inc，美國），超凈化工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化公司，中國），低溫離心機（Biofuge-22R Heraeus company，德國），全自動酶標儀（Bio Tech，美國），熒光鈣離子成像圖象系統(tǒng) （Tillphotonics，德國），膜片鉗放大器（HEKA，德國）倒置相差顯微鏡（Olympus IX70，日本），Western blot電泳、轉膜裝置（Bio-RAD，美國）。

1.4 海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng) 取24 h內新生SD乳鼠，超凈工作臺中無菌條件下分離海馬組織，剪碎，質量濃度1.25 g·L－1胰蛋白酶消化30 min后輕柔吹打，過濾，800 r·min－1離心 5 min棄上清，收集細胞接種于poly-L-lysine處理過的細胞培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿，置于體積分數(shù)0.05 CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔1天DMEM／F12培養(yǎng)液換液1次。

1.5 細胞OGD模型 模型組細胞使用無糖Earle’s平衡鹽溶液替換正常的細胞培養(yǎng)液，并將其置于37℃含體積分數(shù)0.95 N2和0.05 CO2的混合氣體的培養(yǎng)箱，2 h后換正常培養(yǎng)液，然后正常培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。對照組細胞使用有糖Earle’s平衡鹽溶液正常條件培養(yǎng)2 h時間后，再換正常培養(yǎng)液正常條件繼續(xù)培養(yǎng)24 h。處理組細胞在OGD前24 h加入各不同濃度的藥物孵育。

1.6 MTT測定 將原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元分成正常組、OGD組、陽性藥物組、OGD加不同濃度藥物組，按實驗要求處理后，每孔加入含0.5 g·L－1MTT細胞培養(yǎng)液150μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄上清，每孔加DMSO 150μl，37℃振搖孵育15 min，酶標儀 490 nm波長處檢測光密度值。

1.7 LDH測定 將原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元分成正常組、OGD組、陽性藥物組、OGD加不同濃度藥物組，按實驗要求處理后，收集各組培養(yǎng)液上清，然后使用體積分數(shù)0.002 TritonX-100破膜，再次收集各組細胞液體，根據(jù)試劑盒說明書分別測得上清和細胞中的LDH活力，計算上清LDH／總LDH的比率，以此代表細胞受損程度。

1.8 Hoechst染色 將接種在玻片上的原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元分成正常組、OGD組、OGD加藥物組，按實驗要求處理后，棄培養(yǎng)液，PBS液清洗3次，質量濃度40 g·L－1多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，然后37℃條件下 Hoechst 33258（1 mg·L－1）孵育20 min，再次PBS清洗3次，甘油封片，倒置熒光顯微鏡觀察細胞核形態(tài)，細胞核固縮突亮或者碎塊狀致密濃染為凋亡神經(jīng)元。

1.9 細胞內鈣離子濃度測定 將原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元分成正常組、OGD組、OGD加藥物組，按實驗要求處理后，用細胞外液將海馬神經(jīng)元清洗3次后，37℃條件下 Fura-2／AM（1μmol·L－1）孵育 20 min，然后細胞外液再清洗3次，使用鈣離子熒光成像系統(tǒng)，分別以340 nm和380 nm波長的熒光進行激發(fā)，運用TILLVISION軟件記錄每秒F340／F380比值，以此代表細胞內鈣離子濃度，最后導出數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。

1.10 Western blot 將原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元分成正常組、OGD組、OGD加藥物組，按實驗要求處理后，收集各組細胞，加入適量蛋白裂解液，置于冰上裂解 30 min后 12 000 r·min－1離心 15 min，取上清，BCA法測定蛋白含量。然后按1∶4體積（上樣緩沖液：樣本）加入上樣緩沖液，充分混勻后滅活5 min。配制體積分數(shù)0.1的分離膠，每泳道加入等量蛋白，100 V電壓電泳分離約90 min，用濕轉法將蛋白轉移至NC膜上。使用含質量濃度50 g·L－1脫脂奶粉的TBST液封閉1 h，然后使用含質量濃度10 g·L－1脫脂奶粉TBST液稀釋一抗到適當濃度，4℃孵育過夜。次日TBST洗膜，加入適當濃度二抗室溫孵育1 h。TBST再次洗膜后，加ECL熒光劑顯影，GTS凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描顯影的密度。

1.11 全細胞膜片鉗記錄 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)10 d后，通過膜片鉗技術記錄細胞膜電流，再采用Pulse／PulseFit軟件采集和處理數(shù)據(jù)，采樣頻率為10 kHz，濾波頻率為3 kHz。藥物對正常海馬神經(jīng)元ASICs電流的影響采用瞬時給藥自身對照的方法；藥物對OGD處理后海馬神經(jīng)元ASICs電流的影響采用組間對照的方法，分成正常組、OGD組、OGD加藥物組，按實驗要求處理后，記錄各組細胞的電流（pA）和電容（pF），以電流密度（pA／pF）來反映電流大小改變情況。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 統(tǒng)計學處理使用SPSS12.0軟件，所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用單因素方差分析結合 Student-Newman-Keuls檢驗或t檢驗。

2 結果

2.1 SN對抗OGD-R誘導海馬神經(jīng)元損傷的作用如Fig 1所示，與正常對照組比較，OGD-R后海馬神經(jīng)元存活率明顯降低，LDH釋放量明顯增加（P＜0.01）；而陽性藥 Nimodipine（10μmol·L－1）和 SN處理組（0.1、0.5和1μmol·L－1）海馬神經(jīng)元存活率明顯增加，LDH釋放明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 SN對抗OGD-R誘導海馬神經(jīng)元凋亡 Hoechst染色結果顯示，0.5μmol·L－1SN明顯抑制OGD-R誘導的海馬神經(jīng)元凋亡，如Fig 2A所示；與正常組相比，OGD-R后Bax表達明顯增加，Bcl-2的表達則減少，Bcl-2／Bax的比率下降，同時caspase-3表達也明顯增加（P＜0.05）；而給予0.5μmol·L－1SN處理組Bcl-2／Bax的比率增加，caspase-3表達減少（P＜0.05），如 Fig 2B、2C所示。

Fig 1 SN protects hippocampal neurons against injury induced by OGD-R

2.3 SN對OGD誘導細胞內鈣離子濃度變化的影響 如Fig 3所示，和對照組相比，OGD處理組細胞內鈣離子濃度明顯增加（P＜0.01），而0.5 mol·L－1SN處理組，明顯抑制細胞內鈣離子濃度增加（P＜0.01）。

2.4 SN對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元ASCIs電流的影響 如Fig 4A所示，0.5μmol·L－1SN明顯抑制ASICs電流（P＜0.05），洗脫后可恢復；給予ASIC1a阻斷劑 PcTx1（10nmol·L－1）后，SN對剩余部分電流沒有影響，只抑制ASIC1a通道，如Fig 4B所示。和正常對照組相比，OGD處理組ASICs電流密度明顯增加（P＜0.05），而 SN（0.5μmol·L－1）處理組明顯抑制ASICs電流密度增加（P＜0.05），如Fig 4C所示。

3 討論

Fig 2 SN protects hippocampal neurons against apoptosis induced by OGD-R

神經(jīng)元缺血損傷后，其死亡的方式主要有壞死、凋亡和自噬3種。壞死主要發(fā)生于腦缺血急性期的缺血中心區(qū)域，而缺血／再灌注引起的繼發(fā)性神經(jīng)元死亡則發(fā)生在半暗帶區(qū)，以凋亡為主［8］，因此，抑制再灌注引起神經(jīng)元凋亡是治療缺血性腦損傷、降低致死率和致殘率的關鍵所在。多種傳統(tǒng)中藥有效成份已被證實能抑制缺血／再灌注引起的神經(jīng)元凋亡。

Fig 3 SN inhibits the increase of［Ca2＋］i induced by OGD in hippocampal neurons

青藤堿源于傳統(tǒng)中藥青風藤，具有細胞保護作用，但對缺氧缺血／再灌注引起海馬神經(jīng)元凋亡的作用還鮮有報道。我們研究發(fā)現(xiàn)，SN濃度依賴性抑制OGD-R誘導的細胞活率降低，提高細胞的生存率；SN也可濃度依賴性抑制OGD-R誘導LDH的釋放；根據(jù)上兩個實驗結果以及前期體內實驗結果［7］，我們選擇0.5μmol·L－1SN作為后續(xù)實驗的劑量。Hochest染色結果表明SN能明顯抑制OGD-R誘導的海馬神經(jīng)元凋亡；Western blot結果顯示，SN抑制OGD-R誘導的促凋亡蛋白Bax和caspase-3表達的上調，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。這些表明SN能對抗再灌注引起的海馬神經(jīng)元凋亡，具有神經(jīng)保護作用。

腦缺血的病理機制目前還未完全闡明，現(xiàn)認為多因素參與了神經(jīng)元缺血損傷的分子機制，如興奮性氨基酸毒性、鈣穩(wěn)態(tài)失調、氧化應激、炎癥、酸中毒、腦能量代謝紊亂等。其中鈣超載是引起缺血后繼發(fā)神經(jīng)元凋亡的重要環(huán)節(jié)，是諸多因素導致神經(jīng)元死亡的“最后共同通路”［9］。鈣超載可通過改變線粒體膜的通透性、觸發(fā)內質網(wǎng)應激等途徑啟動胞內的級聯(lián)反應誘導神經(jīng)細胞的凋亡。我們的結果顯示，海馬神經(jīng)元經(jīng)OGD-R處理后，胞內鈣離子濃度明顯增加，而給予0.5μmol·L－1SN處理之后，鈣離子濃度增加明顯被抑制，表明SN對抗缺血性損傷、保護海馬神經(jīng)元可能與其抑制細胞內鈣離子濃度有關。

ASICs（acid sensing ion channels）是 H＋-門控的離子通道，屬于上皮鈉通道／退化蛋白（epithelial Na channel／degenerin，ENaC／DEG）超家族，在細胞外pH降低時被激活，主要引起內向電流和膜的去極化，它包括 6個亞型：ASIC1a，ASIC1b，ASIC2a，ASIC2b，ASIC3和ASIC4，廣泛存在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在多種生理病理過程中扮演重要角色［10］。ASIC1a除對鈉離子通透外，對鈣離子也有一定通透性。近些年研究表明，ASICs特別是ASIC1a在缺血性腦損傷過程中扮演重要的角色［11－12］，腦缺血過程伴有ASIC1a的大量激活，導致細胞內鈣超載，進而引起胞內級聯(lián)反應導致神經(jīng)元的凋亡，而ASIC1a特異性阻斷劑PcTx1能減輕缺血后神經(jīng)元的損傷，減少缺血面積，保護腦功能［13］。所以在明確SN能抑制胞內鈣離子濃度增加后，我們進一步觀察了其對ASICs的影響，結果發(fā)現(xiàn)，SN能抑制海馬神經(jīng)元ASICs通道電流，并且在預先給予10 nmol·L－1PcTx1阻斷ASIC1a后，SN對ASICs電流剩余部分無明顯影響，表明SN主要選擇性作用于ASIC1a通道。以往研究表明［11］，OGD-R處理后，皮層神經(jīng)元ASICs通道功能上調，從而加重缺氧缺血神經(jīng)元的損傷，因此我們觀察了SN對OGD誘導ASICs功能改變的影響，結果顯示，海馬神經(jīng)元經(jīng)OGD處理后，ASICs電流密度明顯增加，而SN處理組ASICs電流密度未見明顯改變。以上結果揭示SN神經(jīng)保護作用可能主要是通過抑制ASIC1a通道，減輕鈣超載來實現(xiàn)的。

Fig 4 Effect of SN on ASICs current in hippocampal neurons

綜上所述，SN能對抗OGD-R誘導的海馬神經(jīng)元損傷，具有神經(jīng)保護作用，其作用機制可能與抑制ASICs通道，減輕細胞內鈣超載有關。我們的研究可能為臨床缺血性腦損傷的治療提供新的潛在藥物和治療途徑。

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