曹 波，牛 聰，盧 濤，胡 杰，陳 虹，3

由于各種因素導(dǎo)致大氣臭氧層的不斷破壞，致使太陽(yáng)紫外線輻射明顯增強(qiáng)。紫外線按其波長(zhǎng)的不同可以分為 4種，長(zhǎng)波紫外線（UVA，320～420 nm）、中波紫外線（UVB，290～320 nm）、短波紫外線（UVC，200～275 nm）和真空紫外線（UVD，100～200 nm），研究表明UVB到達(dá)地面的量最大，且對(duì)人體的危害最大。長(zhǎng)期或大量的基礎(chǔ)紫外線照射能導(dǎo)致皮膚表皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化，嚴(yán)重者可造成細(xì)胞DNA的損傷并導(dǎo)致細(xì)胞癌變［1－3］。

天然產(chǎn)物中的許多成分具有抑制凋亡的作用［4］，可以對(duì)抗UVB對(duì)機(jī)體的損傷。我們前期用人表皮角質(zhì)永生化細(xì)胞（HaCaT）制造UVB損傷模型，并篩選了多種天然產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)五味子乙素（SchB）、槲皮素（quercetin）、蕓香苷（violaguercitrin）具有較好的UVB防護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上本文選擇SchB作為研究對(duì)象，探究其對(duì)UVB輻射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡的抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人永生化角質(zhì)細(xì)胞HaCaT細(xì)胞購(gòu)自凱基生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 五味子乙素（SchB），由本院生藥學(xué)教研室陳虹教授研究室提供，分子質(zhì)量400，白色結(jié)晶，難溶于水，純度97%，體外實(shí)驗(yàn)用DMSO配制。DMEM培養(yǎng)基（天潤(rùn)善達(dá)公司），胎牛血清（FBS）（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司），溴化四 氮 唑 藍(lán) 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyl-tetrazolium Bromide，MTT）、Hoechst 33342、EB（溴化乙啶）（美國(guó)Sigma公司），RT-PCR試劑盒（大連寶生物資源有限公司），Olympus IX70倒置顯微鏡（日本 Olympus公司），MODEL680型酶標(biāo)儀（意大利BIO-RAD公司），UV-260型紫外－可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人表皮角質(zhì)永生化細(xì)胞HaCaT。在DMEM培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清，100 kU·L－1青霉素、100 mg·L－1鏈霉素）培養(yǎng)。

1.2.2 MTT法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期等量細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。接種24 h后，用中波紫外線（UVB）段紫外光療儀（Waldman，Schwenningen，German）輻射板中細(xì)胞，輻射劑量為30 mJ／cm2（輻射密度2 mW／cm2，輻射時(shí)間150 s），之后加入不同劑量的 SchB及維生素 E（vitamin E）（10、1、0.1、0.01 μmol·L－1），陰性對(duì)照組加入等量溶媒，放置 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱24 h后，每孔加入50μl 1 g·L－1MTT溶液，37℃孵育，4 h后棄去上清，每孔加入DMSO 150 μl，測(cè)定光密度值（OD），并計(jì)算 IC50值［5］。

1.2.3 Hoechst染色 通過Hoechst 33342染色來觀察UVB（30 mJ／cm2）輻射后及給藥后細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞凋亡狀況。收集及固定細(xì)胞完成后，用PBS沖洗HaCaT細(xì)胞3次，室溫避光，Hoechst 33342（10 mg·L－1）染色10 min。通過 CHK型光學(xué)顯微鏡觀察，Olympus數(shù)碼相機(jī)照相。

1.2.4 SchB對(duì)HaCaT基因表達(dá)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期等量接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。接種24 h后，UVB（30 mJ／cm2）輻射板中細(xì)胞，加入 10μmol·L－1SchB，分別在 4、8、12和 24 h后收集細(xì)胞，用TRIzol法提取總RNA。按RT-PCR試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR分析：β-actin作為內(nèi)標(biāo)，靶基因?yàn)閜21（引物序列為5′-TGT CCG TCA GAA CCC ATG CG-3′和 5′-GCG AGG CAC AAGGGT ACA AG-3′），p53（引物序列為 5′-TCT GGG ACA GCC AAG TCT GT-3′和 5′-GGA GTC TTC CAG TGT GAT GA-3′），Caspase-3（引物序列為 5′-GTG GAA TTG ATG CGT GAT G-3′和 5′-GGA ATC TGT TTC TTT GCA TG-3′）。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)SchB對(duì)HaCaT細(xì)胞的作用由Tab 1觀察可知，五味子乙素和維生素E在0.01～10μmol·L－1范圍內(nèi)對(duì) HaCaT細(xì)胞均無毒性。Tab 2可觀察到，SchB可以明顯減少紫外線照射后HaCaT細(xì)胞的死亡率，且具有一定的量效關(guān)系，說明其具有較強(qiáng)的紫外防護(hù)作用。

Tab 1 Cytotoxic effect of extract on HaCaT（ˉx±s，n≥3）

Tab 2 Protective effect of schizandrin B and vitamin E against UVB-induced oxidative damage to HaCaT（ˉx±s，n≥3）

2.2 Hoechst染色 我們通過Hoechst 33342染色可以明顯的觀察到HaCaT細(xì)胞的凋亡情況。UVB（30 mJ／cm2）輻射后細(xì)胞凋亡，Hoechst 33342染色后HaCaT細(xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)凝聚染色質(zhì)、細(xì)胞核皺縮。如Fig 1所示，UVB輻射后細(xì)胞凋亡明顯增加，給藥后細(xì)胞凋亡明顯得到抑制。

Fig 1 Effect of SchB on HaCaT cells nuclear morphology：Hoechst 33342 staining

2.3 SchB對(duì)HaCaT基因表達(dá)的影響 經(jīng)不同濃度的SchB作用于HaCaT細(xì)胞4、8、12、24 h，SchB降低了紫外誘導(dǎo)的p53、p21、Caspase-3等與凋亡有關(guān)基因的表達(dá)；表明SchB從抑制凋亡方面作用于細(xì)胞，有效的保護(hù)了細(xì)胞內(nèi)膠原的含量，見Fig 2。

UVB照射后4～24 h，各組p21 mRNA表達(dá)量差異均無顯著性；在UVB照射后4～12 h，加藥組與對(duì)照組p53 mRNA差別存在顯著性，而Caspase-3 mRNA則只在4 h時(shí)差異存在顯著性；在UVB照射后24 h，加藥組與對(duì)照組p53 mRNA差異無顯著性，而Caspase-3 mRNA差異存在顯著性。p53、Caspase-3 mRNA有隨時(shí)間變化而升高的趨勢(shì)，且對(duì)照組（Control）p53、Caspase-3 mRNA含量均高于其它組，見 Tab 3～5。

Fig 2 Effect of schizandrin B on p21，p53 and Caspase-3 mRNA expressions in HaCaT Cells

3 討論

近年來，長(zhǎng)期大量的接受UVB照射后導(dǎo)致的皮膚損傷包括日光性皮炎、光老化、皮膚癌變、免疫抑制等逐年增加［6－7］。UVB照射后的皮膚損傷的機(jī)制及如何預(yù)防和治療UVB損傷是目前研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室前期利用體外UVB損傷模型篩選了一系列天然產(chǎn)物，并對(duì)UVB損傷機(jī)制進(jìn)行了初步探討。發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物SchB具有良好的抗UVB輻射作用。

Tab 3 Effect of schizandrin B on p21 mRNA expression in HaCaT cells（ˉx±s，n≥3）

Tab 4 Effect of schizandrin B on p53 mRNA expression in HaCaT cells（ˉx±s，n≥3）

Tab 5 Effect of schizandrin B on Caspase-3 mRNA expression in HaCaT cells（ˉx±s，n≥3）

文獻(xiàn)報(bào)道顯示，UVB照射能夠促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體（cyclobutane pyrimidine dimers，CPDs）、積累p53以及分泌炎癥因子，從而導(dǎo)致皮膚表皮的主要效應(yīng)細(xì)胞凋亡［8］。因而如何減少UVB照射后皮膚表皮細(xì)胞的凋亡是抗UVB輻射的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的SchB（0.01～10μmol·L－1）均可以明顯減少 UVB照射后HaCaT細(xì)胞的死亡率。Hoechst 33342熒光染色實(shí)驗(yàn)可以觀測(cè)到模型組（UVB照射組）出現(xiàn)了核的固縮、邊集和凋亡小體等典型的細(xì)胞凋亡特征，而在不同劑量的SchB組，可以觀察到這些現(xiàn)象明顯減少，這一結(jié)果說明了SchB可以抑制UVB照射后HaCaT細(xì)胞的凋亡。

p53作為一種重要的抑癌基因，可以明顯的影響細(xì)胞的增殖與凋亡。研究結(jié)果顯示，p53的累積是UVB輻射導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和皮膚癌產(chǎn)生的重要標(biāo)記物之一［9］。本文利用RT-PCR分析了UVB照射后不同時(shí)間點(diǎn)p53 mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明在4 h p53的表達(dá)量開始增加，SchB（10μmol·L－1）組在4～12 h可以明顯降低p53表達(dá)，與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明SchB可能通過抑制p53的表達(dá)減少UVB輻射后的細(xì)胞凋亡。

p21作為p53基因下游的細(xì)胞周期調(diào)控因子，在細(xì)胞周期、DNA修復(fù)及細(xì)胞凋亡方面起著重要作用［10－12］。本實(shí)驗(yàn)分析p21基因，結(jié)果顯示在紫外線輻射后4～24 h，細(xì)胞內(nèi)p21各組變化不大，說明UVB輻射對(duì)細(xì)胞內(nèi)的p21影響不大或是SchB對(duì)p21的作用較小。

Caspase-3作為細(xì)胞內(nèi)凋亡的最終執(zhí)行者，可以啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡程序。研究表明大劑量的UVB照射皮膚后會(huì)誘導(dǎo)皮膚表皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而導(dǎo)致皮膚光老化［13］。本研究發(fā)現(xiàn)UVB輻射后4～24 h后表皮細(xì)胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)明顯增高，說明UVB照射啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)的凋亡通路。同時(shí)觀測(cè)到高劑量的SchB組在4～24 h均可明顯降低細(xì)胞內(nèi)Caspase-3表達(dá)量。這一結(jié)果提示SchB在初期即可抑制細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的表達(dá)。其作用機(jī)制可能是SchB抑制了UVB輻射后凋亡基因Caspase-3的升高，進(jìn)而抑制了UVB導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)UVB損傷模型中，凋亡相關(guān)基因p53和Caspase-3表達(dá)明顯改變，而p21基因表達(dá)基本沒有發(fā)生變化，這一結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道不完全一致，有待進(jìn)一步研究［11－12］。

綜上所述，SchB通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，抑制UVB對(duì)皮膚細(xì)胞的損傷?？蓪chB研制成一種高效的紫外防護(hù)劑或者添加劑，廣泛的應(yīng)用于天然防護(hù)劑及化妝品中，為維護(hù)人類健康提供新的天然保障。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 廉婷婷，李 斌，李 莉，等.姜黃素對(duì)中波紫外線照射HaCaT細(xì)胞凋亡的影響 ［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（29）：8－11.

［1］ Lian T T，Li B，Li L，et al.Influence of curcumin on ultraviolet B irradiation of HaCaT cells apoptosis［J］.China Med Herald，2012，9（29）：8－11.

［2］ 梁 虹，李家文，嚴(yán) 芳，等.選擇型環(huán)氧化酶-2抑制對(duì)紫外線照射誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡的影響［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，37（2）：247－50.

［2］ Liang H，Li J W，Yan F，et al.Effect of COX-2 selective inhibitor on the apoptosis of HaCaT cells induced by UV lrradiation［J］.Acta Med Univ Sci Technol Huazhong，2008，37（2）：247－50.

［3］ Salucci S，Burattini S，Battistelli M，et al.Ultraviolet B（UVB）irradiation-induced apoptosis in various cell lineages in vitro［J］.Int J Mol Sci，2012，14（1）：532－46.

［4］ 路婷婷，陳亞澤，盧 濤，等.紫外線的皮膚損傷機(jī)制及具有紫外線防護(hù)作用的天然產(chǎn)物的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（12）：1655－9.

［4］ Lu T T，Chen Y Z，Lu T.Mechanism of UV damage and the protective effect of natral products against UV damage［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（12）：1655－9.

［5］ 韓 銳，王振義，孫 燕，等.抗癌藥物研究與實(shí)驗(yàn)技術(shù) ［M］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1996：286－7.

［5］ Han R，Wang Z Y，Sun Y，et al.Research and development of anticancer drugs and experimental techniques［M］.Beijing：Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College Press，1996：286－7.

［6］ Tsatsou F，Trakatelli M，Patsatsi A，et al.Extrinsic aging：UV-mediated skin carcinogenesis［J］.Dermatoendocrinol，2012，4（3）：285－97.

［7］ D′Orazio J，Jarrett S，Amaro-Ortiz A，et al.UV Radiation and the Skin［J］.Int J Mol Sci，2013，14（6）：12222－48.

［8］ Afaq F，Khan N，Syed D N，et al.Oral feeding of pomegranate fruit extract inhibits early biomarkers of UVB radiation－induced carcinogenesis in SKH－1 hairless mouse epidermis［J］.Photochem Photobiol，2010，86（6）：1318－26.

［9］ Tavana O，Benjamin C L，Puebla-Osorio N，et al.Absence of p53-dependent apoptosis leads to UV radiation hypersensitivity，enhanced immunosuppression and cellular senescence［J］.Cell Cycle，2010，9（16）：3328－36.

［10］Romanov V S，Pospelov V A，Pospelova T V，et al.Cyclin-dependent kinase inhibitor p21（Waf1）：contemporary view on its role in senescence and oncogenesis［J］.Biochemistry（Mosc），2012，77（6）：575－84.

［11］Lei X，Liu B，Han W，et al.UVB-Induced p21 degradation promotes apoptosis of human keratinocytes［J］.Photochem Photobiol Sci，2010，9（12）：1640－8.

［12］Ahmed N U，Ueda M，Ichihashi M.Induced expression of p16 and p21 proteins in UVB-irradiated human epidermis and cultured keratinocytes［J］.J Dermatol Sci，1999，19（3）：175－81.

［13］Wang H Q，Quan T，He T，et al.Epidermal growth factor receptordependent，NF-kappaB-independent activation of the phosphatidylinositol 3-kinase／Akt pathway inhibits ultraviolet irradiation-induced caspases-3，-8，and-9 in human keratinocytes［J］.J Biol Chem，2003，278（46）：45737－45.