李葉麗，王穎婉，李意奇，張麗梅，龔其海，楊丹莉

高血壓腎損害系由原發(fā)性或繼發(fā)性高血壓引起的腎臟疾病，其中腎間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致腎臟損傷的重要原因。醛固酮作為腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中的一個重要因素，已成為高血壓腎損害研究的熱點之一。最近研究表明，醛固酮可上調(diào)離體的腎小管上皮細(xì)胞促纖維化的細(xì)胞因子如Ⅲ型膠原、TGF-β1、CTGF、FN等的表達(dá)［1－4］，加速腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展。淫羊藿為小檗科淫羊?qū)僦参铮哂袦仃栄a腎、除風(fēng)祛濕、強心益氣等功效。ICA是淫羊藿的主要活性成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，ICA具有抗腫瘤、增強免疫、改善心腦血管功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及抗骨質(zhì)疏松等作用［5］。本研究擬觀察 ICA是否具有抗SHR腎間質(zhì)纖維化作用，及該效應(yīng)是否與降低醛固酮水平，下調(diào)TGF-β1和Smad2的表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器 淫羊藿苷購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司；醛固酮試劑盒和Ⅲ型膠原試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光混合物，β-actin、TGF-β1、Smad2、CTGF、FN的引物購自TaKaRa生物工程公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄儀，德國Eppendorf公司；real time RT-PCR擴增儀，美國BIO-RAD公司；通用酶標(biāo)儀，美國 BIO-RAD公司；Leica光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)，德國Leica Microsystems Ltd。

1.2 實驗動物及分組 13周齡的♂ SHR大鼠14只、WKY大鼠7只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2012－0001。SHR大鼠隨機分為兩組，分別為模型組（n＝7）和ICA組（n＝7），WKY大鼠作為對照組。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，ICA組給予 ICA 40 mg·kg－1，ig，bid，至26周齡，模型組和對照組給予等量生理鹽水。

1.3 腎臟病理學(xué) 給藥14周后，7%水合氯醛（0.35 g·kg－1）經(jīng)腹腔注射麻醉成功后，取各組大鼠腎臟組織，置于4%甲醛溶液中固定48 h后，分別進(jìn)行HE和Masson染色，光鏡下觀察腎臟病理學(xué)變化。

1.4 血漿醛固酮和Ⅲ型膠原含量測定 腹主動脈取血2 ml，置于抗凝管中，離心后取上清，采用雙抗體夾心法測定血漿醛固酮和Ⅲ型膠原含量。測定方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.5 real time RT-PCR法檢測腎臟組織中TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達(dá) 取各組腎臟組織，置于1 ml TRIzol中，提取總RNA并檢測其純度后，經(jīng)兩步法逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)分別檢測β-actin、TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達(dá)。相關(guān)引物參照 GenBank中大鼠 β-actin、TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的序列設(shè)計，見 Tab 1。目的基因表達(dá)相對定量法：以PCR擴增過程中熒光信號強度達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)（cycle threshold，Ct值）為統(tǒng)計參數(shù)，依次計算平均 Ct值 ＝（Ct1＋Ct2）／2（重復(fù)管）；dCt＝平均 Ct值 －中間值；基因表達(dá) ＝2－dCt；相對定量 ＝目的基因的表達(dá)／內(nèi)參基因的表達(dá)×100，將空白對照組的mRNA表達(dá)量設(shè)定為100。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理，以ˉx±s表示，組間比較采用方差分析，SNK法兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 腎臟病理學(xué) HE和Masson染色均顯示對照組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常。與正常對照組比較，HE染色結(jié)果顯示模型組腎小球囊腔狹窄且不規(guī)則，小球內(nèi)系膜基質(zhì)增多，細(xì)胞排列紊亂，Masson染色結(jié)果顯示腎小管纖維增生，間質(zhì)纖維化；與模型組比較，HE和Masson染色顯示ICA組腎小球囊腔增寬，小球內(nèi)系膜基質(zhì)減少，細(xì)胞排列較為整齊，腎小管間質(zhì)纖維化程度減輕，見Fig 1。

2.2 血漿醛固酮和Ⅲ型膠原含量 與正常對照組比較，模型組血漿醛固酮和Ⅲ型膠原含量均升高（P＜0.01）；與模型組比較，ICA組血漿醛固酮和Ⅲ型膠原含量均降低（P＜0.01或 P＜0.05），結(jié)果見Tab 2。

Tab 1 Primer pair of real time RT-PCR

Tab 2 Effects of ICA on plasma aldosterone and collagen typeⅢ（ˉx±s，n＝6）

2.3 腎臟組織中 TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達(dá) 與正常對照組比較，模型組TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)（P＜0.01或 P＜0.05）；與模型組比較，ICA組 TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.01或P＜0.05），結(jié)果見Fig 2。

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是腎臟疾病發(fā)展和預(yù)后的重要因素，也是導(dǎo)致腎單位進(jìn)行性損傷的病理機制，其本質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）異常沉積，ECM過度合成和降解受抑是ECM積聚的直接原因［6］。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組腎小球囊腔狹窄且不規(guī)則，腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)增多，腎小管間質(zhì)纖維化，提示模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的腎間質(zhì)纖維化。另有研究表明［7］，24周齡的自發(fā)性高血壓大鼠出現(xiàn)了明顯的腎間質(zhì)纖維化。

Fig 1 HE staining of kidney tissue（×400）and Masson staining of kidney tissue（×200）

Fig 2 Effects of ICA on expressions of TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA in kidney tissue（ˉx±s，n＝6）

醛固酮可促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生［8－9］，也可上調(diào)Ⅲ型膠原、TGF-β1、CTGF、FN等的表達(dá)［1－4］。最近研究表明，醛固酮可能通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶1／金屬蛋白酶1組織抑制劑（MMP-1／TIMP-1）的基因表達(dá)，使Ⅲ型膠原降解減少，ECM過度積聚［3］；也可能通過促進(jìn) TGF-β1的表達(dá)誘導(dǎo)CTGF的表達(dá)［10］，從而促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。

TGF-β1是一種重要的促纖維化細(xì)胞因子，可參與成纖維細(xì)胞的增殖、分化與遷移，促進(jìn)ECM的生成與沉積，抑制其降解［11］。TGF-β1／Smad2信號通路的過度激活，可導(dǎo)致腎臟ECM生成增多，直接或間接導(dǎo)致CTGF和FN的產(chǎn)生［12］。CTGF作為TGF-β1的下游，可促使TGF-β1發(fā)揮促增生和ECM合成等作用［13］，也可在 TGF-β1誘導(dǎo)下參與成纖維細(xì)胞合成FN，使ECM在腎間質(zhì)積聚，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。

與模型組相比，ICA組腎小球囊腔增寬，腎小球內(nèi)系膜基質(zhì)減少，細(xì)胞排列較為整齊，腎小管間質(zhì)纖維化程度減輕，提示ICA可能具有抗SHR腎間質(zhì)纖維化的作用。此外，ICA組血漿醛固酮、Ⅲ型膠原含量，以及 TGF-β1、Smad2、CTGF、FN mRNA的表達(dá)均明顯低于模型組，提示ICA可能通過降低醛固酮水平，下調(diào)TGF-β1和Smad2的表達(dá)抗SHR腎間質(zhì)纖維化。

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