汪建云，王棟棟，陸昭磊，朱 闖，張 帆，郭 昊，印曉星

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是導(dǎo)致終末期腎病的常見病因之一，嚴(yán)重影響了糖尿病患者的生活質(zhì)量。在DN的發(fā)生發(fā)展過程中，一氧化氮（nitric oxide，NO）發(fā)揮著重要的作用，直接參與了糖尿病早期腎小球高灌注和高濾過的形成，造成DN的多尿與蛋白尿［1－2］。我們前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）活性明顯增高，進(jìn)而引起NO增高［3］。四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）為NO合成的關(guān)鍵酶iNOS的必要輔因子，NO的生成與BH4的水平有著密切的聯(lián)系。目前有關(guān)糖尿病腎病中BH4與NO及尿量、蛋白尿關(guān)系的研究，鮮見報(bào)道。

本研究采用BH4合成酶－Ⅰ型三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶（guanosine triphosphate cyclohydrolase I，GTPCHⅠ）的抑制劑 2，4二氨基 6羥基嘧啶（DAHP），在國際上廣為采用的先天性2型糖尿病所致的腎病模型（2型DN）db／db小鼠上，觀察BH4對iNOS的蛋白表達(dá)、NO生成及血尿生化指標(biāo)的影響，為2型DN的防治尋找新的靶點(diǎn)提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 尿蛋白檢測試劑盒、NOS活性檢測試劑盒及血肌酐（Scr）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，總NO試劑盒及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，葡萄糖測定試劑購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司。DAHP購自Sigma公司，兔多克隆抗iNOS抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處置 12周齡自發(fā)性糖尿病C57BL／KSJdb／db小鼠及同周齡非糖尿病C57／KSJ db／m小鼠，由南京軍區(qū)總醫(yī)院從美國Jackson公司引進(jìn)，自體繁殖成功后提供。收集小鼠24 h尿液，檢測24 h尿蛋白，證實(shí)小鼠發(fā)生DN（db／db小鼠24 h尿蛋白含量明顯高于db／m小鼠）。將成模的DN小鼠隨機(jī)分為2組：DAHP治療組（DAHP組，n＝8），腹腔注射 DAHP150 mg·kg－1（溶于 5%DMSO生理鹽水中）；糖尿病腎病組（DN組，n＝6），腹腔注射相同劑量的5%DMSO生理鹽水。同周齡db／km小鼠為正常對照組（NS組，n＝6），腹腔注射相同劑量的5%DMSO生理鹽水。所用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照徐州醫(yī)學(xué)院倫理委員會準(zhǔn)則操作。3組小鼠給藥7 d，收集血液及24 h尿液，處死。迅速分離兩側(cè)腎臟，生理鹽水沖洗后稱重，去除髓質(zhì)。取部分腎皮質(zhì)以福爾馬林固定，作iNOS的免疫組化測定。其余腎皮質(zhì)置于－80℃冰箱內(nèi)，備BH4、NO及iNOS蛋白的檢測。

1.2.2 常規(guī)血尿生化指標(biāo)測定 血糖采用葡萄糖氧化酶法檢測；用代謝籠收集小鼠24 h尿量，24 h尿蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)法檢測；血肌酐采用苦味酸法檢測。所有指標(biāo)均在Elx808IU酶標(biāo)儀上檢測（美國Bio-tex公司）。

1.2.3 Griess法檢測腎皮質(zhì)NO 將50 mg腎皮質(zhì)用200μl的PBS勻漿處理，離心。根據(jù)Griess反應(yīng)原理，取100μl離心液加入等量的Griess反應(yīng)液，混勻，室溫放置10 min，用酶標(biāo)儀于540 nm處進(jìn)行光密度測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算NO濃度。

1.2.4 比色法檢測腎皮質(zhì)iNOS活性 將50 mg腎皮質(zhì)用200μl的PBS勻漿處理，離心，取上清液。iNOS的活性不依賴鈣，可催化L-精氨酸和分子氧反應(yīng)生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530 nm波長處測定其光密度值，即代表iNOS活性。具體操作參照NOS活性檢測試劑盒說明進(jìn)行。

1.2.5 免疫組化法檢測iNOS蛋白 大鼠腎臟以10%中性福爾馬林固定24 h后，石蠟包埋切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%H2O237℃孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol·L－1枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中煮沸15 min，以修復(fù)抗原，正常山羊血清工作液封閉2 h，滴加兔多克隆抗iNOS抗體（1∶200），4℃ 冰箱孵育過夜，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗，DAB顯色。

1.2.6 Western blot法測iNOS蛋白 取預(yù)處理的腎皮質(zhì)細(xì)胞在冷提液中勻漿。以BCA法測定總蛋白濃度。取上樣蛋白100μg，經(jīng)8%的SDS-PAGE電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加兔多克隆抗iNOS抗體（1∶200），4℃過夜；TBST緩沖液洗膜后，加堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）孵育2 h。滴加 BCIP／NBT顯色液，避光顯色15 min。以β-actin為內(nèi)參，iNOS與β-actin的灰度比值代表iNOS的相對表達(dá)量。

1.2.7 HPLC法檢測BH4將腎皮質(zhì)組織在裂解液（50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.4，1 mmol·L－1DTT，1 mmol·L－1EDTA）中勻漿、離心。取上清，BCA試劑盒檢測蛋白含量。在上清中按照90μl裂解液中加入10μl 1.5 mol·L－1HClO4和2.0 mol·L－1H3PO4（1∶1）的比例處理析出蛋白，取上清分兩部分處理。一部分在酸性條件下氧化：按90μl裂解液中加10μl 1% 碘液（2%KI配制）比例混勻，避光置于室溫60 min，加入5μl新配制的抗壞血酸溶液（20 g·L－1），離心；一部分于堿性條件下氧化：按80μl裂解液中加入10μl NaOH，再加入10 μl碘液的比例混勻，避光置于室溫60 min；加入20 μl H3PO4及5μl抗壞血酸溶液，離心。取兩者的上清采用Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm柱）反相高效液相色譜法分析（Shimadzu LC.10A高效液相色譜儀，日本島津）。以甲醇／水混合液（5% ∶95%）作為流動(dòng)相，1.0 ml·min－1恒速洗脫。通過熒光檢測器（RF-10Ax）在熒光激發(fā)波長350 nm、發(fā)射波長450 nm處檢測生物蝶呤的積分峰面積值，出峰時(shí)間6.0 min左右。該方法檢測生物蝶呤靈敏度為152 ng·L－1。在酸性條件下氧化的標(biāo)本檢測出總生物蝶呤（biopterin）包括BH4、二氫生物喋呤和生物喋呤；在堿性條件下氧化的標(biāo)本檢測出二氫生物喋呤和生物喋呤；將二氫生物喋呤和生物喋呤從總生物蝶呤中除去，就是BH4含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 小鼠各項(xiàng)生化指標(biāo) DN組及DAHP組小鼠血糖、24 h尿蛋白、24 h尿量、Scr明顯高于NS組（P＜0.05），表明db／db小鼠此時(shí)已進(jìn)入DN階段，DN模型建模成功。與DN組比較，DAHP組體重、24 h尿蛋白及尿量明顯低于DN組（P＜0.05），而Scr及血糖無明顯降低（Tab 1）。

Tab 1 Biochemical characteristics of mice（ˉx±s）

2.2 各組小鼠腎皮質(zhì)中BH4水平 DN組的BH4水平明顯高于 NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明糖尿病腎病時(shí)腎皮質(zhì)中BH4水平增高；BH4合成酶抑制劑DAHP組的BH4水平明顯低于DN組（P＜0.01），表明DAHP能明顯抑制糖尿病腎病時(shí)BH4的合成（Fig 1）。

Fig 1 BH 4 levels in renal cortex of mice

2.3 小鼠腎皮質(zhì)中iNOS蛋白表達(dá) 免疫組化法顯示：腎小球iNOS蛋白位于腎細(xì)胞胞質(zhì)中。NS組腎皮質(zhì)中iNOS蛋白鮮有表達(dá)，DN腎病中iNOS蛋白染色密度較NS組明顯加深，經(jīng)過DAHP治療后，DN小鼠的腎皮質(zhì)中iNOS蛋白染色密度降低。Western blot結(jié)果顯示：DN組的iNOS蛋白水平明顯高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），DAHP組的iNOS水平明顯低于DN組（P＜0.05）（Fig 2）。表明DN小鼠腎皮質(zhì)中iNOS蛋白表達(dá)增高；當(dāng)BH4合成被抑制后，iNOS蛋白表達(dá)明顯降低，即DN小鼠腎皮質(zhì)iNOS的蛋白表達(dá)受BH4的調(diào)控。

2.4 小鼠腎皮質(zhì)中iNOS活性 DN組小鼠腎皮質(zhì)中iNOS活性明顯高于NS組小鼠（P＜0.05）；DAHP組iNOS活性明顯低于 DN組（P＜0.01）（Fig 3）。表明DN小鼠腎皮質(zhì)中iNOS活性明顯增高，當(dāng)BH4合成被抑制后，其活性明顯降低。

Fig 2 Expression of iNOS protein in renal cortex of mice

Fig 3 Activity of iNOS in renal cortex of mice

2.5 小鼠腎皮質(zhì)中NO水平 DN組NO水平明顯高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），DAHP組的NO水平明顯低于DN組（P＜0.05）（Fig 4）。表明DN小鼠腎皮質(zhì)中NO水平明顯增高；當(dāng)BH4合成被抑制后，NO生成減少。

Fig 4 NO level in renal cortex of mice

3 討論

糖尿病已經(jīng)成為全球流行疾病，其中2型糖尿病占糖尿病總體人群的95%以上［4］。DN是2型糖尿病最常見的并發(fā)癥，也是2型糖尿病患者的主要死亡原因之一。2型DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，至今尚未完全闡明。研究表明，長期的高血糖所致的細(xì)胞因子的表達(dá)失衡、氧化應(yīng)激以及由此引起的腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常在2型DN病程中起著非常重要的作用。

NO是一種重要的生理、病理性因子，它可擴(kuò)張血管，改變腎血流量、增加腎小球?yàn)V過率。目前國內(nèi)外學(xué)者對NO在DN中的利弊作用說法不一［5－8］。但是有大量研究表明，NO的過量生成是DN腎小球高內(nèi)壓、高灌注、高濾過的主要原因，直接促進(jìn)蛋白尿的產(chǎn)生，降低異常增高的NO的生成可有效減少尿蛋白的生成［7－8］。本研究也發(fā)現(xiàn)，DN小鼠腎皮質(zhì)中NO水平明顯增高，24 h尿量及尿蛋白也明顯增加。因此有效降低NO很可能是防治DN腎損害的新的切入點(diǎn)。

NO由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L-精氨酸而產(chǎn)生。NOS可分為兩大類，一類是構(gòu)成型一氧化氮合酶（constitutive NOS，cNOS），包括內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthases，eNOS）和神經(jīng)元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS），其產(chǎn)生的基礎(chǔ)NO主要參與正常的細(xì)胞內(nèi)信號傳遞；另一類是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS），只在細(xì)胞受到病理性刺激如微生物內(nèi)外毒素、氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)（TNF-α、IL-1）等的傷害后才表達(dá)［9］。且 iNOS一旦表達(dá)，其活性將持續(xù)數(shù)小時(shí)，產(chǎn)生的NO是eNOS和nNOS的100～1 000倍。此時(shí)，異常增高的NO可造成組織損傷［10］。大量研究證實(shí)，DN腎皮質(zhì)中eNOS蛋白表達(dá)明顯降低［11－12］。以 eNOS基因缺陷引起的eNOS表達(dá)降低已成為目前DN動(dòng)物模型之一［13－15］。而nNOS通常表達(dá)于神經(jīng)組織中，在腎皮質(zhì)中表達(dá)較少。因此，DN中異常增高的NO可能由iNOS的改變引起。為此，本研究檢測了iNOS的蛋白表達(dá)及酶活性。結(jié)果顯示：DN腎皮質(zhì)中iNOS蛋白表達(dá)及酶活性明顯增高，這可能是導(dǎo)致DN腎皮質(zhì)中NO異常增高的主要原因。

BH4作為NO合成的關(guān)鍵酶iNOS的必要輔因子，具有穩(wěn)定iNOS結(jié)構(gòu)、增加L-精氨酸和iNOS結(jié)合力等作用。目前有關(guān)BH4的研究多數(shù)關(guān)注于其缺陷造成的內(nèi)皮功能障礙，它的缺乏可產(chǎn)生多種疾?。?6－18］。但是近年來有學(xué)者表明，BH4的異常增高可引起線粒體功能障礙，從而造成活性氧的惡性循環(huán)，組織損害作用更強(qiáng)［19］。很多疾病如白癜風(fēng)、惡性貧血、神經(jīng)退行性疾病等與BH4的異常增高密切相關(guān)［19－21］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)2型DN小鼠腎皮質(zhì)中BH4水平明顯增高，iNOS表達(dá)明顯增強(qiáng)。當(dāng)采用GTPCHI（BH4合成的限速酶）抑制劑阻斷BH4合成后，2型DN小鼠腎臟中iNOS及NO含量明顯降低，這表明DN腎皮質(zhì)中增高的BH4可能是造成iNOS表達(dá)增強(qiáng)的主要原因。因此，有效保持BH4平衡對機(jī)體微環(huán)境的維持是非常重要的。減少2型DN腎皮質(zhì)中BH4的量可有效降低iNOS及NO的水平，進(jìn)而降低尿量及尿蛋白。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)DAHP組體重較DN組明顯下降，表明抑制BH4的合成可對2型DN的升高的體重有所改善。但是DAHP對血糖、肌酐沒有影響，這將值得我們進(jìn)一步探索其機(jī)制。

綜上，在自發(fā)性2型DN小鼠腎臟中，BH4含量明顯增加，進(jìn)而可使iNOS蛋白表達(dá)及酶活性增加，從而導(dǎo)致NO生成增多，這與2型DN的多尿及蛋白尿密切相關(guān)。因此，BH4很可能是防治2型DN的治療靶點(diǎn)之一，這值得我們進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Prabhakar SS.Role of nitric oxide in diabetic nephropathy［J］.Semin Nephrol，2004，24（4）：333－44.

［2］ 劉慰華，楊 冰，陶 莎，等.復(fù)方交泰丸對糖尿病大鼠腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2007，23（4）：559－60.

［2］ Liu W H，Yang B，Tao S，et al.Protective effects of Jiaotai pill complex presicription on renal injury in diabetic rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23（4）：559－60.

［3］ Zhai Y P，Lu Q，Liu Y W，et al.Over-production of nitric oxide by oxidative stress-induced activation of the TGF-beta1／PI3K／Akt pathway in mesangial cells cultured in high glucose［J］.Acta Pharmacol Sin，2013，34（4）：507－14.

［4］ 潘長玉，金文勝.2型糖尿病流行病學(xué) ［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2005，21（5）：5s1－5.

［4］ Pan C Y，Jin W S.Epidemiology of type 2 diabetes mellitus［J］.Chin J Endocrinol Met，2005，21（5）：5s1－5.

［5］ Mariee A D，Abd-Allah G M，El-Yamany M F.Renal oxidative stress and nitric oxide production in streptozotocin－induced diabetic nephropathy in rats：the possible modulatory effects of garlic（Allium sativum L.）［J］.Biotechnol Appl Biochem，2009，52（3）：227－32.

［6］ Imanishi M，Okada N，Konishi Y，et al.Angiotensin II receptor blockade reduces salt sensitivity of blood pressure through restoration of renal nitric oxide synthesis in patients with diabetic nephropathy［J］.J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，2013，14（1）：67－73.

［7］ Arya A，Yadav H N，Sharma P L.Involvement of vascular endothelial nitric oxide synthase in development of experimental diabetic nephropathy in rats［J］.Mol Cell Biochem，2011，354（1－2）：57－66.

［8］ Kuhad A，Chopra K.Attenuation of diabetic nephropathy by tocotrienol：involvement of NFkB ignalingpathway［J］.Life Sci，2009，84（9－10）：296－301.

［9］ Levine D Z.Hyperfiltration，nitric oxide and diabetic nephropathy［J］.Curr Hypertens Rep，2006，8（2）：153－7.

［10］Soskic SS，Dobutovic B D，Sudar E M，et al.Regulation of Inducible Nitric Oxide Synthase（iNOS）and its Potential Role in Insulin Resistance，Diabetes and Heart Failure［J］.Open Cardiovasc Med J，2011，5（1）：153－63.

［11］Balakumar P，Chakkarwar V A，Krishan P，et al.Vascular endothelial dysfunction：a tug of war in diabetic nephropathy［J］？Biomed Pharmacother，2009，63（3）：171－9.

［12］Li F，Wang C H，Wang JG，et al.Elevated tissue factor expression contributes to exacerbated diabetic nephropathy in mice lacking eNOSfed a high fat diet［J］.J Thromb Haemost，2010，8（10）：2122－32.

［13］Alpers C E，Hudkins K L.Mouse models of diabetic nephropathy［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2011，20（3）：278－84.

［14］Nakagawa T.A new mouse model resembling human diabetic nephropathy：uncoupling of VEGF with eNOS as a novel pathogenic mechanism［J］.Clin Nephrol，2009，71（2）：103－9.

［15］Zhang M Z，Wang S，Yang S，et al.Role of blood pressure and the renin-angiotensin system in development of diabetic nephropathy（DN）in eNOS－／－db／db mice［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2012，302（4）：F433－8.

［16］McNeill E，Channon K M.The role of tetrahydrobiopterin in inflammation and cardiovasculardisease［J］.Thromb Haemost，2012，108（5）：832－9.

［17］Fiege B，Blau N.Assessment of tetrahydrobiopterin（BH4）responsiveness in phenylketonuria［J］.J Pediatr，2007，150（6）：627－30.

［18］Welsh C，Enomoto M，Pan J，et al.Tetrahydrobiopterin deficiency induces gastroparesis in newborn mice［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2013，305（1）：G47－7.

［19］Cardaci S，F(xiàn)ilomeni G，Rotilio G，et al.p38MAPK／p53 signalling axis mediates neuronal apoptosis in response to tetrahydrobiopterin-induced oxidative stress and glucose uptake inhibition：implication for neurodegeneration［J］.Biochem J，2010，430（3）：439－51.

［20］Chavan B，Beazley W，Wood J M，et al.H（2）O（2）increases de novo synthesisof（6R）-L-erythro-5，6，7，8-tetrahydrobiopterin via GTPcyclohydrolase Iand its feedback regulatory protein in vitiligo［J］.J Inherit Met Dis，2009，32（1）：86－94.

［21］Deliconstantinos G，Villiotou V，Stavrides JC，et al.Nitric oxide and peroxynitrite production by human erythrocytes：a causative factor of toxic anemia in breast cancer patients［J］.Anticancer Res，1995，15（4）：1435－46.