鐘運(yùn)鳴，王素軍，曾 潔，黃麗花，程漩格，王桂香，臧林泉

甘草為豆科甘草屬植物甘草（glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根莖，有“國老”之美譽(yù)，是我國臨床上常用的中藥之一。甘草主要含三萜皂苷類和黃酮類。其中三萜皂苷類甘草酸（glycyrrhizin，GZ）含量最高，達(dá)6% ～14%，又名甘草甜素或甘草皂苷。近年來藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)甘草酸及其衍生物具有抗病毒、抗?jié)?、抗變態(tài)反應(yīng)、抗炎、抗腫瘤、保肝等多種生物活性［1］，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。但有報(bào)道證明甘草酸的口服生物利用度極低（3.04%），且大部分被代謝成甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）而產(chǎn)生高血壓、電解質(zhì)紊亂和假性醛固酮增多癥等副作用［2－3］。然而，甘草酸在大鼠體內(nèi)代謝時(shí)其腸肝各自發(fā)揮的作用，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。為此，本文首次嘗試采用大鼠原位腸－肝血管灌流模型，觀察甘草酸在大鼠腸道和肝臟中的處置，定量研究了甘草酸的吸收和代謝過程，并評價(jià)腸和肝這兩個(gè)體內(nèi)主要代謝器官在甘草酸代謝中的作用，從而為甘草酸的代謝靶點(diǎn)、藥理作用、不良反應(yīng)及臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和動物 LC-20 AD高效液相色譜儀器（日本島津）；4000Q TRAP串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（美國 Applied Biosystem公司）；SUPERT21高速冷凍離心機(jī)（美國Sorvail公司）；Milli-Q Gradient A10超純水器（美國Millipore公司）；501型超級恒溫箱（上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠）；HL-2恒流泵（上海滬西儀器廠）；甘草酸（批號：A0037），甘草次酸（批號：A0038），內(nèi)標(biāo)大黃素（批號：110756-200110）均購自中國藥品生物制品檢定所；色譜純甲醇、色譜純乙酸銨均購自美國Merck公司；其他試劑均為分析純。SPF級S-D大鼠（200～250 g），♀♂各半，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：scxk（粵）2008-0020。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 灌流液的配制 Krebs-Ringer NaHCO3緩沖液（K-R液）：0.22 g NaH2PO4、7.8 g NaCl、0.37 g CaCl2、0.22 g MgCl2、0.35 g KCl、1.37 g NaHCO3、3.0 g葡萄糖加蒸餾水定容至1 000 ml，調(diào)節(jié)pH至7.4。內(nèi)含3%右旋糖酐T-40、5% 牛血清白蛋白、10%洗過的大鼠紅細(xì)胞、0.02%地塞米松和0.004%去甲腎上腺素。

1.2.2 樣品處理和LC-MS／MS分析法 樣品分析方法參照文獻(xiàn)稍加改進(jìn)［4］。樣品處理：取樣品100 μl于1.5 ml EP管中，精密加入濃度為40μg·L－1內(nèi)標(biāo)的甲醇－水溶液（V∶V＝1∶1）300μl，渦旋振蕩混勻，離心（14 000 r·min－1，20℃）30 min，取上清10μl進(jìn)樣分析。液相條件：色譜柱采用 Phenomenex Luna C18柱（2.00 mm×50 mm，5μm），流動相為10 mmol·L－1乙酸銨水溶液－甲醇（V∶V＝95∶5），柱溫25℃，體積流量為 0.2 ml·min－1。質(zhì)譜檢測條件：采用ESI源負(fù)離子模式、多反應(yīng)檢測（MRM）模式進(jìn)行測定。檢測離子對分別為 m／z 821.4→351.3（甘草酸）、m／z469.4→425.8（甘草次酸）和 m／z 269→225（大黃素），毛細(xì)管電壓4 000 V，干燥氣溫度為330℃，噴霧壓力55 pis，駐留時(shí)間0.1 s。

1.3 模型的建立

1.3.1 大鼠原位單向腸－肝血管灌流模型（in situ single pass vascularly perfused rat intestine-liver model，IPIL） 參照我們課題組以前的實(shí)驗(yàn)方法［5－6］，實(shí)驗(yàn)前先用空白灌流液平衡系統(tǒng)15 min后，將含有甘草酸（5 mg·L－1）的灌流液恒定流速（10 ml·min－1）從上腸系膜動脈輸入，經(jīng)過肝靜脈流出，不形成循環(huán)。分別從門靜脈和肝靜脈每隔5 min吸取250μl灌流液置于1.5 ml EP管，持續(xù)1 h。膽汁每10 min為一個(gè)取樣點(diǎn)，同樣持續(xù)1 h。樣品處理后立即進(jìn)樣分析。實(shí)驗(yàn)手術(shù)圖解如Fig 1。

1.3.2 大鼠原位循環(huán)腸血管灌流模型（in situ circulated vascularly perfused rat intestine model，IPI）參閱我們課題組以前的模型［5］，灌流液從上腸系膜動脈流入，從門靜脈流出，使得腸血管與導(dǎo)管、儲液池構(gòu)成一閉合通路，固定插管后將體積流量提高至7.5 ml·min－1，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中用白熾燈加熱控制溫度。實(shí)驗(yàn)前先用空白灌流液平衡15 min并以此作為實(shí)驗(yàn)零點(diǎn)，于十二指腸給予2 mg甘草酸，分別于0、5、15、30、45、60、75、90、105、120min時(shí)從儲液池吸取250μl灌流液置于1.5 ml EP管中，在小腸入口和出口處引流收集腸腔液。每次取樣后立即補(bǔ)充同體積的空白灌流液（灌流總體積為100 ml）。樣品處理后立即進(jìn)樣分析。

Fig 1 Surgical cannulation for in situ vascularly perfused rat intestine-liver model

1.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用ˉx±s表示，腸穩(wěn)態(tài)提取率（steady state extraction ratio of the intestine，Ei）和肝穩(wěn)態(tài)提取率（steady state extraction ratio of the liver，Eh）分別用公式（1）和（2）計(jì)算；腸清除率（clearance ratio of the intestine，CLi）、肝清除率（clearance ratio of the liver，CLh）和腸肝總清除率（total clearances，CLt）分別用公式（3）、（4）和（5）計(jì)算；IPI中以灌流池中目標(biāo)化合物藥量的對數(shù)對取樣時(shí)間進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，根據(jù)回歸方程的斜率求算吸收速率Ka。

其中CSMA、CHV和CPV分別表示上腸系膜動脈、肝靜脈、門靜脈的穩(wěn)態(tài)藥物濃度，QPV和QHV分別表示門靜脈和肝靜脈的藥物灌流流速。

2 結(jié)果

2.1 甘草酸單次通過腸－肝血管灌流模型的動力學(xué)過程 單次通過大鼠腸－肝血管灌流后，甘草酸形成的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)過程如Fig 2。5 mg·L－1的甘草酸以10 ml·min－1流速通過上腸系膜動脈進(jìn)行灌流。當(dāng)流出產(chǎn)物形成穩(wěn)態(tài)后（30 min后），甘草酸在灌流液中的變化速率為零。經(jīng)過腸肝作用后，在肝靜脈流出液和門靜脈流出液中均只檢測到甘草酸而沒有檢測到甘草次酸。在膽管插管收集的膽汁中同樣只檢測到甘草酸，且甘草酸在膽汁中所占的比例較高（Fig 2），在60 min時(shí)甘草酸在膽汁中所占比例已達(dá)到85%（Fig 3）。灌流液和膽汁中流出的甘草酸均在30 min左右達(dá)到穩(wěn)態(tài)。

Fig 2 Disposition of GZ during its single passage through the perfusate rat intestine-liver model（ˉx±s，n＝6）

Fig 3 Cumulative biliary excretion ratio of unchanged GZ excreted in bile（ˉx±s，n＝6）

Tab 1 Metabolic parameters of GZ in the once-through vascularly perfused rat intestine-liver preparation（ˉx±s，n＝6）

2.2 甘草酸大鼠十二指腸給藥后腸血管灌流模型循環(huán)灌流的處置過程 樣品處理后經(jīng)LC-MS／MS測定如Fig 4。上述色譜系統(tǒng)中，無內(nèi)源性物質(zhì)干擾灌流液，檢測物色譜行為較佳，甘草酸、甘草次酸和大黃素保留時(shí)間分別約為2.74、3.56和3.12 min。甘草酸大鼠十二指腸給藥后及其代謝物甘草次酸在灌流液中的動力學(xué)曲線如Fig 5。2 mg甘草酸十二指腸給藥后，0～80 min時(shí)甘草酸吸收較快，80 min后開始趨于平穩(wěn)；120 min時(shí)的濃度為（0.42±0.06）mg·L－1，經(jīng)計(jì)算得出甘草酸吸收量為2.01%（120 min時(shí)灌流液中甘草酸含量與腸道給藥量的比值）。代謝產(chǎn)物甘草次酸在灌流5 min后能檢測到，甘草次酸20～80 min上升較快，120 min時(shí)濃度為（8.45±0.76）mg·L－1。

由于甘草酸在循環(huán)灌流系統(tǒng)中僅僅通過代謝而消除，甘草酸和其代謝產(chǎn)物均未離開系統(tǒng)。儲液池中甘草酸及其產(chǎn)物的濃度－時(shí)間動力學(xué)曲線具有靜注單室模型和血管外途徑單室模型的動力學(xué)特征，故我們選用藥動學(xué)計(jì)算軟件（3P97）對甘草酸和產(chǎn)物甘草次酸的消長動力學(xué)過程進(jìn)行擬合，曲線的實(shí)測值與擬合值間有良好的相關(guān)性（R＞0.9），由此得到的主要藥動學(xué)參數(shù)（Tab 2）。

Tab 2 Kinetic parameters of GZ and its metabolite（GA）in the intestinal perfusion（ˉx±s，n＝6）

Fig 4 LC-MS／MSchromatograms of perfusion samples

3 討論

大鼠原位腸－肝血管灌流模型具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如保持了實(shí)驗(yàn)中腸肝的完整性，同時(shí)避免了藥物的廣泛分布、可分析各種外加因素對藥物代謝的影響、將腸灌流和肝灌流結(jié)合一起，不僅可以評價(jià)腸肝的共同作用亦可評價(jià)各自作用亦可研究腸道菌群和酶對藥物代謝的影響。因而這一模型在藥物的首過效應(yīng)、吸收和代謝等研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

Fig 5 Disposition of GZ during its recirculating intestinal perfusion after intraduodenal administration（ˉx±s，n＝6）

本文在前期工作［5－6］的基礎(chǔ)上利用該模型研究甘草酸在大鼠體內(nèi)的代謝，并評估了腸肝在甘草酸代謝中的作用。在單向腸－肝血管灌流實(shí)驗(yàn)中，甘草酸的穩(wěn)態(tài)肝提取率（28.0±3.0）%，是穩(wěn)態(tài)腸提取率（4.2±0.6）%的7倍，且在肝靜脈流出液和門靜脈流出液均只檢測到甘草酸的存在，這些表明上腸系膜動脈給予甘草酸后，甘草酸未在肝臟中被代謝。由于甘草酸在肝臟中不是被代謝成甘草次酸，所以甘草酸的肝首過消除不是造成其生物利用度低的主要原因，而是因?yàn)槟c道菌群對其的大量代謝。同時(shí)收集的膽汁中我們檢測到大量的甘草酸，1 h后甘草酸在膽汁中所占比例已達(dá)到85%（Fig 3），說明從門靜脈進(jìn)入的甘草酸很大一部分被分泌到膽汁中。從而佐證了甘草酸從門靜脈注射給藥后很難在系統(tǒng)靜脈血中檢測到甘草次酸［7－8］。在循環(huán)腸血管灌流中，十二指腸給予2 mg甘草酸后，通過檢測儲液池中的灌流液中發(fā)現(xiàn)甘草酸與甘草次酸同時(shí)存在（Fig 4），計(jì)算得出甘草酸的一級吸收速率常數(shù)和消除半衰期β分別為（0.33±0.06）min－1和（2.40±0.31）min。有研究表明［9］甘草次酸的一級吸收速率常數(shù)在（1.53～1.87）min－1間且甘草次酸的表觀滲透系數(shù)是甘草酸的10倍以上。上述腸血管灌流實(shí)驗(yàn)中甘草酸的吸收速率常數(shù)小于甘草次酸吸收速率常數(shù)參考值，而且灌流120 min后，甘草酸的吸收量僅為2.01%，表明甘草酸在腸道吸收差代謝快，大部分轉(zhuǎn)變?yōu)楦什荽嗡?。通過檢測腸腔液體，發(fā)現(xiàn)存在大量甘草次酸，進(jìn)一步說明甘草酸在腸道菌群或腸道酶存在下被大量代謝為甘草次酸，這結(jié)果與文獻(xiàn)相符合［10－11］。

綜上所述，原位腸－肝血管灌流模型揭示了口服甘草酸后，甘草酸很難被吸收而且主要在腸道中被菌群或酶代謝。同時(shí)原位腸－肝灌血管流模型在研究藥動學(xué)方面具有很大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。不僅可以評價(jià)機(jī)體對藥物的首過效應(yīng)，還可以了解腸道、肝臟在這一過程中的作用及各自的貢獻(xiàn)度。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Ming L J，Yin A C.Therapeutic effects of glycyrrhizin acid［J］.Nat Prod Commun，2013，8（3）：415－8.

［2］ Isbrucker R A，Burdock G A.Risk and safety assessment on the consumption of Licorice root（glycyrrhiza sp），its extract and powder as a food ingerdient，with emphasis on the pharmacolocy and toxicology of glycyrrhizin［J］.Requl Toxicol Pharmacol，2006，46（3）：167－92.

［3］ 楊錦南，朱 明.甘草次酸及其衍生物藥理作用研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，1997，13（2）：110－4.

［3］ Yang J N，Zhu M.Progresses in pharmacological effects of glycyrrhetinic and its derivatives［J］.Chin Pharmacol Bull，1997，13（2）：110－4.

［4］ Wang Y，Xu C，Wang P，et al.Pharmacokinetic comparison of different combination of Shaoyao-Gancao-Decoction in rat：simultanecous determination of ten active constituents by HPLC-MS／MS［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2013，1（932）：76－87.

［5］ 王素軍，阮金秀，張振清，等.大鼠原位腸－肝灌流模型研究小補(bǔ)心湯總黃酮體內(nèi)效應(yīng)物質(zhì)［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（6）：885－6.

［5］ Wang S J，Ruan J X，Zhang Z Q，In vivo bioactive substance study of Xiao Bu Xin Tang tptal flavoniods extracts by in suit perfused rat intestine-liver moldel［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（6）：885－6.

［6］ 莫李立，王素軍，楊本坤.阿魏酸在Caco-2細(xì)胞模型的通透性及其在大鼠體內(nèi)吸收特征性研究［J］.中草藥，2012，5（43）：947－51.

［6］ Mo L L，Wang SJ，Yang B K.Permeability of ferulic acid in Caco-2 cell model and its absorption properties in rats in vivo［J］.Chin Tradit Herb Drugs，2012，5（43）：947－51.

［7］ Ploeger B，Mensinga T，Sips A，et al.The pharmacokinetics of glycyrrhizic acid evaluated by physiologically based pharmacokinetic modeling［J］.Drug Metab Rev，2001，33（2）：125－47.

［8］ 黎國富，楊 勁，華小懿，等.Ussing Chamber模型研究甘草酸二銨經(jīng)大鼠腸粘膜的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝［J］.中國中藥雜志，2010，35（17）：2261－5.

［8］ Li G F，Yang J，Hua X Y，et al.Tranmembrance transport and metablosim of diammonium glycyrrhizinateacross rat small intestine in Ussing Chamber［J］.Chin J Chin Mat Med，2010，35（17）：2261－5.

［9］ Ishida S，Sakiya Y，Taira Z.Disposition of glycyrrhizin in the perfused Intestine of rats［J］.Biol Pharm Bull，1994，17（12）：960－9.

［10］Ishida S，Sakiya Y，Ichikawa T，Awazu S.Pharmacokinetics of glycyrrhetic acid，a major metabolite of glycyrrhizin，in rats［J］.Chem Pharm Bull，1989，37（9）：210－7.

［11］宋 麗，徐璐揚(yáng)，張 寧.大鼠腸內(nèi)微生物對甘草酸代謝的影響［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2008，42（9）：70－2.

［11］Song L，Xu L Y，Zhang N.Effects of intestine bacteria on metabolish of glycyrrizin in rat［J］.Shanghai J Tradit Chin Med，2008，42（9）：70－2.