吳麗賢，黃立森，陳顯凌，柯 方，鄭 鳴，許建華

（1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理系，福建福州 350004；2.福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，福建福州 350004；3.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥化系，福建福州 350108；4.福建醫(yī)科大學(xué)人體解剖與組織胚胎學(xué)系，福建福州 350108；5.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，福建福州 350001；6.福建省血液病研究所，福建 福州 350001）

急性髓性白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）［1］是源于造血干細(xì)胞的克隆性惡性疾病。以骨髓異常的原始細(xì)胞及幼稚細(xì)胞大量增殖，抑制正常造血，廣泛浸潤肝、脾、淋巴結(jié)等臟器為主要特征。其起病急、惡性程度高，如得不到及時診治，生存期短。臨床針對AML的治療，以化療為主，通過有效的化療，不少患者病情得以緩解，但AML的復(fù)發(fā)和耐藥問題比較突出［2］，因此繼續(xù)研發(fā)新的抗AML藥物，可以提高AML的治愈率和解決AML的復(fù)發(fā)和耐藥問題。

Nov（novobiocin）是香豆素類抗生素的代表藥物，本課題組前期研究表明，Nov具有抑制急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60的增殖能力，但其活性較低，半數(shù)抑制率 IC50為 356.4μmol·L－1［3］，為了提高 Nov的抑制急性粒細(xì)胞白血病的活性，本課題組合成了一系列Nov的衍生物，通過體外活性篩選，發(fā)現(xiàn)XN4具有明顯的抑制AML細(xì)胞的增殖，但具體的作用機(jī)制不明。因此本課題組致力于通過研究XN4與DNA損傷的關(guān)系來探討其抑制AML增殖的作用機(jī)制，為合成活性更強(qiáng)的Nov衍生物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 HL-60細(xì)胞和KG1α細(xì)胞購置于中科院上海細(xì)胞庫，按其細(xì)胞庫參考要求進(jìn)行培養(yǎng)。XN4由本課題合成和純化，純度為0.96，溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配成儲存液 100 mmol·L－1于－20℃?zhèn)溆?，使用前解凍，用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購于Hyclone公司。MTT購置于美國Sigma公司，用磷酸鹽緩沖液（PBS）（0.01 mol·L－1，pH值 7.4）稀釋成 5 g·L－1存儲液，分裝 ，－20℃避光儲存；r-H2AX、p-ATM、Parp、cleaved Caspase-3、CDK2、Cyclin E1單克隆抗體均購置于Cell Signaling Technology公司 ，βactin單克隆抗體和羊抗鼠、羊抗兔IgG-HRP二抗購于凱基生物公司。ECL Western blot Detection System超強(qiáng)發(fā)光底物購置于Signalway Antibody公司。BCA蛋白定量試劑盒和流式凋亡檢測試劑盒均購自瑞士Roche公司。RNA酶和碘化丙啶（PI）購于美國Sigma公司。NAC和ROS檢測試劑盒購置于碧云天公司。Image station 4000MM成像系統(tǒng)購于柯達(dá)公司；BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購于BD公司，電泳、轉(zhuǎn)膜儀為BIORAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) AML細(xì)胞采用含10%的胎牛血清 RPMI 1640，青霉素（100 000 IU·L－1）和鏈霉素（50 mg·L－1），在 37℃、5%的 CO2孵育箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗。

1.2.2 XN4對AML細(xì)胞增殖的抑制作用 收集對數(shù)期生長的AML細(xì)胞，按每孔10 000個細(xì)胞體積為200μl種植于96孔培養(yǎng)板，不同濃度的XN4處理48 h，并設(shè)置對照組（不加藥物），空白組（只加培養(yǎng)基，無細(xì)胞），每組設(shè)3個副孔，48 h后每孔加入5 g·L－1的MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，800×g離心5 min，棄上清，加入150μl DMSO振蕩10 min，用全自動酶標(biāo)儀（Therm公司）檢測570 nm處的吸光度（OD）值，結(jié)果采用GraphPad Prism 5軟件分析，并繪制相應(yīng)的抑制率－對數(shù)濃度曲線，計算藥物的IC50。

1.2.3 XN4對AML細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 通過使用氧化敏感的熒光探針（DCFH-DA）檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的水平［4］。不同濃度的XN4處理細(xì)胞24 h，5 mmol·L－1NAC預(yù)先處理AML細(xì)胞1 h再加上6 μmol·L－1XN4處理24 h。收集細(xì)胞，用 PBS洗滌兩次，37℃下用10μmol·L－1的 DCFH-DA孵育細(xì)胞20 min（根據(jù)產(chǎn)品說明）。DCFH-DA被細(xì)胞內(nèi)的非特異性酯酶脫去乙酰基，被ROS氧化成熒光性化合物DCF，流式細(xì)胞儀檢測DCF熒光強(qiáng)度。

1.2.4 XN4對AML細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的影響 取對數(shù)生長期AML細(xì)胞，10μmol·L－1的 BrdU預(yù)處理30 min，不同濃度的XN4處理細(xì)胞24 h，5 mmol·L－1NAC預(yù)先處理AML細(xì)胞1 h再加上6μmol·L－1XN4處理24 h，收集細(xì)胞，以800×g離心5分鐘，棄上清，破膜，DNase處理 1 h，anti-BrdU，anti-H2AX，anti-cleaved parp熒光探針室溫孵育20 min，按試劑盒說明操作。轉(zhuǎn)入到流式管中，上機(jī)檢測。

1.2.5 XN4對AML細(xì)胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期的AML細(xì)胞，不同濃度的XN4處理細(xì)胞24 h，5 mmol·L－1NAC預(yù)先處理AML細(xì)胞1 h再加上6 μmol·L－1XN4處理48 h，收集細(xì)胞，800×g離心 5 min，冷PBS重懸洗滌細(xì)胞兩次，用500μl含有分別含有5μl Annxin V-FITC和5μl PI的Binding buffer重懸混勻細(xì)胞，室溫避光孵育15 min，轉(zhuǎn)移入流式管中，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.2.6 XN4對AML細(xì)胞周期的影響 取對數(shù)生長期的AML細(xì)胞，不同濃度的XN4處理細(xì)胞，5 mmol·L－1NAC預(yù)先處理AML細(xì)胞1 h再加上6μmol·L－1XN4，37℃培養(yǎng) 48 h；收集細(xì)胞，800×g離心 5 min；用冷的PBS重懸洗滌細(xì)胞1次，再用0.5 ml冷PBS重懸細(xì)胞，并將其緩慢的滴加4.5ml預(yù)冷75%乙醇中，－20℃冰箱中放置過夜；800×g離心5 min，棄去乙醇，用PBS洗滌1次，用0.5 ml含有50 mg·L－1RNA酶和50 mg·L－1碘化丙啶的 PBS重懸細(xì)胞，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。實(shí)驗結(jié)果采用Modifit軟件進(jìn)行分析。

1.2.7 XN4對AML細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期的AML細(xì)胞，不同濃度的XN4處理48 h，收集裂解細(xì)胞，蛋白定量，98℃蛋白變性，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉，相應(yīng)一抗過夜孵育，TBST洗滌3次，每次10 min，室溫下二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，用 ECL Western blot Detection System超強(qiáng)發(fā)光底物在Image station 4000MM成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 實(shí)驗數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，實(shí)驗獨(dú)立重復(fù)3次，采用One-Way analysis of variance統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 XN4抑制AML細(xì)胞的增殖 不同濃度的XN4處理AML細(xì)胞48h后，MTT法檢測，結(jié)果采用GraphPad Prism 5軟件分析見（Fig 1），隨著藥物濃度的增加，XN4抑制HL-60和KG1α細(xì)胞增殖的能力逐漸增強(qiáng)，IC50分別為（2.79±0.15）μmol·L－1和（2.76±0.20）μmol·L－1，見 Fig 1。

Fig 1 Proliferation inhibition of AML with XN4 treatments（ˉx±s，n＝3）

2.2 XN4明顯增加AML細(xì)胞內(nèi)ROS水平 ROS能夠氧化DCFH-DA成熒光性化合物DCF，因此檢測DCF的熒光強(qiáng)度可以間接反映ROS的水平［5］。不同濃度的XN4處理AML細(xì)胞24 h后，ROS檢測表明XN4能明顯增加AML細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，5 mmol·L－1NAC預(yù)先處理AML細(xì)胞1 h能逆轉(zhuǎn)XN4誘導(dǎo)的ROS的增加（Fig 2）。

2.3 XN4誘導(dǎo)AML細(xì)胞DNA的損傷 r-H2AX是DNA損傷的一個靈敏性標(biāo)志物，在DNA損傷時，其會聚集在 DNA損傷處形成焦點(diǎn)（Foci）［6］，招募DNA損傷應(yīng)答的相關(guān)蛋白。本實(shí)驗的結(jié)果表明XN4能明顯增加AML細(xì)胞中r-H2AX的表達(dá)，而5 mmol·L－1NAC預(yù)先處理1 h能逆轉(zhuǎn) XN4對 r-H2AX的改變（Fig 3）。

Fig 2 Effect of Nov on intracellular ROSwith XN4 treatments（xˉ±s，n＝3）1：Control；2：XN4 1.5μmol·L－1；3：XN4 3μmol·L－1；4：XN4 6μmol·L－1；5：NAC 5 mmol·L－1；6：NAC 5 mmol·L－1＋XN4 6μmol·L－1Fig 2 Demonstrates that XN4 could significantly increase the level of intracellular ROS，5mmol·L－1NACpre-treating AML for 1h could reverse this effect.**P＜0.01 vs control group.

Fig 3 XN4 induced DNA damage to AML cells（ˉx±s，n＝3）1：Control；2：XN4 1.5μmol·L－1；3：XN4 3μmol·L－1；4：XN4 6μmol·L－1；5：NAC 5 mmol·L－1；6：NAC 5 mmol·L－1＋XN4 6μmol·L－1Fig 3 obviously shows that XN4 could increase the level of r-H2AX，5mmol·L－1 NAC pre-treating AML for 1h could decrease this effect.**P＜0.01 vs control group.

2.4 XN4增加AML細(xì)胞周期凋亡 不同濃度的XN4處理 AML細(xì)胞48 h，PI和 Annexin V-FITC雙染［7］流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果表明，XN4能夠明顯增加細(xì)胞的凋亡率，當(dāng)預(yù)先采用5 mmol·L－1NAC處理細(xì)胞1 h，XN4誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡作用明顯減弱（Fig 4）。

2.5 XN4誘導(dǎo)AML細(xì)胞周期S期阻滯 不同濃度的XN4處理AML細(xì)胞24和48h，PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，結(jié)果表明隨著XN4藥物濃度的增加，處于細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例明顯增加，細(xì)胞周期阻滯在S期（Fig 5）。

2.6 XN4對AML蛋白表達(dá)的影響 不同濃度的XN4處理AML細(xì)胞48 h，蛋白免疫印跡結(jié)果表明XN4能明顯增加r-H2AX、ATM的表達(dá)以及Parp和Caspase-3的切割，而降低CDK2和Cyclin E1的表達(dá)（Fig 6）。

3 討論

AML是白血病的主要類型，具有起病急、惡性程度高、好發(fā)于成人和兒童［8］。臨床常用化學(xué)藥物療法如阿糖胞酐、環(huán)磷酰胺、長春新堿、柔紅霉素等，這些藥物雖然療效尚可，但毒副作用大。

Nov作為一種抗生素也具有體外抗HL-60細(xì)胞及毒性低的優(yōu)點(diǎn)，但活性低，IC50大。本課題組合成的新生霉素衍生物XN4在體外也表現(xiàn)出明顯的抗AML細(xì)胞增殖的作用，并較其母藥活性提高了近100多倍。本課題組通過前期對Nov的研究，表明Nov通過激活細(xì)胞內(nèi)ROS，誘導(dǎo)DNA的損傷，從而發(fā)揮抑制慢性粒細(xì)胞白血病K562和K562／G01的增殖作用。

Fig 4 XN4 increases the apoptosis ratio of AML cells（ˉx±s，n＝3）1：Contol；2：XN4 1.5μmol·L－1；3：XN4 3μmol·L－1；4：XN4 6μmol·L－1；5：NAC 5 mmol·L－1；6：NAC 5 mmol·L－1＋XN4 6μmol·L－1.PI and Annexin v-FITCdouble staining were used to examine the effect of XN4 on cell apoptosis.The data shows that XN4 could increase the apoptotic ratio of AML cells after XN4 treatment for 48h.5mmol·L－1NACpre-treating AML for 1h could decrease this effect.**P＜0.01 vs control group.

Fig 5 XN4 induced AML cell cycle S phase arrest

Fig 6 XN4 influences the intracellular proteins expression

ROS是細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性氧自由基，如超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫等［9］，外環(huán)境的理化因素、化療藥物和細(xì)胞自身的代謝會導(dǎo)致ROS的激活，激活的ROS具有破壞生物體細(xì)胞膜和重要細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能，如破壞線粒體，斷絕細(xì)胞的能源；毀壞溶酶體，使細(xì)胞自溶；損傷DNA，導(dǎo)致基因突變和細(xì)胞凋亡［10］。H2AX是維持 DNA結(jié)構(gòu)的組蛋白，在 DNA損傷時能夠磷酸化成 r-H2AX，招募DNA損傷修復(fù)應(yīng)答相關(guān)蛋白，在DNA斷裂處形成焦點(diǎn)（Foci），因此r-H2AX成為檢測DNA損傷的一個靈敏的標(biāo)志物（biomarker）［11］，Parp是執(zhí)行 DNA損傷修復(fù)的一個重要功能蛋白，被切割成Cleaved Parp時失活。本實(shí)驗結(jié)果表明XN4能夠激活細(xì)胞內(nèi)ROS，增加H2AX的磷酸化水平，誘導(dǎo)DNA的損傷；并且XN4能夠促進(jìn)Parp的切割，抑制DNA的損傷修復(fù)，而抗氧化劑NAC能夠通過抑制ROS的激活，逆轉(zhuǎn)XN4誘導(dǎo)DNA損傷。

眾所周知，細(xì)胞本身具有應(yīng)對DNA損傷修復(fù)的能力［12］，當(dāng)感知DNA損傷時，激活DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，為DNA損傷修復(fù)提供時間；誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，清除損傷細(xì)胞。CDK2和Cyclin E1是維持細(xì)胞周期S期向 G2／M轉(zhuǎn)換的重要分子［13］，表達(dá)減少影響細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞阻滯于S期。Caspase-3是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)的重要分子，被切割而活化，執(zhí)行細(xì)胞程序化死亡功能。XN4通過抑制CDK2和Cyclin E1的表達(dá)水平，使細(xì)胞阻滯在S期，并且通過增加Caspase-3的切割，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

4 結(jié)論

XN4通過激活ROS，誘導(dǎo)HL-60及KG1α細(xì)胞DNA的損傷，抑制CDK2和Cyclin E1的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞S期阻滯期增殖，促進(jìn)Parp和Caspase-3的切割，抑制DNA損傷修復(fù)功能和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制AML細(xì)胞增殖。

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