韓靜文，李 俊，黃 成，陳昭琳，胡婷婷

梔子柏皮湯始載于漢代名醫(yī)張仲景的《傷寒論》，由梔子、黃柏和炙甘草3味藥材組成，用于治療濕熱發(fā)黃、熱重于濕之陽黃癥［1］。梔子苷是梔子的主要有效成分，藥典（2010版）規(guī)定梔子苷為梔子的質(zhì)量控制指標(biāo)，具有保肝利膽、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、抗焦慮等作用［2］。然而，有研究表明，梔子苷口服生物利用度較差［2－3］，限制了其在臨床的應(yīng)用。為了提高梔子苷的口服生物利用度，我們有必要對其吸收和轉(zhuǎn)運特性進(jìn)行研究，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討梔子柏皮湯對其吸收的影響。

藥物的跨膜轉(zhuǎn)運是藥物體內(nèi)過程的前提，也是其發(fā)揮活性所必需，貫穿藥物在體內(nèi)的整個過程，研究藥物的跨膜轉(zhuǎn)運對提高藥物的生物利用度和藥效具有重要意義。目前應(yīng)用最廣泛的體外藥物吸收模型是人結(jié)腸癌細(xì)胞（Caco-2）和馬丁達(dá)比犬腎上皮細(xì)胞（Madin-Darby canine kidney，MDCK）模型，兩者在研究藥物的吸收滲透方面具有良好的相關(guān)性，但相比于Caco-2細(xì)胞，MDCK具有生長快的優(yōu)勢，形成完整單層僅5 d左右，細(xì)胞亞型少，膜表面受體的種類和數(shù)量均大大少于Caco-2細(xì)胞，這種簡單性使MDCK細(xì)胞模型的實驗結(jié)果重現(xiàn)性高［4－5］。目前利用MDCK細(xì)胞模型對梔子苷及梔子柏皮湯中梔子苷的轉(zhuǎn)運研究還未見報道。

本實驗建立了MDCK細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運模型，以HPLC為檢測方法來考察梔子苷的轉(zhuǎn)運方式，同時比較梔子苷與梔子柏皮湯中梔子苷吸收轉(zhuǎn)運的差異。

1 材料

1.1 藥品與試劑 梔子苷（批號：110749-200714）、芍藥苷（內(nèi)標(biāo)，批號：110736-200320）、鹽酸維拉帕米（批號：100223-200102）對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；梔子、黃柏和炙甘草均購自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，質(zhì)量符合中國藥典（2010版）標(biāo)準(zhǔn)；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；冰乙酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水為雙蒸水；Hank’s溶液（HBSS，碧云天公司）；MEM培養(yǎng)液（Hyclone公司）；EDTA（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）。

1.2 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Neofuge 23R臺式高速冷凍離心機（力康發(fā)展有限公司）；FA2004N分析天平（上海精密科學(xué)有限公司）；ROIS5 30L超純水機（美國Millipore公司）；懸掛式培養(yǎng)皿（Millicell-CPI）；細(xì)胞電壓電阻儀（Millicell-ERS）（美國Millipore公司）；Napco-6100型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國杜邦公司）；MK3型酶標(biāo)儀（荷蘭雷勃公司）。

1.3 細(xì)胞株 MDCK細(xì)胞株（American Type Culture Collection，ATCC）由浙江工業(yè)大學(xué)宋必衛(wèi)教授惠贈。

2 方法

2.1 細(xì)胞單層模型的建立 MDCK細(xì)胞按密度5×104·cm－2接種到 24孔 Millicell CPI中，在 A側(cè)加入含10%FBS的MEM培養(yǎng)液0.2 ml，B側(cè)加入0.8 ml，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用Millicell-ERS測跨細(xì)胞單層膜電阻（TEER），選取TEER＞140Ω·cm2的細(xì)胞單層用于轉(zhuǎn)運實驗［5］。

2.2 湯劑的制備 按梔子柏皮湯方中梔子、黃柏、炙甘草重量比10∶6∶3稱取藥材，混合碾碎后，蒸餾水煮沸，20 min，提取3次，合并濾液，20層紗布濾過，得上清液，濃縮至合適體積，即得梔子柏皮湯。取適量用HBSS稀釋，離心，過濾，經(jīng)HPLC分析，湯劑中梔子苷的含量為3.38 g·L－1。

2.3 色譜條件 色譜柱為Shimadzu Shim-pack VPODScolumn（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇－0.1%冰乙酸水溶液（32∶68）；流速：1.0 ml·min－1；檢測波長：238 nm；進(jìn)樣量：20μl；柱溫：30℃。

2.4 樣品處理 取樣品溶液100μl，加入內(nèi)標(biāo)芍藥苷溶液20μl，渦旋，12 000 r·min－1離心 3 min，吸取上清液，進(jìn)樣。

2.5 溶液的配制 精密稱取梔子苷和芍藥苷對照品1 mg，用甲醇定容在10 ml容量瓶中，得到梔子苷和芍藥苷儲備液0.1 g·L－1。

2.6 細(xì)胞毒性試驗

2.6.1 溶液的配制 精密稱取梔子苷對照品適量，用含10%FBS的MEM培養(yǎng)液溶解并稀釋成系列溶液，使?jié)舛确謩e為 1、10、20、40、80、100、200 mg·L－1，量取梔子柏皮湯適量，稀釋成含梔子苷濃度同上的系列溶液。

2.6.2 MTT法 將細(xì)胞以每孔5×103個的密度接種至96孔板中，每孔加入0.2 ml細(xì)胞懸液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，吸除每孔培養(yǎng)液，給藥孔分別加入“2.6.1”項下系列溶液各200 μl，空白對照孔不加藥，調(diào)零孔不加細(xì)胞，只加含10%FBS的MEM培養(yǎng)液，每個實驗組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng) 24 h后，每孔加入5 g·L－1的 MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)結(jié)束后，吸去上清液，加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在492 nm處測其吸光度（A），結(jié)果用存活率（IC）表示：IC／% ＝（實驗組 A均值－調(diào)零孔A均值）／（對照孔A均值－調(diào)零孔A均值）×100%。選取細(xì)胞存活率≥90%的藥物濃度用于轉(zhuǎn)運實驗。

2.7 藥物的跨膜轉(zhuǎn)運實驗

2.7.1 轉(zhuǎn)運實驗方法 取符合轉(zhuǎn)運條件的細(xì)胞單層，HBSS清洗2遍，37℃培養(yǎng)30 min，測 TEER后加藥。CPI的 A側(cè)（腸腔側(cè)，Apical）到 B側(cè)（基底側(cè)，Basolateral）的轉(zhuǎn)運（吸收實驗）：A側(cè)分別加入0.2 ml不同濃度的藥物溶液，B側(cè)加入0.8 ml HBSS，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于 30、60、90、120 min時間點從B側(cè)取樣0.1 ml，并補充同體積空白HBSS。CPI的B側(cè)到A側(cè)的轉(zhuǎn)運（分泌實驗）：B側(cè)分別加入0.8 ml不同濃度的藥物溶液，A側(cè)加入0.2 ml HBSS，其他如上所述，每組試驗平行3份，試驗結(jié)束時再測TEER，以確定細(xì)胞單層沒有被損傷而影響實驗結(jié)果。樣品按“2.4”項處理后進(jìn)行含量測定，求累積透過量，并計算表觀滲透系數(shù)（Papp）。Papp＝（dQ／dt）／（A×Co），式中 dQ／dt代表單位時間藥物轉(zhuǎn)運量（μg·s－1）；A代表 Millicell膜面積，本實驗中 A為0.33 cm2；C0代表藥物初濃度（mg·L－1）。

2.7.2 梔子苷的雙向跨膜轉(zhuǎn)運 精密稱取梔子苷1 mg，用HBSS溶解稀釋至濃度分別為20、40、80 mg·L－1，作為藥物溶液，按“2.7.1”項方法操作。

2.7.3 P-gp抑制劑維拉帕米對梔子苷跨膜轉(zhuǎn)運的影響 配制50μmol·L－1的維拉帕米溶液和40 mg·L－1的梔子苷溶液，先吸取適量維拉帕米溶液加至CPI膜的A側(cè)，置培養(yǎng)箱中孵育30 min，再吸除A側(cè)的維拉帕米溶液，同時加HBSS蕩洗細(xì)胞表面2次，最后加上述梔子苷溶液于A側(cè)，按“2.7.1”項方法操作。

2.7.4 EDTA對梔子苷跨膜吸收的影響 配制2.5 mmol·L－1的 EDTA溶液和40 mg·L－1的梔子苷溶液，然后按“2.7.3”項操作，將維拉帕米換為EDTA。

2.7.5 梔子柏皮湯中梔子苷的吸收 量取梔子柏皮湯適量，用HBSS稀釋至含梔子苷濃度分別為20、40、80 mg·L－1，作為藥物溶液，按“2.7.1”項中 A側(cè)到B側(cè)轉(zhuǎn)運實驗方法操作。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 測定值以ˉx±s表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性試驗 空白HBSS、HBSS加梔子苷和內(nèi)標(biāo)對照品、梔子苷轉(zhuǎn)運樣品和梔子柏皮湯轉(zhuǎn)運樣品的色譜圖見Fig 1，空白HBSS不干擾測定。

3.1.2 線性關(guān)系的考察 取梔子苷貯備液適量，用HBSS稀釋并配制成濃度分別為 0.25、0.5、1、5、10、20、40 mg·L－1的對照品溶液，按“2.4”項下方法處理后進(jìn)樣，測定峰面積，以梔子苷濃度為橫坐標(biāo)，梔子苷的與內(nèi)標(biāo)的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y＝0.5010X＋0.0463，r＝0.9999。結(jié)果顯示，梔子苷在質(zhì)量濃度0.25～40 mg·L－1內(nèi)與峰面積之間呈良好線性關(guān)系。

3.1.3 精密度與準(zhǔn)確度 取梔子苷貯備液適量，用HBSS配制成低、中、高 3個濃度（0.5、5、20 mg·L－1）的質(zhì)控樣品（n＝5），按“2.4”項下方法處理后進(jìn)樣，1 d內(nèi)連續(xù)測定5次，計算日內(nèi)精密度，連續(xù)測定5 d，計算日間精密度，結(jié)果日內(nèi)RSD值分別為1.90%、1.35%、1.69%、日間 RSD值分別為2.96%、1.86%、1.51%，符合小于10%的要求。準(zhǔn)確度分別為94.83%、103.56%、99.60%，符合85%～115%的要求。

3.1.4 穩(wěn)定性試驗 同上配制低、中、高濃度（0.5、5、20 mg·L－1）的質(zhì)控樣品（n＝5），對在室溫放置24 h，在－20℃條件下存放15 d的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，按“2.4”項下方法處理后進(jìn)樣，測定梔子苷的濃度，RSD值分別為 4.86%、2.56%、2.12%；2.78%、1.75%、2.01%，均小于5%，符合要求。

Fig 1 HPLC chromatograms of blank HBSS（A），HBSSwith geniposide and paeoniflorin（B），geniposide samples（C），Zhizi Bopi Decoction samples（D）

Fig2 Cumulativeamount-timecurveofgeniposide inMDCKcellmodel（A→BandB→A，ˉx±s，n＝3）

3.2 梔子苷的雙向跨膜轉(zhuǎn)運 Fig 2是不同濃度的梔子苷在MDCK模型上由A側(cè)到B側(cè)和由B側(cè)到A側(cè)的累積透過量隨時間變化的曲線，由圖可知梔子苷的累積透過量隨時間延長逐漸增加，且與給藥室的初始濃度呈正相關(guān)。雙向轉(zhuǎn)運的Papp值見Tab 1，由 Tab1可知，梔子苷的 Papp（B－A）與 Papp（A－B）不隨濃度的增加而升高，且比值均小于1.5，表明被動擴散為主要機制。

Tab1 EffectsofconcentrationonthePappofgeniposide（ˉx±s，n＝3）

3.3 維拉帕米對梔子苷跨膜轉(zhuǎn)運的影響 加入維拉帕米后梔子苷的 Papp（A－B）為（6.79 ±0.10）×10－7cm·s－1，Papp（B－A）為（3.27±0.21）×10－7cm·s－1，而不加時 Pappc（A－B）為（6.88±0.38）×10－7cm·s－1，Papp（B－A）為（3.42±0.10）×10－7cm·s－1，無明顯改變（P＞0.05），表明梔子苷的跨膜轉(zhuǎn)運不會受到P-gp的影響。

3.4 EDTA對梔子苷跨膜吸收的影響 由Tab2可知，加入EDTA后梔子苷的Papp（A－B）值明顯變大，表明EDTA能明顯增加梔子苷的跨膜吸收。

Tab2 EffectsofEDTAonthePappofgeniposide（ˉx±s，n＝3）

3.5 梔子柏皮湯中梔子苷的吸收 梔子柏皮湯中梔子苷的吸收Papp（A－B）值與相同濃度梔子苷的比較見Tab3，由Tab3可知，梔子柏皮湯中梔子苷的Papp（A－B）明顯大于相同濃度的梔子苷，表明該復(fù)方能促進(jìn)梔子苷的吸收。

Tab3 Papp（A→B）ofgeniposideandgeniposideinZhiziBopiDecoction（ˉx±s，n＝3）

4 討論

本實驗考察了梔子苷在MDCK細(xì)胞模型上的轉(zhuǎn)運方式，結(jié)果表明，梔子苷為被動擴散，與梔子苷在體腸吸收報道一致［6］，有研究發(fā)現(xiàn)MDCK細(xì)胞在研究以被動擴散方式經(jīng)腸吸收的藥物時，預(yù)測吸收能力上相對于Caco-2細(xì)胞略占優(yōu)勢［5］。藥物的Papp與其口服吸收密切相關(guān)，吸收較差的藥物，其Papp小于 1×10－6cm·s－1［7］，本實驗發(fā)現(xiàn)梔子苷的 Papp值均小于1×10－6cm·s－1，說明梔子苷口服吸收較差，與體內(nèi)實驗的報道一致［3］。

細(xì)胞外Ca2＋濃度的大小很大程度上會改變該細(xì)胞的緊密結(jié)構(gòu)，若Ca2＋減少，細(xì)胞會開始松弛，若低Ca2＋濃度吋間較長，該松弛現(xiàn)象變得不可逆轉(zhuǎn)，EDTA可以結(jié)合 Ca2＋，減少細(xì)胞外 Ca2＋濃度，使細(xì)胞松弛，能增加通過細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運的藥物的滲透量，通常用其考察藥物的轉(zhuǎn)運方式是否包含細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運［8］，結(jié)果提示，梔子苷可能包括細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運。

通過對相同濃度的梔子苷單體和梔子柏皮湯中梔子苷的吸收差異的比較，發(fā)現(xiàn)梔子柏皮湯中梔子苷的吸收滲透能力明顯大于梔子苷單體，說明該復(fù)方中其他成分與梔子苷之間存在協(xié)同作用，促進(jìn)了梔子苷的吸收，推測梔子柏皮湯中梔子苷的吸收比梔子苷單體口服給藥吸收更好。

中藥成分的復(fù)雜性是制約中藥現(xiàn)代化發(fā)展的重要原因之一，目前應(yīng)用細(xì)胞模型研究中藥體外吸收特征主要以研究單體化合物多見，中草藥或中藥復(fù)方的體外研究只有少量報道［9－10］，本實驗在系統(tǒng)考察梔子苷在MDCK細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)運方式的同時比較了梔子苷單體與梔子柏皮湯中梔子苷的轉(zhuǎn)運的差異，為中藥體系的活性物質(zhì)體外研究提供了一個途徑。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 吳 梅，張 浩，李 容.HPLC測定梔子柏皮湯中甘草次酸的含量［J］.華西藥學(xué)雜志，2006，21（4）：399－400.

［1］ Wu M，Zhang H，Li R.Determination of glycyrrhetinic acid in Zhizi Baipi soup by HPLC［J］.West Chin J Pharm Sci，2006，21（4）：399－400.

［2］ 劉益華，李 晶，林曼婷，等.梔子有效成分梔子苷的現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］.中國藥學(xué)雜志，2012，47（6）：406－9.

［2］ Liu Y H，Li J，Lin M T，et al.Modern research progress of geniposide［J］.Chin Pharm J，2012，47（6）：406－9.

［3］ Lu Y，Du SY，Bai J，et al.Bioavailability and brain-targeting of geniposide in gardenia-borneol co-compound by different administration routes in mice［J］.Int J Mol Sci，2012，13（11）：14127－35.

［4］ Mitchell E，Lisbeth K，Sven F.Optimized conditions for MDCK permeability and turbidimetric solubility studies using compounds representative of BCSclassesⅠ-Ⅳ ［J］.Pharm Sci，2002，15（4）：331－40.

［5］ 葛建丹，陳 媚，宋必衛(wèi).綠原酸跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運機制研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25（8）：1094－8.

［5］ Ge J D，Chen M，Song B W.Transcytosis mechanism of chlorogenic acid across cell monolayer model［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25（8）：1094－8.

［6］ 杜先華，牛 欣，馮前進(jìn)，等.梔子苷大鼠在體腸吸收動力學(xué)的研究［J］.華西藥學(xué)雜志，2008，23（5）：558－60.

［6］ Du X H，Niu X，F(xiàn)eng Q J，et al.Study on absorption kinctics of geniposide in rat intestines［J］.West Chin J Pharm Sci，2008，23（5）：558－60.

［7］ Trapani G，F(xiàn)ranco M，Trapani A，et al.Frog intestinal sac：a new in vitro method for the assessment of intestinal permeability［J］.J Pharm Sci，2004，93（12）：2909－19.

［8］ Zumdick S，Deters A，Hensel A.In vitro intestinal transport of oligomeric procyanidins（DP 2 to 4）across monolayers of Caco-2 cells［J］.Fitoterapia，2012，83（7）：1210－7.

［9］ 吳安國，曾 寶，王春玲，等.HPLC考察小檗堿和黃連提取物中小檗堿在 Caco-2細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)運［J］.中國藥理學(xué)通報，2011，27（7）：1007－11.

［9］ Wu A G，Zeng B，Wang CL，et al.Transport of berberine as single compound and berberine in extract in Caco-2 cell model［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（7）：1007－11.

［10］Zheng K Y，Choi R C，Guo A J.The membrane permeability of Astragali Radix-derived formononetin and calycosin is increased by Angelicae Sinensis Radix in Caco-2 cells：A synergistic action of an ancient herbal decoction Danggui Buxue Tang［J］.J Pharm Biomed Anal，2012，70：671－9.