馬文紅，田振軍

跨皮電刺激和外源性rhG-CSF對(duì)大鼠脛骨骨折部位Ang-1與bFGF表達(dá)及血管再生的影響

馬文紅1，2，田振軍1

目的：探討電刺激及外源性重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF），對(duì)大鼠骨折愈合過程中血管再生因子及血管形成的影響。方法：3月齡SD大鼠80只，隨機(jī)分為對(duì)照組、電刺激組、rhG-CSF組和電刺激+rhG-CSF組，每組20只，制備大鼠脛骨閉合性骨折模型，rhG-CSF組和電刺激+rhG-CSF組分別在骨折后3 h皮下注射rhG-CSF，連續(xù)注射5天，電刺激組和電刺激+rhG-CSF組分別在骨折后第5天進(jìn)行跨皮電刺激大鼠小腿，2周取材刺激9天，4、6、8周取材刺激15天，各組分別在2、4、6、8周取材，每次5只，制成脫鈣骨切片；用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)骨折部位促血管再生因子Ang-1、bFGF和血管新生因子CD31標(biāo)記后統(tǒng)計(jì)分析，用血管墨汁灌注法對(duì)大鼠骨折部位血管形成情況進(jìn)行觀察。結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示，各干預(yù)手段均可促進(jìn)骨折部位Ang-1、bFGF、CD31的表達(dá)量，電刺激+rhG-CSF組與電刺激組、rhG-CSF組相比陽(yáng)性表達(dá)均顯著升高。墨汁灌注染色結(jié)果顯示，各干預(yù)手段均可促進(jìn)大鼠骨折部位血管、血管網(wǎng)的形成，加速骨折后的血管重建，尤其以電刺激+rhG-CSF動(dòng)員組效果更為顯著。結(jié)論：采用電刺激及外源性rhG-CSF動(dòng)員均可促進(jìn)骨折愈合過程中血管再生因子的表達(dá)，加速血運(yùn)重建，且聯(lián)合作用優(yōu)于單一因素，為加速骨折愈合提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

骨折愈合；電刺激；干細(xì)胞動(dòng)員；血管再生；血運(yùn)重建

微血管在骨折愈合過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[1]，血運(yùn)重建是骨折愈合的主要先決條件之一[2]。現(xiàn)已證實(shí)，骨折愈合過程中，骨組織細(xì)胞主要來自骨折區(qū)外的間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管周圍細(xì)胞、骨外膜細(xì)胞、骨內(nèi)膜細(xì)胞或幼稚細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，它們均通過血管系統(tǒng)帶入骨折處[3]。如何促進(jìn)血管再生、加速骨折愈合，是目前骨折領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題之一。肌肉收縮是血管重建的強(qiáng)有力刺激因素，促進(jìn)了肢體軟組織和骨血液循環(huán)，顯著增加血流量。rhG-CSF可刺激骨髓內(nèi)前體細(xì)胞，如造血干/祖細(xì)胞，基質(zhì)干細(xì)胞、成血管細(xì)胞進(jìn)入外周血液[4]，動(dòng)員骨髓干細(xì)胞促進(jìn)骨折愈合[5]。由于骨折早期不適合進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，采用跨皮電刺激骨骼肌收縮可以產(chǎn)生與運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練相同的生物學(xué)效應(yīng)。目前，尚無文獻(xiàn)采用電刺激和骨髓干細(xì)胞動(dòng)員促進(jìn)骨折愈合的研究報(bào)道。墨汁灌注實(shí)驗(yàn)方法是測(cè)量血管密度變化的經(jīng)典方法，本文采用跨皮電刺激大鼠小腿骨骼肌收縮，同時(shí)給予重組人粒細(xì)胞集落因子（rhG-CSF）干預(yù)，通過墨汁灌注實(shí)驗(yàn)和促血管再生因子Ang-1、bFGF及血管新生因子CD31指標(biāo)，探討促進(jìn)骨折部位早期血管化，加快骨折愈合的進(jìn)程。積極開展該方面的研究將為骨折臨床治療和康復(fù)手段與方法篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及脛骨閉合性骨折模型的建立

雄性3月齡SD大鼠80只，體重280～320 g，分為對(duì)照組、電刺激組、rhG-CSF組和電刺激+rhG-CSF組，每組20只。大鼠稱重后用20%烏拉坦（5 ml/kg體重）腹腔麻醉，將其右側(cè)脛骨固定于造模支架的鐵砧上，中軸上的砝碼由30 cm高處垂直自由下落撞擊鈍性刀片造成大鼠脛骨閉合性骨折。骨折后，拍攝X光片以確定骨折，骨折復(fù)位后用夾板和經(jīng)溫水浸泡的石膏繃帶進(jìn)行外固定[6-7]。

1.2 大鼠電刺激及髓干細(xì)胞動(dòng)員劑的劑量與給予方式

大鼠于骨折造模后第5天開始進(jìn)行跨皮電刺激右小腿[8-9]，采用RM6240多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，輸出電流強(qiáng)度為3 mA，刺激頻率為50 Hz，重復(fù)次數(shù)100次，間隔3 s，每天刺激2次，共10 min，間隔5 min。骨骼肌電刺激從造模后第5天開始，每天在相同時(shí)間進(jìn)行，連續(xù)刺激15天。BSCs動(dòng)員劑選擇重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF），劑量為10 μg/kg，在大鼠骨折3 h后皮下注射，10 μg/kg/天，共5天[10]，造模后對(duì)照組不作任何處理。

1.3 樣品取材及制備方法

造模成功后，分別在第2、4、6、8周取材。大鼠頸椎脫臼處死后，取下右后肢，剝除骨骼外側(cè)軟組織，生理鹽水清洗后立即置于中性甲醛溶液固定24～48 h，取脛骨中段骨痂組織微波脫鈣，脫鈣液是10%EDTA（美國(guó)Genbiew公司），pH7.5，脫鈣3周，脫鈣情況用針刺法檢驗(yàn)，脫鈣完全后縱向剖開常規(guī)包埋，5 μm連續(xù)切片。墨汁灌注骨組織為40 μm連續(xù)切片。

1.3.1 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法 每個(gè)指標(biāo)選取2套切片，免疫組織化學(xué)采用SABC法，嚴(yán)格按試劑盒（博士德）說明書步驟進(jìn)行。切片常規(guī)脫蠟至水，PBS沖洗2次，每次3 min；用3%H2O2封閉10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加正常山羊血清封閉液20 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加一抗，多克隆抗體：Ang-1、bFGF、CD31（博士德），抗體稀釋濃度分別為1：150、1：120、1：110，4℃過夜，37℃復(fù)溫，PBS沖洗3次；滴加二抗，37℃，25 min，PBS沖洗4次；滴加SABC，37℃，20 min，PBS沖洗4次；DAB顯色，蒸餾水沖洗；蘇木素復(fù)染（Ang-1未復(fù)染）、脫水、透明，中性樹膠封片。每次染色設(shè)陰性對(duì)照染色，PBS取代一抗，其他程序相同。

1.3.2 墨汁灌注實(shí)驗(yàn)方法 （1）配制墨汁明膠灌注液。稱取明膠6 g溶于100 ml蒸餾水中，用水浴鍋加熱至40℃孵育，攪拌使其完全溶解后加入10%甲醛10 ml，墨汁（北京一得閣）28 ml，攪拌并用濾紙過濾后置于38℃恒溫水浴箱中備用。（2）墨汁明膠液灌注標(biāo)本的制備。實(shí)驗(yàn)大鼠用20%烏拉坦腹腔注射麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)，開腹暴露腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，將腹主動(dòng)脈與下腔靜脈小心分離2～3 cm，用2個(gè)小動(dòng)脈夾在分離的腹主動(dòng)脈上、下2端止血后將12號(hào)針頭自腹主動(dòng)脈離心插入腹主動(dòng)脈1.5 cm后，結(jié)扎固定，先取下腹主動(dòng)脈下端動(dòng)脈夾1 min后取下上端動(dòng)脈夾。120 mmHg恒壓下先灌注36℃肝素生理鹽水50 ml沖洗，待腹主動(dòng)脈的上端流出透明液體時(shí)，換用明膠墨汁液36℃灌注，當(dāng)觀察到大鼠四肢、耳朵、眼球等部位變?yōu)楹谏珪r(shí)停止灌注，結(jié)扎腹主動(dòng)脈插管口上、下2端，并將大鼠放入中性甲醛中固定，4℃冰箱保存24 h后解剖出骨折肢脛骨，放置于10%甲醛溶液中固定3天后切取骨折部位再置于10%甲醛溶液中固定。

1.4 圖像采集及數(shù)據(jù)處理

采用Olympus光學(xué)顯微鏡，高、低倍結(jié)合的方法進(jìn)行觀察。墨汁灌注標(biāo)本，×200拍照后對(duì)比分析；免疫組化標(biāo)本，×400拍照，采用mage-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行平均光密度值（MOD）測(cè)定與分析。所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS18.0軟件包進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用T檢驗(yàn)。顯著性差異選擇Plt;0.05和Plt;0.01水平。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨折部位Ang-1的表達(dá)變化

血管生成素-1（Ang-1）免疫組化陽(yáng)性結(jié)果顯示：與rhG-CSF組相比，第2周除對(duì)照組外其余各組均顯著升高，第4周除對(duì)照組外其余各組均顯著升高；與電刺激組相比，第2周電刺激+rhG-CSF組顯著升高（見圖1、表1）。

圖1 免疫組織化學(xué)法觀察各組大鼠骨折部位Ang-1的表達(dá)Figure1 Immunohistochemistry rats were observed fracture site Ang-1 expression

表1 rhG-CSF動(dòng)員和電刺激對(duì)骨折大鼠骨組織Ang-1表達(dá)的MOD值Table1 rhG-CSF mobilization and passive contraction of the rat bone fractures Ang-1 MOD of expression

2.2 大鼠骨折部位bFGF的表達(dá)變化

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）免疫組化陽(yáng)性結(jié)果顯示：與rhG-CSF組相比，第2周除對(duì)照組外各組表達(dá)均顯著性升高，造模后第4周除對(duì)照組外其余各組表達(dá)均顯著升高，造模后第6周除對(duì)照組外其余各組表達(dá)均顯著升高；與電刺激組相比，電刺激+rhG-CSF組在第2、4周顯著升高（見圖2、表2）。

圖2 免疫組織化學(xué)法觀察各組大鼠骨折部位bFGF的表達(dá)Figure2 Immunohistochemistry rats were observed expression of bFGF fracture site

表2 rhG-CSF動(dòng)員和電刺激對(duì)骨折大鼠骨組織bFGF表達(dá)的MOD值Table2 rhG-CSF mobilization and passive contraction of the rat bone fractures MOD of expression of bFGF

2.3 大鼠骨折部位血管再生觀察

2.3.1 不同愈合時(shí)期骨痂組織中CD31的免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（CD31）免疫組化陽(yáng)性結(jié)果顯示：與rhG-CSF組相比，第2、4、6、8周電刺激+rhG-CSF組顯著升高，電刺激組第4周顯著升高；與電刺激組相比，第2、4、6周電刺激+rhG-CSF組顯著升高（見圖3、表3）。

表3 rhG-CSF動(dòng)員和電刺激對(duì)骨折大鼠骨組織CD31表達(dá)的MOD值Table3 rhG-CSF mobilization and passive contraction of the rat bone fractures MOD of CD31 expression

圖3 免疫組織化學(xué)法觀察各組大鼠骨折部位CD31的表達(dá)Figure3 Immunohistochemistry rats were observed expression of CD31 fracture site

2.3.2 不同愈合時(shí)期骨折部位血管墨汁灌注形態(tài)學(xué)觀察 血管墨汁灌注形態(tài)學(xué)觀察表明：造模后2周，各組骨折部位均有大量血管再生，但對(duì)照組無完整清晰血管，電刺激組、電刺激+rhG-CSF組已有大量完整血管形成，但血管較粗，未形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；造模后4周，對(duì)照組有個(gè)別完整血管，其余各組均有大量完整的血管形成，電刺激組、電刺激+rhG-CSF組有血管交通支形成，但血管徑大小差別大；造模后6周，對(duì)照組血管排列紊亂，局部無血管區(qū)，rhG-CSF組可見血管已形成交通支但血管較粗，電刺激組血管生成較豐富，但排列迂曲，分布不均勻，電刺激+rhG-CSF組血管形成豐富，血管網(wǎng)形成排列有規(guī)律；造模后8周，對(duì)照組血管相互交織、雜亂，呈網(wǎng)狀分布無序，rhG-CSF組毛細(xì)血管較豐富，血管相互交織，血管排列有序呈網(wǎng)狀但管徑有差別，電刺激組血管網(wǎng)形成，血管排列有序但血管徑大小有差別，電刺激+rhG-CSF組骨皮質(zhì)可見血管豐富、排列有序，血管徑大小基本一致，相互吻合成血管網(wǎng)（見圖4）。

圖4 大鼠骨折部位血管墨汁灌注染色的顯微鏡觀察結(jié)果Figure4 Ink perfusion rat vascular staining fracture site

3 分析與討論

3.1 電刺激聯(lián)合rhG-CSF動(dòng)員對(duì)骨折大鼠血管再生因子表達(dá)的影響

Ang-1在血管周圍尤其是平滑肌細(xì)胞周圍表達(dá)。大量研究證實(shí)，人臍靜脈成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，加入Ang-1可促進(jìn)管腔形成[11]；可通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡穩(wěn)定血管結(jié)構(gòu)防止血管滲漏[12]。研究證實(shí)，牽張力產(chǎn)生的機(jī)械刺激可導(dǎo)致牽張區(qū)中的血管生成，使內(nèi)源性Ang-1表達(dá)水平提高，為骨組織的形成提供了血供保障[13]。bFGF已是公認(rèn)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的誘導(dǎo)劑，被譽(yù)為血管再生因子。大量文獻(xiàn)證實(shí)，bFGF不僅促進(jìn)骨折后的血管再生，還可促進(jìn)成骨形成[14]，注射bFGF可促進(jìn)骨折后的血管再生，加速骨折愈合[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rhG-CSF動(dòng)員和電刺激均可提高Ang-1、bFGF的釋放，尤其是rhG-CSF動(dòng)員聯(lián)合電刺激組，骨折后給予一定劑量的rhG-CSF和早期施加適量電刺激干預(yù)均可增加血管再生因子，促進(jìn)血管再生，加速血運(yùn)重建。

3.2 電刺激聯(lián)合骨髓干細(xì)胞動(dòng)員對(duì)骨折大鼠血管形成的影響

CD31即血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，抗CD31可標(biāo)記新生血管[16]，用免疫組織化學(xué)的方法可檢測(cè)血管新生。本文通過檢測(cè)CD31表達(dá)的陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞，反映大鼠骨折愈合過程中的新生血管表達(dá)情況。結(jié)果表明，骨髓干細(xì)胞動(dòng)員和電刺激，以及二者雙重作用均可促進(jìn)骨折部位血管生成，電刺激+rhG-CSF動(dòng)員對(duì)大鼠骨折部位血管新生效果更為顯著。本實(shí)驗(yàn)通過血管墨汁灌注的方法，成功地標(biāo)注了骨折部位的血管變化情況，電刺激+rhG-CSFrhG-CSF組較早形成完整清晰的血管，血管生成豐富，且血管粗細(xì)均勻、排列有序，較早形成血管網(wǎng)，促進(jìn)骨折后的血運(yùn)重建。

肌肉收縮是血管重建的強(qiáng)有力刺激因素，骨折后的整復(fù)、固定和及時(shí)進(jìn)行功能鍛煉可發(fā)揮肌肉對(duì)血液循環(huán)的“水泵”作用。研究證明，缺血肢體局部釋放血管再生因子及其受體，促進(jìn)血管新生和側(cè)支循環(huán)的形成[17]，但這些血管再生因子不能滿足損傷部位的血運(yùn)重建。大量研究證明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以促進(jìn)缺血肢體的血管再生[18]、局部血流量的增大、毛細(xì)血管密度增加等[19]。骨骼肌電刺激促使骨折部位肌肉被動(dòng)收縮，不僅可以促進(jìn)血管再生因子的表達(dá)，同時(shí)加速血流量，加快骨折后血管再生因子的募集，加速骨折血運(yùn)的重建，促進(jìn)骨折愈。利用骨髓干細(xì)胞治療損傷的方法有骨髓干細(xì)胞移植和骨髓動(dòng)員2種。二者相比，動(dòng)員自體骨髓干細(xì)胞向損傷區(qū)趨化、歸巢并分化，促進(jìn)血管、組織再生，更符合機(jī)體的反應(yīng)性修復(fù)，方便、無創(chuàng)、實(shí)用性強(qiáng)[20]。

本實(shí)驗(yàn)采用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）動(dòng)員的方法來動(dòng)員大鼠自體干細(xì)胞，促進(jìn)骨折后骨髓干細(xì)胞（MSCs）向骨外周血遷移，增加外周血中的造血干細(xì)胞/內(nèi)皮祖細(xì)胞，為血管重塑募集更多的血管再生因子，促進(jìn)血管新生，加速骨折愈合。采用表皮骨骼肌電刺激，促使骨骼肌被動(dòng)收縮，加速局部血液循環(huán)，促進(jìn)血管再生與重建，通過骨骼肌收縮改善骨折周圍力學(xué)環(huán)境、化學(xué)環(huán)境，促進(jìn)肢體軟組織和骨內(nèi)血液循環(huán)，增加血流量，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣和修復(fù)因子也被更多地帶入受損部位，同時(shí)組織代謝產(chǎn)物和組織壞死細(xì)胞能及時(shí)運(yùn)輸出體外，為組織修復(fù)提供修復(fù)因子，改善損傷部位的外環(huán)境。

4 結(jié) 論

電刺激和rhG-CSF動(dòng)員均可促進(jìn)血管再生因子Ang-1、bFGF的釋放，促進(jìn)完整血管形成、血管有序排列、生成豐富，加速血管重建，且電刺激+rhG-CSF組在血管生成的各個(gè)階段效果均優(yōu)于單一干預(yù)手段。電刺激+rhG-CSF動(dòng)員在促進(jìn)血管再生加速骨折后的血運(yùn)重建有顯著療效，為加速骨折愈合提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)，具有理想的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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Effects of Electrical Stimulation and Exogenous rhG-CSF on the Expressions of Ang-1，bFGF and Angiogenesis inTibiaFractureSiteinRats

MA Wenhong1，2，TIAN Zhenjun1
（1.School of PE，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，China；2.School of PE，Xinjiang Normal University，Urumqi 830054，China）

Objective：Investigate the effects of electrical stimulation and exogenous recombinant human granulocyte colony-stimulating factor（rhG-CSF）on the angiogenesis factor responsible for vascular remodeling during fracture healing in rats.Methods：80 three-month-old SD rats were randomly assigned to 1）the control group，2）electrical stimulation group，3）rhG-CSF group，and 4）electrical stimulation+rhG-CSF group.The rhG-CSF group and electrical stimulation+rhG-CSF group were treated with 5 days continuous subcutaneous rhG-CSF injection 3 hours after fracture.The electrical stimulation group and electrical stimulation+rhG-CSF group were treated with electrical stimulation 5 days after fracture.The 2，4，6，8 week groups were stimulated for 9，15，15，and 15 days，respectively.Each group was sacrificed at 2，4，6，and 8 weeks with 5 rats per group.Bone slices were decalcified，then immunohistochem?ical staining was performed to examine the effects on the expressions of the angiogenesis factor Ang-1，bFGF and angiogenic factor CD31 at the fracture site.Ink perfusion was then performed to visualize vasculature formation at the fracture site.Results：The results of immunohistochemistry indicated that all the in?tervention can promote the expression of Ang-1，bFGF and CD31 at the fracture site.Compare to electrical stimulation group and rhG-CSF group，electrical stimulation+rhG-CSF group can significantly induce the expression of these three factors.Ink perfusion staining showed that the intervention could promote vascular network formation and accelerate revascularization at the fracture site.In particular，electrical stimulation combined with rhG-CSF mobilization ef?fect was even more significant.Conclusions：Electrical stimulation and exogenous rhG-CSF mobilization could promote fracture healing angiogenesis factor which lead to accelerated revascularization.Fracture healing can be accelerated to a further extend by combining these interventions.This result provides theo?retical basis for methods that accelerated fracture healing.

fracture healing；electrical stimulation；stem cell mobilization；angiogenesis；revascularization

G 804.2

A

1005-0000（2014）01-066-05

2013-09-29；

2013-12-19；錄用日期：2013-12-20

陜西師范大學(xué)“211工程”重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科——運(yùn)動(dòng)生物學(xué)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2010.11）

馬文紅（1980-），女，新疆昌吉人，在讀博士研究生，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)血管生物學(xué)；通信作者：田振軍（1965-），男，陜西綏德人，教授，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心血管與骨骼肌適應(yīng)。

1.陜西師范大學(xué)體育學(xué)院，陜西西安710062；2.新疆師范大學(xué)體育學(xué)院，新疆烏魯木齊830054。