宋德海,王振波,鄭波,董圣軍,程玲

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部,濱州 256603)

匹多莫德對動脈粥樣硬化NF-κB/IκB和TNF-α及IL-6表達(dá)的影響

宋德海,王振波,鄭波,董圣軍,程玲

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部,濱州 256603)

目的 探討匹多莫德對動脈粥樣硬化患者外周血核因子-κB(NF-κB/IκB)和炎性因子腫瘤壞死因子-α (TNF-α)及白細(xì)胞介素(IL)-6 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。方法選取頸動脈粥樣硬化患者62例,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組,各31例;對照組常規(guī)治療,治療組在對照組的基礎(chǔ)上加用匹多莫德口服液。分別于治療前后超聲檢測患者頸動脈厚度;并抽取患者空腹肘靜脈血,以RT-PCR和Western blot實驗測定全血NF-κB/IκB、TNF-α及IL-6的mRNA與蛋白表達(dá)水平。結(jié)果治療前,兩組患者的頸動脈厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);治療后,治療組顯著小于對照組(P＜0.05)。治療前,治療組患者的外周血NF-κB、IκB、TNF-α及IL-6的mRNA與蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);治療后,兩組患者的外周血NF-κB、TNF-α及IL-6 mRNA與蛋白表達(dá)水平均有所降低,且治療組顯著低于對照組(P＜0.05);IκB表達(dá)水平有所上升,且治療組顯著高于對照組(P＜0.05)。結(jié)論匹多莫德能夠調(diào)節(jié)NF-κB/IκB信號通路,緩解動脈粥樣硬化患者炎性反應(yīng),利于改善病情。

匹多莫德;動脈粥樣硬化;核因子-κB;腫瘤壞死因子-α;白細(xì)胞介素-6

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、腦缺血及周圍動脈梗阻等多種血管性疾病的重要病理基礎(chǔ)[1]。脈管壁內(nèi)膜脂質(zhì)沉著,中層平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜增殖,形成脂質(zhì)斑塊為其最典型病理特征。AS是一個復(fù)雜的病理進(jìn)程,除脂質(zhì)浸潤之外,發(fā)病過程中尚存在廣泛的氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng),且炎性反應(yīng)貫穿其疾病發(fā)生與發(fā)展的全過程,因此也被認(rèn)為是一種免疫應(yīng)激性炎性反應(yīng)[2]。核轉(zhuǎn)錄因子體系核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB/IκB)是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一,也是啟動級聯(lián)反應(yīng),刺激炎性因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)等分泌和表達(dá)的軸心[3-4]。匹多莫德是一種合成的具有免疫活性的二肽類物質(zhì),其免疫調(diào)節(jié)功能表現(xiàn)在多個方面。匹多莫德對機(jī)體的固有免疫細(xì)胞和T、B淋巴細(xì)胞活性均有一定的增強(qiáng)作用,不僅可改善各種免疫細(xì)胞的比例,而且能夠介導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子分泌,從而緩解免疫炎性反應(yīng)。2012年12月至2013年12月,筆者觀察匹多莫德對AS患者外周血NF-κB、TNF-α及IL-6表達(dá)的影響,也為其臨床治療新靶點的選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇本院收治的頸動脈粥樣硬化患者62例為研究對象,本研究經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),所有患者均由本人簽署知情同意書。其中男34例,女28例;年齡46～76歲,平均(64.3±7.82)歲;病程3個月～11年,平均(4.72±1.37)年。診斷標(biāo)準(zhǔn):以第4版《超聲醫(yī)學(xué)》AS標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù),經(jīng)彩色多普勒進(jìn)行診斷[5]。排除標(biāo)準(zhǔn):急性腦梗死、嚴(yán)重心肌梗死、嚴(yán)重心律失常、糖尿病、腫瘤或癌癥、血液系統(tǒng)疾病、其他免疫系統(tǒng)疾病;近2個月內(nèi)應(yīng)用過調(diào)脂、抗凝、免疫藥物患者。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為治療組和對照組,每組31例,且兩組患者之間年齡、性別、病程及病情差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 儀器 蛋白印跡轉(zhuǎn)移裝置(SDS-PAGE TY0736,美國伯樂);核酸蛋白測定儀(Biophotometerplus,德國艾本德);梯度PCR擴(kuò)增儀(TP600,上海西寶生物科技有限公司);凝膠成像分析儀(FR-980,上海復(fù)日);電泳儀(DYY-III2,北京六一儀器廠)等。

1.3 試劑 總RNA提取試劑盒(15596-026, Invitrogen公司);總蛋白抽提試劑盒(k3011010,北京博爾誠科技有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);抗體Anti-NF-κB P100/P50(ab7971)、Anti-IκB(ab32518)、Anti-TNF-α(ab7939)、Anti-IL-6(ab6672)及Goat Anti-Rabbit IgG(ab175315)等由Abcam提供;引物(表1)及其他常規(guī)RT-PCR試劑由上海寶生物公司提供。

1.4 治療方法 對照組給予常規(guī)治療,包括辛伐他汀片(商品名:京必舒新,浙江京新藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20000009),每次20 mg,qd;阿司匹林腸溶片(商品名:拜阿司匹林,拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20080331),首劑量每次300 mg,qd,維持劑量每次100 mg,qd。治療組在對照組的基礎(chǔ)上加用匹多莫德口服液(商品名:芙露飲,蘇州長征-欣凱制藥有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字H20030464),每次0.4 g,qd,早餐前口服。4周為1療程,連續(xù)治療兩個療程后進(jìn)行藥效評價,治療期間禁用其他降脂和抗血小板藥物。

表1 NF-κB、IκB、TNF-α及IL-6的引物序列

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 頸動脈內(nèi)膜厚度 分別于治療前后采用彩色多普勒超聲儀觀察頸動脈內(nèi)膜厚度。

1.5.2 mRNA表達(dá)檢測 分別于治療前后抽取患者空腹肘靜脈血,以總RNA提取試劑盒提取全血總RNA,進(jìn)行常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實驗。擴(kuò)增條件:95℃, 5 min;95℃,30 s;57℃,1 min;72℃,1 min;30個循環(huán);72℃,10 min。擴(kuò)增所得產(chǎn)物以5∶1與6×buffer混勻,進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,120 V 40 min。凝膠成像分析儀測定吸光度值,以目的基因/β-action為mRNA相對表達(dá)量,進(jìn)行半定量分析。

1.5.3 蛋白表達(dá)檢測 分別于治療前后抽取患者空腹肘靜脈血,肝素鈉抗凝,以總蛋白提取試劑盒提取蛋白質(zhì)。每血液100 μL加入蛋白提取液(含0.4%的蛋白酶抑制劑)500 μL,震蕩混勻,4℃,10 000 r·min-1離心5 min,棄上清液。磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)洗滌2或3次,重新加入500 μL蛋白提取液(含0.4%的蛋白酶抑制劑),震蕩混勻, 4℃,14 000 r·min-1離心15 min,棄上清液,得總蛋白。以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,并以10 μg為單孔上樣量進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳, 80 V/30 min,120 V/60 min。電泳后常規(guī)轉(zhuǎn)膜100 V/ 60 min,并以4.0%脫脂牛奶將轉(zhuǎn)染后的硝酸纖維素(nitrocellulose filter membrane,NC)膜封閉90 min。一抗孵育,4℃過夜,Anti-NF-κB P100/P50、Anti-IκB、Anti-TNF-α及Anti-IL-6的濃度分別為1∶3 000, 1∶1 000,1∶2 000,1∶1 500。二抗孵育,28℃, 90 min,Goat Anti-Rabbit IgG的濃度均為1∶2 000。孵育后采用化學(xué)發(fā)光法顯影,并以灰度分析軟件Image J分析相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)均以統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS16.0版進(jìn)行分析;頸動脈厚度和表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,行t檢驗;P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 頸動脈內(nèi)膜厚度 治療前,兩組患者的頸動脈內(nèi)膜厚度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);治療后,治療組顯著小于對照組(P＜0.05)。見圖1,2。

2.2 mRNA表達(dá) 治療前,治療組患者的外周血NF-κB、IκB、TNF-α及IL-6的mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。治療后,NF-κB、TNF-α及IL-6表達(dá)水平均有所降低,且治療組顯著低于對照組(P＜0.05);IκB表達(dá)水平有所上升,且治療組顯著高于對照組(P＜0.05)。見圖3。

2.3 蛋白表達(dá) 治療前,治療組外周血NF-κB、IκB、TNF-α及IL-6的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);治療后,NF-κB、TNF-α及IL-6表達(dá)水平均有所降低,且治療組顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);IκB表達(dá)水平有所上升,且治療組顯著高于對照組(P＜0.05)。見圖4。

圖1 兩組患者治療前、后頸動脈彩色多普勒超聲圖

圖2 兩組患者治療前后頸動脈厚度比較

3 討論

圖3 兩組患者外周血NF-κB、IκB、TNF-α及IL-6的mRNA表達(dá)比較

圖4 兩組患者外周血NF-κB、IκB、TNF-α及IL-6的蛋白表達(dá)比較

近年來,炎性反應(yīng)在AS發(fā)病過程中的作用越來越受重視。眾多研究顯示,細(xì)胞黏附分子的表達(dá)受炎性因子的調(diào)節(jié),炎癥反應(yīng)所致免疫細(xì)胞黏附是促進(jìn)脂質(zhì)浸潤和斑塊形成的主要因素[6-7]。細(xì)胞因子通過受體將信號經(jīng)胞質(zhì)傳導(dǎo)至核內(nèi),并使相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。這一途徑是由受體-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄活化子-靶基因的激活來實現(xiàn)的。NF-κB啟動靶基因轉(zhuǎn)錄的重要核轉(zhuǎn)錄因子,在機(jī)體多種生物學(xué)活性物質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用。同理,無論是炎性反應(yīng)還是細(xì)胞黏附均以NF-κB為樞紐。正常人體的外周血中,NF-κB呈低表達(dá)狀態(tài),而動脈粥樣硬化、心肌缺血和心力衰竭等心血管疾病患者,外周血NF-κB可大量增加[8]。近年研究證實,NF-κB可由多種刺激激活,包括炎性因子、淋巴細(xì)胞及黏附分子等,幾乎參與了炎癥、免疫、氧化應(yīng)激反應(yīng)的全過程,在AS的發(fā)病進(jìn)程中至關(guān)重要[9-11]。

目前,AS與NF-κB/IκB的相關(guān)研究多局限于動物實驗。本研究以臨床患者為對象,重點探討與NF-κB/ IκB及相關(guān)炎性因子TNF-α、IL-6在AS發(fā)病過程中發(fā)生的變化及免疫干預(yù)治療的可行性。從結(jié)果來看,治療組患者的頸動脈內(nèi)膜厚度恢復(fù)更好,說明其在抗脂質(zhì)浸潤和斑塊形成方面更占優(yōu)勢。此外,治療組患者的NF-κB、TNF-α及IL-6表達(dá)水平均較對照組顯著降低,IκB表達(dá)水平則較對照組顯著上升。AS斑塊中可檢測到TNF-α、IL-6及激活的NF-κB已被眾多學(xué)者所證實[12-13]。NF-κB由促炎因子TNF-α及IL-6誘導(dǎo)產(chǎn)生,并能誘導(dǎo)包括TNF-α及IL-6在內(nèi)的多種促炎因子的表達(dá),進(jìn)一步強(qiáng)化此激動信號。此外,NF-κB活化后,還能啟動細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)受損細(xì)胞的黏附作用,加強(qiáng)炎性反應(yīng),進(jìn)而形成級聯(lián)式惡性循環(huán)[14]。實驗動物學(xué)研究也證實下調(diào)NF-κB信號通路的蛋白表達(dá),能夠明顯降低炎性因子TNF-α和黏附分子ICAM-1的血清含量[15]。IκB又稱NF-κB抑制蛋白,在細(xì)胞靜息狀態(tài)下,與NF-κB結(jié)合,掩蓋了其核移位信號序列,以抑制其活性。NF-κB必須與IκB解離,暴露P50蛋白的核定位符號,才能夠進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性。因此,本研究以NF-κB/P50及IκB表達(dá)水平為主要觀察指標(biāo),可以反映其活性-抑制狀態(tài)。該結(jié)果說明匹多莫德在調(diào)節(jié)NF-κB/IκB信號通路,抑制炎性反應(yīng)方面更占優(yōu)勢,可能是其發(fā)揮抗AS的重要機(jī)制。

綜上所述,由NF-κB/IκB信號通路介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)在AS的發(fā)病機(jī)制中介導(dǎo)了重要環(huán)節(jié),匹多莫德能夠通過該信號通路,降低動脈粥樣硬化患者促炎因子的表達(dá),利于改善病情。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.011

R979.50;R972.6

A

1004-0781(2014)08-1025-04

2014-02-28

2014-04-10

宋德海(1964-),男,山東榮成人,主管藥師,學(xué)士,研究方向:臨床藥學(xué)。電話:0543-3256584,E-mail:sdh_bz @163.com。