俞蘊莉,張全英,華雯妍,黃明,王蒙

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院臨床藥理實驗室,蘇州 215004)

·心血管疾病用藥專欄·

液相色譜-串聯(lián)質譜法測定人全血蘭地洛爾濃度*

俞蘊莉,張全英,華雯妍,黃明,王蒙

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院臨床藥理實驗室,蘇州 215004)

目的 采用液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法測定全血蘭地洛爾的濃度,為注射用鹽酸蘭地洛爾的人體藥動學研究提供檢測手段。方法全血樣本加入甲硫酸新斯的明后經乙腈沉淀蛋白,采用WATERS公司XTerra?RP18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,以乙腈∶10 mmol·L-1醋酸銨緩沖液(含0.1%甲酸)=36∶64(V/V)為流動相,流速為1 mL·min-1;質譜采用電噴霧離子化,正離子-多反應監(jiān)測模式對蘭地洛爾(m/z510.5→423.1)和內標文拉法辛(m/z278.2→215.1)的濃度進行測定。結果蘭地洛爾的全血濃度在1.010～2 020 μg·L-1范圍內線性良好,定量下限為1.010 μg·L-1,批內精密度RSD＜6.5%,批間精密度RSD＜4.8%,提取回收率為92.6%～100.9%。結論該樣品處理方法簡便,測定方法靈敏、準確,適用于注射用鹽酸蘭地洛爾的人體藥動學研究。

蘭地洛爾;血藥濃度;液相色譜-串聯(lián)質譜法

鹽酸蘭地洛爾(landiolol hydrochloride)是由日本小野制藥工業(yè)株式會社研制開發(fā)的新型超短效β1受體阻斷藥,其適應證主要包括:①手術時心動過速性心律不齊的緊急處置(心房纖維顫動、心房撲動和竇性心動過速);②手術后循環(huán)動態(tài)監(jiān)控下,心動過速性心律不齊的緊急處置(心房纖維顫動、心房撲動和竇性心動過速)。鹽酸蘭地洛爾在日本已被廣泛用于圍手術期各種原因導致的快速型心律失常的控制。蘭地洛爾是在艾司洛爾的化學結構基礎上改造而得的新化合物。與艾司洛爾相比,蘭地洛爾對受體的選擇性更高,起效更快,消除更快,用量更少[1]。同時,蘭地洛爾還具有心臟抑制作用輕等優(yōu)點。蘭地洛爾在中國人體內的藥動學研究筆者未見報道,了解蘭地洛爾在中國人群中的藥動學特征,有助于制定更為合理有效的臨床用藥方案。筆者旨在通過靈敏、準確、高效的液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法建立測定人全血蘭地洛爾濃度的方法,為注射用鹽酸蘭地洛爾的人體藥動學研究提供檢測手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-MS/MS系統(tǒng):API-4000型三重四極桿串聯(lián)質譜儀(美國Applied Biosystem Sciex公司), Agilent 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Analyst 1.4.2。

1.2 試藥 鹽酸蘭地洛爾對照品(重慶鼎聯(lián)制藥有限公司,批號:T21-0907001,含量:100%);鹽酸文拉法辛(內標)對照品(重慶醫(yī)藥工業(yè)研究院有限責任公司,批號:05011901,含量:99.3%)。甲硫酸新斯的明(Sigma-Aldrich公司,批號:BCBD8573V);乙腈(色譜純,美國TEDIA公司);甲酸(色譜純,美國TEDIA公司);醋酸銨(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);水為滅菌注射用水(安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司);空白人全血(本院血庫提供)。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件 色譜柱:WATERS公司XTerra?RP18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱, Phenomenex Security GuardTMC18預柱;流動相:乙腈∶10 mmol·L-1醋酸銨緩沖液(含0.1%甲酸)=36∶64 (V/V)組成;流速為1 mL·min-1;進樣體積為10 μL;每個樣品的分析時間為3.5 min。多反應離子監(jiān)測,電噴霧離子源,正離子,測定蘭地洛爾和內標的檢測離子分別為:m/z510.5→423.1和m/z278.2→215.1。質譜參數(shù):碰撞氣(CAD)8 psi,簾氣(CUR)15 psi,霧化氣(Gas1)55 psi,輔助氣(Gas2)40 psi,噴霧電壓(IS) 3 500 V,霧化溫度(TEM)600℃。

2.2 溶液的制備 蘭地洛爾標準曲線工作液:精密稱取鹽酸蘭地洛爾對照品10.80 mg(相當于蘭地洛爾10.10 mg),置10 mL量瓶中,加入乙腈定容至刻度,混勻得到1.010 mg·mL-1的蘭地洛爾標準曲線儲備液,以乙腈為溶劑,定量稀釋配制成0.010 10,0.030 30, 0.101 0,0.303 0,1.010,3.030,10.10,20.20 μg·mL-1的系列標準曲線工作液。蘭地洛爾質控工作液:精密稱取鹽酸蘭地洛爾對照品10.80 mg(相當于蘭地洛爾10.10 mg),置10 mL量瓶中,加入乙腈定容至刻度,混勻得到1.010 mg·mL-1的蘭地洛爾質控儲備液,以乙腈為溶劑,定量稀釋配制成0.020 20,0.505 0,16.16 μg·mL-1的質控工作液。文拉法辛(內標)工作液:精確稱取對照品鹽酸文拉法辛10.00 mg(含文拉法辛8.780 mg),置10 mL量瓶中,加注射用水定容至刻度,混勻得0.878 0 mg·mL-1的文拉法辛儲備液,以注射用水為溶劑,定量稀釋配制成87.80 μg·L-1的工作液。2 mg·mL-1甲硫酸新斯的明溶液的配制:精確稱取甲硫酸新斯的明100 mg,置50 mL量瓶中,加水定容,混勻得2 mg·mL-1的甲硫酸新斯的明溶液。

2.3 全血樣本處理 在新鮮空白全血1 mL中,加入2 mg·mL-1的甲硫酸新斯的明溶液25 μL,混勻備用?？瞻兹看问褂们爸苽?制備后1 h內用完。精密吸取含有甲硫酸新斯的明的全血樣本200 μL至 1.5 mL塑料離心管中,加入內標工作液50 μL,混勻,加入乙腈600 μL,渦旋1 min,于16 000 r·min-1、4℃離心8 min。取上清液100 μL加入注射用水100 μL,渦旋30 s混勻,進樣10 μL。

2.4 方法特異性考察 空白全血、蘭地洛爾和內標文拉法辛對照品混合液及受試者服藥后的全血樣本進行色譜分析。結果顯示:蘭地洛爾和內標文拉法辛保留時間約為2.17和2.27 min,內源性物質對測定無干擾。說明本方法具有較高的特異性,能準確測定全血中的蘭地洛爾。

2.6 精密度和準確度 精密吸取空白全血180 μL,分別加入蘭地洛爾質控工作液20 μL,制備含蘭地洛爾濃度分別為2.02,50.50,1 616 μg·L-1的標準含藥全血,每個濃度平行配制5份,按“2.3”項下操作并測定。每天一批,連續(xù)測定3批,每批隨行一條標準曲線。記錄色譜圖、蘭地洛爾峰面積As和內標峰面積Ai。計算As和Ai的比值f(f=As/Ai),將f值代入隨行標準曲線求得實測濃度。用Excel軟件單因素方差分析統(tǒng)計批內和批間精密度,同時計算相對偏差,結果見表1。

表1 全血中蘭地洛爾批內、批間精密度Tab.1 Inter-and intro-precision of landiolol in human blood ±s,n=15

表1 全血中蘭地洛爾批內、批間精密度Tab.1 Inter-and intro-precision of landiolol in human blood ±s,n=15

加入濃度測得濃度(μg·L-1)批內RSD批間RSD準確度RE % 2.02 2.17±0.146.54.87.2 50.50 52.20±2.004.02.13.3 1 616.001 597.00±70.004.80.3-1.2

2.9 穩(wěn)定性實驗 分別考察蘭地洛爾低、中、高濃度(2.020,50.50,1 616 μg·L-1)的標準含藥全血樣本于室溫放置1 h、待測樣品自動進樣器放置24 h,處理后上清液室溫放置6 h、-70℃反復凍融3次及-70℃保存至14 d條件下的穩(wěn)定性。以不同放置條件下樣品的實測值與加入值相比計算偏差。結果蘭地洛爾標準含藥全血樣本于室溫放置1 h測定濃度相對誤差分別為4.5%,-5.2%和-11.5%;待測樣品于自動進樣器放置24 h后,測定濃度RE分別為10.9%,4.7%和-3.9%;上清液樣品于室溫放置6 h的測定濃度RE分別為7.1%,6.8%和3.1%;-70℃反復凍融3次后的測定濃度RE分別為-6.1%,-0.7%和-10.5%; -70℃放置14 d的測定濃度計算RE分別為5.0%, -1.3%和-9.4%。提示,本試驗所有樣品在上述條件下均穩(wěn)定。儲備液于2～8℃以及-40℃放置11 d后的實測濃度計算RE為-0.2%和-0.6%,提示,儲備液在2～8℃以及-40℃放置11 d后仍穩(wěn)定。

2.10 樣本的測定 1例健康受試者參加注射用鹽酸蘭地洛爾單次給藥人體藥動學預試驗。以125 μg·kg-1·min-1急速靜脈注射1 min后,以20 μg·kg-1·min-1靜脈內持續(xù)給藥60 min。于急速靜脈注射給藥前(0 min)和急速給藥開始后1 min,以及靜脈內持續(xù)給藥開始后1,2,5,10,15,30,60 min和持續(xù)給藥結束后2,5,10,15,20,40 min由肘靜脈采血2 mL,置裝有乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic aicd,EDTA)和甲硫酸新斯的明的真空采血管中,直接用冰浴冷卻,立即按“2.3”項下操作并測定全血中蘭地洛爾的濃度。受試者全血藥物濃度-時間曲線見圖1。

3 討論

本實驗主要目的是為注射用鹽酸蘭地洛爾的人體藥動學研究提供血藥濃度檢測方法。由于蘭地洛爾結構中有一個酯鍵,能夠被血中酯酶迅速水解為無活性的代謝產物,在血樣前處理中,采用在全血中加入膽堿酯酶抑制藥甲硫酸新斯的明抑制蘭地洛爾的降解[2-3]。本實驗考察了不同濃度(2,5 μg·mL-1和0.02,0.1,0.5, 2 mg·mL-1)甲硫酸新斯的明處理全血樣本,在室溫放置不同時間(立即處理,放置0.5及1 h)下,抑制蘭地洛爾水解的作用。通過比較樣本的質譜響應值發(fā)現(xiàn),1 mL全血樣本中加入2 mg·mL-1甲硫酸新斯的明溶液25 μL能夠保證全血中蘭地洛爾在室溫放置1 h內穩(wěn)定。

圖1 蘭地洛爾的全血濃度-時間曲線圖Fig.1 Blood concentration-time profiles of landiolol

目前文獻報道的蘭地洛爾血藥濃度測定方法有高效液相色譜法[4]、LC-MS/MS[5]方法,樣品處理方法為固相萃取[4]和液-液萃取[5]。筆者建立的LC-MS/MS法測定人全血中蘭地洛爾濃度,以乙腈直接沉淀蛋白為樣品預處理方法,較文獻報道方法簡便、低耗,具有更高的分析效率,可成功地應用于鹽酸蘭地洛爾的人體藥動學研究。

[1] 赫冠男,呂黃偉,王俊科.蘭地洛爾的藥理作用及其圍手術期的應用[J].中國新藥與臨床雜志,2007,26(12): 942-945.

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.008

Determination of Landiolol Concentration in Human Blood by LC-MS/MS

YU Yun-li,ZHANG Quan-ying,HUA Wen-yan,HUANG Ming,WANG Meng
(Department of Clinical Pharmacology,the Second Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China)

Objective To establish an LC-MS/MS method for the detection of landiolol concentration in human blood.MethodsAfter pretreatment with neostigmine and a deproteinization procedure,landiolol and the internal standard venlafaxine were eluted isocratically using a mobile phase consisting of acetonitrile and 10 mmoL·L-1ammonium acetate with 0.1%formic acid in a ratio of 36∶64(V/V).Separation of the respective compounds was achieved on a Waters XTerra?RP18column (150 mm×4.6 mm,5 μm).Quantitative analysis of landiolol was conducted by a triple-quadrupole mass spectrometer with positiveelectrospray ionization source,monitored under a multiple reaction monitoring(MRM)mode.The extracted ions monitored following MRM transitions werem/z510.5→423.1 for landiolol andm/z278.2→215.1 for the internal standard venlafaxine.ResultsThe calibration curve of landiolol in human blood showed good linear relationship in the range of 1.010-2 020 μg·L-1.The lower limit of quantitation was 1.010 μg·L-1.The RSD of within-day and between-day precision was less than 6.5%and 4.8%, respectively.The recovery rate was 92.6%-100.9%.ConclusionThe method is proven to be simple,rapid and reliable,and can be applied to study the pharmacokinetics of landiolol hydrochloride in healthy Chinese volunteers.

Landiolol;Drug concentration of blood;LC-MS/MS

R972.2;R969.1

A

1004-0781(2014)08-1009-04

2013-08-21

2014-01-17

*江蘇省中醫(yī)藥局科技項目(LZ13159)

俞蘊莉(1982-),女,江蘇蘇州人,主管藥師,博士,研究方向:藥代動力學。電話:0512-67783687,E-mail: chrisyu1255@aliyun.com。

張全英(1962-),女,江蘇蘇州人,主任藥師,學士,研究方向:臨床藥學。電話:0512-67783681,E-mail: sdfeyyq@163.com。