閔安娜，劉鋒明，晏彪，陳明清，楊旭

華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430079

近年來，飲料、白酒等行業(yè)頻頻發(fā)生的塑化劑污染事件引發(fā)了人們對(duì)食品安全的普遍擔(dān)憂，并將鄰苯二甲酸酯(phthalate esters，PAEs)推向了公眾視野。鄰苯二甲酸酯又稱酞酸酯，是世界上產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣，人工合成的有機(jī)化合物之一，也是一類全球性的環(huán)境污染物［1］。鄰苯二甲酸丁基芐酯(butyl benzyl phthalate，BBP)是鄰苯二甲酸酯類化合物(PAEs)的一種，是應(yīng)用最廣泛的鄰苯二甲酸酯之一。由于BBP應(yīng)用廣泛、難以降解，因此成為備受關(guān)注的全球性環(huán)境污染物之一。BBP被美國(guó)國(guó)家環(huán)保局(EPA)列為優(yōu)先控制污染物［2］。而中國(guó)是世界上最大的增塑劑消費(fèi)國(guó)，占全球消費(fèi)量的1/4，因此，BBP的危害和污染控制更應(yīng)該引起高度的重視。BBP可以作為增塑劑、軟化劑、添加劑和載體來使用，廣泛應(yīng)用于塑料制品、兒童玩具、工業(yè)涂料、化妝品、汽車、服裝、農(nóng)藥等行業(yè)。由于BBP與高分子聚合物之間不是以共價(jià)鍵化學(xué)結(jié)合，而是物理結(jié)合，隨著時(shí)間的推移，BBP會(huì)慢慢從材料中逸出，污染空氣、土壤、水源乃至食物。因此，在城市污泥及大氣中BBP有較高的含量［3-4］。BBP可通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑進(jìn)入人體，其中，經(jīng)飲食進(jìn)入體內(nèi)是最主要的途徑，已在人的尿液、乳汁、血液和精液等體液中檢測(cè)出BBP［5-6］。鄰苯二甲酸丁基芐酯被認(rèn)為是一種環(huán)境激素干擾物，具有生殖和發(fā)育毒性［7］。研究表明，BBP可以改變性別分化、使子宮增大，對(duì)胎兒具有一定的致畸性。BBP還可以導(dǎo)致睪丸發(fā)育不良，睪酮水平降低［8］。BBP的生殖毒性被研究得最多，BBP對(duì)雄性和雌性的生殖都有影響，其中對(duì)雄性的影響較大，國(guó)內(nèi)外對(duì)BBP的生殖和發(fā)育毒性報(bào)道較多，但對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的危害還不甚明了。有研究表明，長(zhǎng)期接觸BBP會(huì)在一定程度上損害神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致神經(jīng)衰弱和記憶力下降［9-11］。但BBP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性效果和影響機(jī)理并不清楚。

為此，本研究擬通過體外檢測(cè)BBP對(duì)小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞的毒性和氧化損傷水平來探討B(tài)BP神經(jīng)毒性效應(yīng)，并將進(jìn)一步探討B(tài)BP導(dǎo)致神經(jīng)毒性的機(jī)理。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑與儀器

儀器:細(xì)胞培養(yǎng)箱，低溫冷凍離心機(jī)(Eppendorf-5415R)，電熱恒溫水箱，渦旋器，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Bioteck)，熒光酶標(biāo)儀(Bio-teck)。

試劑:鄰苯二甲酸丁基芐酯(BBP)，(Sigma公司，純度 ＞ 99%)，2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)(Sigma公司，純度＞97%)，硫代巴比妥酸(TBA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，5’，5’-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究所用細(xì)胞是未分化的小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞(N2a)。細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2的環(huán)境，所用培養(yǎng)基為90%DMEM和10%FBS，每2 d傳代一次。

1.3 噻唑比色(MTT)試驗(yàn)

將長(zhǎng)勢(shì)良好(達(dá)到106個(gè)細(xì)胞/ml)的N2a細(xì)胞，加入新鮮的培養(yǎng)基中，吹打、懸浮、混勻，鋪板于96微孔板中(每孔100 μL)，四周用PBS代替。培養(yǎng)18 h之后，分別用不同濃度的BBP染毒液(0.08、0.16、0.32、0.625、1.25、2.5、5、10 g·L-1)作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行染毒，即將BBP與二甲基甲酰胺(DMF)按體積比1:1混合配制成10 g·L-1的染毒母液，按比例稀釋成0.08、0.16、0.32、0.625、1.25、2.5、5 g·L-1的染毒液進(jìn)行試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組DMEM和DMF，染毒時(shí)長(zhǎng)為24 h。吸出染毒液，用PBS洗一次，再加入180 μL 培養(yǎng)基，每孔加入 20 μL，5 mg·L-1的 MTT 溶液，黑暗中孵育4 h，37℃。再吸出培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，低速振蕩 10 min，測(cè) OD490nm。

1.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)(Hoechst 33258染色法)

將N2a細(xì)胞以5×105mL-1接種于用35 mm培養(yǎng)皿，35 mm 培養(yǎng)皿每孔1.5 ～2 ml，37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。加入BBP染毒液，繼續(xù)培養(yǎng)過夜。用4%多聚甲醛在4℃固定10～20 min。去固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，吸盡液體。搖動(dòng)洗滌后，加Hoechst 33258染色液，室溫10 min，再用PBS洗兩遍，每次3 min，超凈臺(tái)中避光風(fēng)干，在熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.5 氧自由基(ROS)水平的測(cè)定

細(xì)胞中活性氧(ROS)水平的測(cè)定使用的是DCF熒光法［12］。將神經(jīng)瘤細(xì)胞鋪板于96微孔板中，培養(yǎng)18 h 之后分別用不同的BBP 染毒液(0.16、0.32、0.625、1.25、2.5、5、10 g·L-1)進(jìn)行染毒，用 DMEM、DMF 作為對(duì)照組，NAC作為阻斷組，染毒時(shí)長(zhǎng)為24 h。將染毒細(xì)胞用PBS重懸。將10 mmol·L-1的DCFH-DA熒光染料用PBS緩沖液稀釋1 000倍，加入100 μL待測(cè)細(xì)胞重懸液混勻，在37℃下避光保存10 min后，測(cè)量其在480 nm激發(fā)光，520 nm發(fā)射光下的熒光強(qiáng)度。

1.6 丙二醛(MDA)含量的測(cè)定

丙二醛含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，且在532 nm處有最大吸收峰，通過吸光值的測(cè)量、計(jì)算，就可知道細(xì)胞中MDA的含量［13］。取10 mL試管，每管加入0.5 mL待測(cè)樣品液，調(diào)零管加入0.5 mL PBS，然后各管加入2 mL 0.6%TBA溶液，混勻后沸水浴15 min，取出后流水冷卻。10，000 rpm離心10 min，取上清液分別在450 nm、532 nm和600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，按照公式 C/MDA=6.45(D532-D600)-0.56D450，計(jì)算出每管樣品中 MDA 的濃度［14］(μmol·L-1)。

1.7 還原型谷胱甘肽(GSH)含量的測(cè)定

還原型谷胱甘肽(GSH)的含量采用熒光染料DTNB來測(cè)定，GSH為易溶于水的巰基化合物，它可以與無色的DTNB結(jié)合，形成黃色的5-巰基-2硝基苯甲酸，該物質(zhì)在412 nm處有最大光吸收，通過光吸收值的測(cè)定、計(jì)算，即可得出細(xì)胞中 GSH的量［15］。取 200 μL 細(xì)胞懸液，加入 50 μL 濃度為10%的TCA，混勻。10，000 rpm，離心5 min。然后取 50 μL 上清加入酶標(biāo)板，再加 150 μL，60 ng·mL-1的DTNB室溫避光5 min，測(cè)定412 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Origin 6.1統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)先進(jìn)行ANOVA分析，然后用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)染毒組與對(duì)照組之間的差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為檢測(cè)BBP的細(xì)胞毒性，我們進(jìn)行了MTT實(shí)驗(yàn)(圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組DMEM和DMF組之間無顯著性差異，說明DMF可以作為一種對(duì)細(xì)胞傷害較小的良好的促溶劑。隨著染毒濃度的增加，細(xì)胞存活數(shù)目減少，在BBP暴露劑量為10 g·L-1時(shí)出現(xiàn)了顯著性差異。隨著染毒濃度的升高，細(xì)胞呈現(xiàn)出膨大，裂解，不規(guī)則狀態(tài)。但是有趣的是在較低濃度組時(shí)，細(xì)胞的MTT值較對(duì)照組有比較明顯的升高，這提示低濃度的BBP可能對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。

圖1 不同濃度BBP染毒對(duì)N2a細(xì)胞的存活的影響(與空白組相比，*p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)Fig.1 The effect of BBP on the relative survival rate of N2a cells(compared with control group，*p＜0.05,**p＜0.01)

2.2 細(xì)胞凋亡的染色檢驗(yàn)

通過不同濃度的BBP染毒后，對(duì)N2a細(xì)胞進(jìn)行了Hoechst 33258染色分析(圖2)。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示:隨著染毒濃度的增加，細(xì)胞存活減少，并且細(xì)胞核不規(guī)則程度增加，開始出現(xiàn)凋亡小體;并且在常規(guī)鏡下觀察時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞界限不清，培養(yǎng)基中漂浮的細(xì)胞增多，并且細(xì)胞粘附能力即貼壁能力下降，容易被吹打下來。

2.3 ROS測(cè)量結(jié)果

通過DCF熒光法我們檢測(cè)N2a細(xì)胞中的ROS水平。結(jié)果顯示對(duì)照組DMEM與DMF組并無明顯差別，隨著染毒濃度的增加，ROS熒光越來越強(qiáng)(圖3)，這表明BBP導(dǎo)致了ROS水平的升高。研究發(fā)現(xiàn):隨著染毒濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)由橢長(zhǎng)形變圓形或橢圓形，細(xì)胞貼壁能力下降，細(xì)胞之間的交聯(lián)度下降。在最高濃度組出現(xiàn)了凋亡小體。

圖2 Hoechst 33258染色結(jié)果(A:DMEM組;B:DMF組;C:0.08 g·L-1;D:0.16 g·L-1;E:0.32 g·L-1;F:0.625 g·L-1;G:1.25 g·L-1;H:2.5 g·L-1;I:5 g·L-1;J:10 g·L-1)Fig.2 The results of Hoechst 33258 by different concentrations of BBP(A:DMEM group;B:DMF group;C:0.08 g·L-1;D:0.16 g·L-1;E:0.32 g·L-1;F:0.625 g·L-1;G:1.25 g·L-1;H:2.5 g·L-1;I:5 g·L-1;J:10 g·L-1)

圖3 不同BBP染毒濃度下的ROS熒光圖 (A:DMEM組;B:DMF組;C:0.08 g·L-1;D:0.16 g·L-1;E:0.32 g·L-1;F:0.625 g·L-1;G:1.25 g·L-1;H:2.5 g·L-1;I:5 g·L-1;J:10 g·L-1)Fig.3 The results of ROS fluorography by different concentrations of BBP(A:DMEM group;B:DMF group;C:0.08 g·L-1;D:0.16 g·L-1;E:0.32 g·L-1;F:0.625 g·L-1;G:1.25 g·L-1;H:2.5 g·L-1;I:5 g·L-1;J:10 g·L-1)

進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn):DMEM和DMF組之間并無顯著性的差異，說明DMF是一種良好的促溶劑，對(duì)細(xì)胞的影響較小。NAC作為阻斷劑，ROS出現(xiàn)降低現(xiàn)象，另外染毒組隨著染毒濃度的增加ROS出現(xiàn)上升趨勢(shì)，而且在 0.16 g·L-1和 0.31 g·L-1出現(xiàn)顯著性差異(p ＜0.05)，在 0.625 g·L-1、1.25 g·L-1、2.5 g·L-1和 10 g·L-1時(shí)出現(xiàn)極顯著性差異(p ＜ 0.01)說明BBP暴露導(dǎo)致了神經(jīng)瘤細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激效應(yīng)。

2.4 MDA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為檢測(cè)BBP對(duì)N2a細(xì)胞的氧化損傷，我們測(cè)定了細(xì)胞的MDA含量(圖5)。結(jié)果顯示:隨著BBP染毒濃度的增加，MDA系數(shù)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。當(dāng)BBP的濃度為10 g·L-1時(shí)與對(duì)照組相比出現(xiàn)了顯著性差異。說明BBP能夠?qū)π∈笊窠?jīng)瘤細(xì)胞產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，并且隨著BBP濃度的越大，氧化損傷程度越高。

2.5 GSH實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過GSH實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn):隨著染毒濃度的增加，GSH系數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖6)，且在0.32 g·L-1時(shí)出現(xiàn)顯著性差異，在 0.625、1.25、5 和 10 g·L-1時(shí)出現(xiàn)極顯著性差異。以上結(jié)果表明BBP能夠使小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，并且BBP濃度的越大，氧化損傷程度越高，消耗的GSH的量也更多。

圖4 不同濃度BBP染毒(g·L-1)對(duì)N2a細(xì)胞ROS含量的影響(與空白對(duì)照組相比，*p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)Fig.4 The effect of different exposure groups on ROS content in N2a(*p＜0.05,**p＜0.01,compared with control group)

圖5 不同濃度BBP染毒(g·L-1)對(duì)N2a細(xì)胞的MDA系數(shù)的影響(與對(duì)照組相比，*p＜0.05，＊＊ p ＜0.01)Fig.5 The effect of different exposure groups on MDA ratio in N2a(*p＜0.05,**p＜0.01,compared with control group)

圖6 不同濃度BBP染毒(g·L-1)對(duì)GSH系數(shù)的影響(與對(duì)照組相比，*p＜0.05，＊＊ p＜0.01)Fig.6 The effect of different BBP exposure groups on G SH ratio in N2a(*p＜0.05,**p＜0.01,compared with control group)

3 討論(Discussion)

鄰苯二甲酸丁基芐酯是最廣泛使用的酞酸酯之一。由于鄰苯二甲酸丁基芐酯的大量生產(chǎn)和在生活中的大量使用，鄰苯二甲酸丁基芐酯對(duì)人和動(dòng)物的暴露，事實(shí)上是難以避免的。在作為增塑劑使用時(shí)，由于BBP不與高分子材料共價(jià)結(jié)合，因而極易外泄進(jìn)入環(huán)境?？赏ㄟ^飲食、呼吸、皮膚接觸等途徑進(jìn)入人和動(dòng)物體內(nèi)。因此，世界上很多國(guó)家把BBP列為優(yōu)先控制的污染物。

評(píng)價(jià)鄰苯二甲酸酯的毒性及其致病機(jī)制是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。特別是鄰苯二甲酸酯被認(rèn)為是一種內(nèi)分泌干擾物，它的生殖毒性和發(fā)育毒性引起了人們廣泛的重視，并得到了很多動(dòng)物毒理學(xué)及流行病學(xué)調(diào)查研究的支持［16-17］。截至目前，對(duì)BBP的毒性研究仍然主要停留在它的生殖毒性、氧化損傷作用上［18-20］，而且也已經(jīng)有了比較完備的反應(yīng)機(jī)制來解釋氧化損傷的原因。并且提出了鄰苯二甲酸酯相關(guān)毒性的分子模型來更加完整的解釋PAEs對(duì)人或動(dòng)物的毒性。然而BBP對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)毒性卻鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。我們通過MTT實(shí)驗(yàn)和Hoechst 33258染色分析對(duì)BBP的細(xì)胞毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明當(dāng)BBP染毒濃度到5 g·L-1以上時(shí)，存活細(xì)胞減少，并且細(xì)胞界限不清，開始出現(xiàn)凋亡小體。這表明高濃度的BBP可以抑制神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

氧化損傷被認(rèn)為是引起機(jī)體細(xì)胞衰老、損傷、凋亡、死亡的重要原因。已有研究認(rèn)為DEHP、DBP、BBP等鄰苯二甲酸酯類都能導(dǎo)致氧化損傷［21-22］。Wormutd等對(duì)離體大鼠肺細(xì)胞進(jìn)行BBP染毒，結(jié)果表明BBP對(duì)大鼠肺細(xì)胞有著明顯的毒性作用，能使其發(fā)生氧化損傷［23］。為探討B(tài)BP暴露對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用機(jī)制，我們以神經(jīng)瘤細(xì)胞為模型細(xì)胞進(jìn)行研究。我們檢測(cè)了小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞的氧化損傷水平。研究結(jié)果顯示BBP導(dǎo)致神經(jīng)瘤細(xì)胞中活性氧自由基含量水平顯著上升，特別是在0.625 g·L-1的BBP染毒組與對(duì)照組相比具有極顯著性差異(p＜0.01)。MDA檢測(cè)表明BBP能夠?qū)ι窠?jīng)瘤細(xì)胞產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，并且隨著BBP濃度的增大，氧化損傷程度升高。GSH檢測(cè)顯示BBP染毒隨著染毒劑量的升高，細(xì)胞中GSH含量逐漸下降。染色觀察也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，因此，我們認(rèn)為BBP可以引起神經(jīng)瘤細(xì)胞的氧化損傷。在高濃度的BBP作用下，神經(jīng)瘤細(xì)胞發(fā)生了氧化損傷，這種損傷又導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

但是，BBP的其他相關(guān)毒性的作用還不確定，比如BBP是通過改變組織基因水平的表達(dá)還是改變激素的代謝水平來干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)?雖然已經(jīng)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞受到氧化損傷后細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)相應(yīng)的調(diào)亡程序，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的信號(hào)通路的某些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和調(diào)控會(huì)發(fā)生明顯的改變［24］;但是這一機(jī)制是否可以用來解釋BBP對(duì)細(xì)胞的毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致了它的神經(jīng)毒性，還值得進(jìn)一步探討。

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