李 峰,石 輝

西安建筑科技大學環(huán)境與市政工程學院,西安,710055

機體運動時所需能量主要來源于糖代謝。在大強度運動過程能促進葡萄糖的轉(zhuǎn)運[1],而機體正常組織會把葡萄糖代謝為乳酸,以供機體能量的需要,這必須依賴糖代謝限速酶的高度表達[2]。但是限速酶本身受多種變構(gòu)劑的影響,從而加速或減弱糖代謝的過程[3]。PM2.5作為空氣污染中一類主要污染物,其對人體健康所產(chǎn)生的危害效應(yīng)也備受關(guān)注[4-5],尤其是在運動狀態(tài)下,當空氣中PM2.5超過了人體所能適應(yīng)或正常的生理范圍后,就會對機體的健康產(chǎn)生不良的效應(yīng)。因此,研究運動及不同濃度PM2.5暴露下機體糖代謝限速酶的變化特點和規(guī)律,以期為運動實踐中環(huán)境有害因子的監(jiān)控及探明PM2.5暴露劑量-運動反應(yīng)之間的關(guān)系機制提供一定的實驗參考。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 PM2.5的采樣及懸液制備

用TH-150C型(武漢天虹)大容量大氣總顆粒物智能采樣器(配加2.5 μm的切割器)進行 PM2.5的采樣,采樣時間持續(xù)30 d,每天連續(xù)采樣24 h。采樣地點為某體育館內(nèi),周圍無障礙物遮擋且為非污染源,采樣前將采樣儀器放置高度為3～5 m,采用同心圓方式選取5個點,兩點之間相距5 m左右,離墻＞1 m、離門窗＞3 m,采樣點高度1.5 m,即人體呼吸帶高度,空氣流量為1.13 m3·min-1。采樣時將已稱重的濾膜用鑷子放入結(jié)晶采樣夾的濾網(wǎng)上,濾膜毛面朝進氣方向,將濾膜壓緊至不漏氣。采樣結(jié)束以后用鑷子取出濾膜,將有塵面兩次對折放入樣品紙袋并做好采樣記錄。將濾膜放在25℃,50%相對濕度的恒溫恒濕箱中平衡24 h,在此平衡條件下用感量為0.01 mg的分析天平稱量濾膜,記錄濾膜質(zhì)量,然后將同一濾膜再恒溫恒濕箱中同樣的條件下再平衡1 h后稱重,兩次重量之差小于0.04 mg為滿足恒重要求。根據(jù)采樣前、后濾膜質(zhì)量差和采樣體積得出顆粒物的質(zhì)量濃度。

懸液制備:將載有PM2.5的濾膜裁剪為小塊,浸入去離子水中,超聲振蕩30 min×4次,洗脫顆粒物,震蕩液經(jīng)6層紗布過濾,濾液4℃ 1000 rm·min-1離心20 min后收集下層懸液冷凍,PM2.5在-20℃保存。染毒時,用0.9%生理鹽水配制成需要的濃度,使用前超聲振蕩混勻,滅菌備用。為保證顆粒物實際毒性效果,實驗并未對顆粒物進行消毒滅菌處理。

1.2 儀器與試劑

儀器:電動跑臺(中國杭州段氏制作公司);DK-98-1A恒溫浴鍋(天津泰斯特有限公司);TN-100托盤扭力天平(武漢自動化儀表廠);Bonso-TCS-2000A電子稱(武漢自動化儀表廠);MR23i型低溫高速離心機(美國Thermo公司);TH-150C型大容量大氣總顆粒物智能采樣器(武漢天虹);BECKMAN AD 340化學發(fā)光酶標儀(美國)。

試劑:己糖激酶,丙酮酸激酶及異檸檬酸脫氫酶的活性均采用ELISA測定,試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 實驗動物分組與運動方案

實驗大鼠選用健康成年雄性Wistar SPF級大鼠30只(由西安交通大學醫(yī)學院動物房提供),鼠齡7周,體重180～220 g。大鼠購入后適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,自由進食飲水(飼料購自西安交通大學醫(yī)學院動物房),動物飼養(yǎng)室內(nèi)溫度(20～26)℃,濕度為44% ～70%,照明隨同自然變化。實驗中對大鼠的處置按照中華人民共和國科學技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的相關(guān)要求進行[6]。將所有大鼠隨機分為QC,EC,LPE,MPE和HPE,按照每千克體重3 mL的劑量進行設(shè)計。實驗動物每組8只,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,所有大鼠先以 10 m·min-1、5 min·天-1的跑臺運動進行2 d的適應(yīng)性訓練,休息1 d后即按照設(shè)定的運動方案進行一次遞增負荷訓練,具體訓練方案為:15 m·min-1×15 min,18 m·min-1×20 min,21 m·min-1×30 min,24 m·min-1×40 min,27 m·min-1×50 min 的遞增負荷形式進行。

1.4 實驗動物染毒劑量與染毒方式

PM2.5染毒采用氣管滴注法,滴注前受試動物的溫度維持在37℃左右。乙醚麻醉后,染毒懸液預(yù)溫至37℃,經(jīng)氣管注入PM2.5顆粒物染毒懸液,滴注體積為3 mL·kg-1(體重)[7],注入后立即將大鼠直立并旋轉(zhuǎn),使顆粒物盡量均勻分布,染毒時間為訓練前1h,對照組滴注同等容量的生理鹽水。

1.5 血清及肝臟組織勻漿制備

1.5.1 血液取樣及血清制備

實驗結(jié)束后即刻宰殺大鼠,用20% 烏拉坦溶液腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,采血位置的最佳穿刺點在腹主動脈分叉處向心端1～3 mm處。將大鼠仰臥固定在手術(shù)臺上,常規(guī)消毒后用手術(shù)剪刀沿腹正中線剪開腹腔。右手持穿刺針,針尖斜面朝下,入針角度25°～30°,朝向心端方向刺入,深度以5 mm左右為宜,抽吸血液即可。取出的血液置37℃恒溫水浴5 min后3 500 r·min-1離心15 min,分離血清并 4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 肝臟組織勻漿制備

大鼠宰殺后即刻稱取適量肝臟組織加入0.9%的生理鹽水,按W(g):V(ml)=1:9的比例加取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(pH 7.4,0.01 mol·L-1Tris-HCL,0.0001 mol·L-1EDTA-2 Na,0.01 mol·L-1蔗糖,0.8% 的 NaCl溶液)于燒杯中,用眼科小剪盡快剪碎組織塊(以上全部操作在冰水浴中進行),然后倒入研缽中按照順時針方向進行研磨至糊狀。勻漿液通過二層紗布過濾后按試劑盒要求分別于低溫冷凍離心機4 000 rpm·min-1離心l0 min,分離上清液,4℃冰箱保存?zhèn)溆没蚶洳鼗?20℃冰箱冰凍備用,使用前按照試劑盒要求作相應(yīng)的稀釋。

1.6 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理,采用獨立樣本T檢驗,計算均值士標準差(X士s),確定差異的顯著性。

2 結(jié)果(Results)

2.1 PM2.5染毒對大鼠血清及肝臟組織HK活性的影響

如表1所示,與QC相比,EC組HK活性降低且差異據(jù)有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。和EC組相比,LPE,MPE組HK活性下降但差異無統(tǒng)計學意義,HPE組HK活性下降且差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。

2.2 PM2.5染毒對大鼠血清及肝臟組織PK活性的影響

如表2所示,與QC相比,EC組血清和肝臟組織中PK活性降低且差異據(jù)有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。和EC組相比,LPE組中PK活性下降,但差異無統(tǒng)計學意義,MPE組HPE組PK活性下降,差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或 p＜0.01)。

2.3 PM2.5染毒對大鼠血清及肝臟組織IDH的影響

和QC組相比,EC組血清和肝臟組織中IDH活性均升高,差異據(jù)有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。和EC組相比,隨著染毒劑量的增加,IDH活性下降更加明顯,且MPE組差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.01),HPE組肝臟組織IDH差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或p＜0.01)。

表1 PM2.5染毒對大鼠血清及肝臟組織HK活性的影響Table 1 The HK activities change of serum and liver of rats exposed in PM2.5(nmo·lmg-1)

表2 PM2.5染毒對大鼠血清及肝臟組織PK活性的影響Table 2 The PK activities change of serum and liver of rats exposed in PM2.5(nmo·lmg-1)

表3 PM2.5染毒對大鼠血清及肝臟組織IDH的影響Table 3 The IDH activities of serum and liver of rats exposed in PM2.5(nmo·lmg-1)

3 討論(Discussion)

3.1 運動對大鼠HK,PK,IDH活性的影響

環(huán)境與運動健康是環(huán)境毒理學和運動醫(yī)學領(lǐng)域內(nèi)共同關(guān)注的重要課題之一。一方面,運動時物質(zhì)與能量代謝均需各種酶的催化;另一方面,運動會引起酶發(fā)生適應(yīng)性變化,表現(xiàn)出運動性質(zhì)與代謝特點的相適應(yīng)。

在本實驗中,和空白對照相比,運動對照組糖酵解限速酶HK及PK活性均降低,且差異據(jù)有統(tǒng)計學意義(p＜0.01),其主要原因是本運動方案為有氧運動模型,機體雖持續(xù)運動時間長,但總體的運動強度不大,不足以啟動機體的無氧代謝能力來動員更多的ATP以維持運動需要。而HK及PK為糖酵解的限速酶,其活性的變化主要與短時間大強度的運動有關(guān),由于此時機體的有氧氧化供能系統(tǒng)足以提供運動所需的能量,因此HK及PK沒有出現(xiàn)上升的現(xiàn)象。另外,實驗數(shù)據(jù)也顯示,運動后有氧氧化限速酶IDH活性升高,這表明本實驗運動方案可以促進機體有氧氧化代謝能力的增強,同時IDH活性升高也表明組織氧利用能力提高,保證組織收縮時的能量供應(yīng),提高肌肉的工作效率和運動持久能力。這主要是因為能量代謝相關(guān)酶活性的變化最能迅速地反映各種訓練期組織亞細胞結(jié)構(gòu)的適應(yīng)和有氧代謝能力的水平,因此,有氧運動訓練可引起IDH活性的改變也是機體對運動適應(yīng)的一種表現(xiàn)。另外,HK及PK一般存在于細胞液中,而血清中檢測到此兩種酶活性的變化,主要原因應(yīng)歸結(jié)于兩方面:1)運動時肝組織細胞膜或其他器官中一些細胞膜受損使膜通透性增加,細胞膜對流通物質(zhì)分子的選擇能力下降,導致細胞內(nèi)的酶釋放入血液。2)當細胞受到損傷時,酶從細胞內(nèi)逸出進入細胞外液,引起血清中酶活性的增加[8]。

3.2 PM2.5染毒暴露對運動大鼠HK,PK,IDH活性的影響

PM2.5對肺功能存在短期負效應(yīng),并存在一定滯后性[9],可造成呼吸、心血管、免疫等多系統(tǒng)的健康損害,并與人群呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的發(fā)病率和死亡率有關(guān)[10-12]。本實驗中表1,2,3數(shù)據(jù)顯示,PM2.5染毒后HK,PK,IDH 3種酶活性均下降,且下降幅度與染毒劑量呈相關(guān)表達。雖然此3種酶活性的改變并不絕對代表無氧或者有氧代謝能力的變化[13],但是PM2.5染毒后HK,PK,IDH活性的改變也在一定程度上表明PM2.5染毒可以對機體的糖代謝酶產(chǎn)生不利的影響。分析其原因主要有以下幾個方面:(1)近年來許多學者認為,檢測IDH活性能較準確地反映出肝細胞病變程度,尤其是壞死性變化,因此臨床上較多地用于測定人體血清中IDH活性為判斷肝細胞病變的依據(jù)。PM2.5中含有大量的無機和有機化合物,能夠誘發(fā)肝臟纖維化,而在機體的供能系統(tǒng)中,糖類首先以肝糖原的形式存儲在肝臟中,然后進行代謝和轉(zhuǎn)化,當肝臟機能受損時,其作為貯存和代謝、解毒的功能必將減弱,當作為無氧和有氧代謝的底物減少時,糖代謝的整個過程也必將受到影響。(2)另外,作者以前的研究發(fā)現(xiàn),PM2.5染毒后大鼠血清和一些組織中的抗氧化酶活性降低[14],表明顆粒物具有產(chǎn)生或誘導產(chǎn)生自由基的能力,而自由基會與PM2.5的化學成分產(chǎn)生加合作用,誘導體內(nèi)的酶和蛋白質(zhì)發(fā)生環(huán)氧化反應(yīng)并導致糖代謝底物的變構(gòu),從而影響底物與酶的楔合效應(yīng),導致代謝酶生成量減少和活性的降低。(3)呼吸系統(tǒng)受到的PM2.5污染效應(yīng)與其沉積于呼吸系統(tǒng)的污染量有關(guān)。而沉積率與呼吸頻率、呼吸量成正比。呼吸頻率、呼吸量值越大,沉積率的值就越高,污染效應(yīng)就越大,由于本運動方案總的運動時間累計為155 min,所以大鼠的總肺通氣量較大,使得PM2.5的沉積量要比安靜時大,這對于糖代謝關(guān)鍵酶的高度表達也是不利的。

暴露-反應(yīng)關(guān)系是指環(huán)境暴露水平與人體不良反應(yīng)發(fā)生之間的關(guān)系,在空氣污染流行病學研究中通常是指隨著空氣污染物濃度的改變,人群中出現(xiàn)某種健康損害的個體在群體中所占比例的相應(yīng)變化,也稱濃度-反應(yīng)關(guān)系。而閾值濃度是指污染物濃度在低于該濃度值時,流行病學研究未觀察到空氣污染物對人群健康的影響。關(guān)于HK,PK,IDH 3種酶活性的降低與PM2.5染毒劑量的相關(guān)性,說明機體對PM2.5的承載存在一定的閾值。在本實驗中,低劑量組PM2.5雖然可以使3種酶活性下降,但是都不具有差異顯著性,而中劑量和高劑量組均差異均表現(xiàn)出具有統(tǒng)計學意義,說明針對于本實驗來說,大鼠在15 mg·kg-1和30 mg·kg-1的劑量時才會對機體產(chǎn)生明顯的毒性作用,這也說明在同樣的運動強度和運動量下,環(huán)境污染越嚴重,PM2.5對機體正常生理功能的干擾和損害越大。雖然流行病學研究以及實驗室研究均提出大氣顆粒物的健康影響存在劑量-反應(yīng)關(guān)系,但關(guān)于大氣顆粒物對人體的作用閾值的研究,特別是實驗室方面涉及較少,所取得的動物實驗研究成果對于人群的外推有不確定性。因此,目前研究還未確定針對不同性別、不同年齡、不同運動狀態(tài)、不同生活環(huán)境下,細顆粒是否存在不同的閾值,我們的研究目的也是通過動物實驗探索PM2.5污染的運動環(huán)境下機體對不同的PM2.5劑量濃度的反應(yīng)。因為動物染毒劑量組的設(shè)置需考慮多種綜合因素,包括大鼠每天的通氣量(0.80 L·kg-1體重),大氣PM2.5在肺部的沉積率(20%左右)等。在本實驗之前的預(yù)實驗過程中,除了7.5,15和30 mg·kg-1我們還設(shè)計了1 mg·kg-1,5 mg·kg-1的劑量組,但是通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)1 mg·kg-1對大鼠無影響,5 mg·kg-1對空白對照組無影響,而對運動對照組有影響但無差異不具統(tǒng)計學意義(未發(fā)表數(shù)據(jù))。而在本論文中所設(shè)置的7.5 mg.kg-1的劑量濃度與運動對照組相比時,雖說酶的活性有升高或者降低的變化,但差異均未有統(tǒng)計學意義,說明在本實驗所設(shè)置的外部環(huán)境條件下,機體代謝酶所能承受的暴露劑量閾值下限為7.5-15 mg·kg-1,但由于本實驗設(shè)計的最高劑量為30 mg·kg-1,雖然說數(shù)據(jù)顯示差異具有統(tǒng)計學意義,但是否為機體所能承受的閾值上限濃度尚不能確定。這也提示相關(guān)環(huán)境監(jiān)測部門和運動者在運動時要注意PM2.5的濃度變化,因為這可能是會導致運動能力下降和健康效應(yīng)受損的一個重要因素。

綜上所述,我們認為(1)本實驗運動方案可以降低血清和肝臟組織中HK,PK的活性,而使IDH活性升高,表現(xiàn)出運動性質(zhì)與代謝特點的相適應(yīng);(2)PM2.5染毒后HK,PK,IDH活性均下降,且呈劑量反應(yīng)關(guān)系。

致謝:感謝四川大學康啟智和陜西師范大學生命科學學院楊瑾博士的幫助和支持。

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