李秋爽，史雅娟，王鐵宇，倪坤，徐笠，劉世杰，王琳，呂永龍,*

1.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心城市與區(qū)域生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085

2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100039

近年來(lái)，隨著城市化和工業(yè)化進(jìn)程不斷加速，環(huán) 境中多換芳烴(PAHs)污染問(wèn)題日益嚴(yán)重。大量文獻(xiàn)數(shù)據(jù)表明，我國(guó)農(nóng)田土壤中多環(huán)芳烴污染普遍存在[1-3]。PAHs可被植物從大氣、土壤中吸收并在植物體內(nèi)遷移、代謝和積累，從而對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響[4-5]。熒蒽(FLT)，一種四環(huán)芳烴，是EPA規(guī)定的16種多換芳烴的典型代表，它對(duì)植物具有毒性作用[6-8]，然而，目前關(guān)于FLT脅迫對(duì)種子萌發(fā)影響的研究尚不多見(jiàn)。大豆是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)的最初環(huán)節(jié)，也是最敏感最重要的生理過(guò)程之一，萌發(fā)受阻將影響其后的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，導(dǎo)致生物量降低和作物減產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度的FLT對(duì)大豆種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和幼苗長(zhǎng)度的影響，以期為探討FLT對(duì)植物種子萌發(fā)的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為農(nóng)田生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試劑:熒蒽(FLT，分析純，TCI，日本);丙酮(優(yōu)級(jí)純，F(xiàn)isher，美國(guó))。

實(shí)驗(yàn)種子:大豆種子(品種為中黃30)，獲取于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

使用丙酮作助溶劑(與超純水的體積比為1:99)，配制FLT溶液。挑選顆粒飽滿、大小均勻的大豆種子，于30%的雙氧水中消毒浸泡15 min，用超純水沖洗5次，浸泡于超純水中活化12 h。將活化好的種子均勻置于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中，皿內(nèi)墊有雙層濾紙，每皿種子15粒，加入溶液10 mL，放入培養(yǎng)箱發(fā)芽。培養(yǎng)箱溫度為25℃，相對(duì)空氣濕度為80%。實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)水平的 FLT 濃度處理，濃度分別為2、5、15、25、50 mg·L-1，同時(shí)設(shè)定1個(gè)空白對(duì)照組和1個(gè)加入5 mL丙酮的對(duì)照組，每個(gè)處理均設(shè)5個(gè)重復(fù)。于4 d、6 d、8 d和10 d記錄所有樣本的發(fā)芽個(gè)數(shù)(胚根長(zhǎng)度大于或等于5 mm，視為正常發(fā)芽)，并隨機(jī)抽取每個(gè)處理的3個(gè)重復(fù)測(cè)量幼苗長(zhǎng)度，實(shí)驗(yàn)周期為10 d。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

按國(guó)家種子質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 3534.3—1995)，大豆的發(fā)芽勢(shì)于處理后第4天測(cè)定，發(fā)芽率則于處理后第10天統(tǒng)計(jì)。

發(fā)芽勢(shì)=前4 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽率=前10 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽指數(shù)=ΣGt/Dt

式中:Gt為t時(shí)間內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)

發(fā)芽長(zhǎng)度=發(fā)芽10 d時(shí)幼苗總長(zhǎng)

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×10 d時(shí)幼苗長(zhǎng)度

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，在p=0.05的置信水平進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和LSD檢驗(yàn)，并用Excel軟件繪圖。文中所有的數(shù)據(jù)均為所取重復(fù)的平均值。

2 結(jié)果(Results)

2.1 FLT對(duì)大豆種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響

大豆種子發(fā)芽勢(shì)(4 d)和發(fā)芽率結(jié)果如表1所示，當(dāng)FLT濃度較低時(shí)(小于等于15 mg·L-1)，大豆種子發(fā)芽率降低程度未達(dá)顯著(p＞0.05)，而當(dāng)FLT濃度較高時(shí)(大于15 mg·L-1)，發(fā)芽率顯著降低(p＜0.05)，且隨FLT濃度增加，大豆種子發(fā)芽率逐漸減小，當(dāng)濃度為50 mg·L-1時(shí)，發(fā)芽率相對(duì)于空白對(duì)照下降了45.33%。發(fā)芽勢(shì)則對(duì)FLT脅迫的響應(yīng)更加敏感，不論低濃度還是高濃度，F(xiàn)LT均顯著降低了大豆種子發(fā)芽勢(shì)(4 d)，且發(fā)芽勢(shì)隨濃度升高呈現(xiàn)明顯的降低趨勢(shì)(p ＜ 0.05)，在 2、5、15、25 和 50 mg·L-1的FLT脅迫下，分別下降了1.64%、16.39%、21.31%、34.43%和60.66%。

表1 FLT對(duì)大豆種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率的影響Table 1 Effects of fluoranthene on germination energy and germination rate of soybean

2.2 FLT對(duì)大豆種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

如圖1和圖2所示，F(xiàn)LT對(duì)大豆種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)隨著其濃度增加抑制作用增強(qiáng)。當(dāng)FLT濃度小于5 mg·L-1時(shí)，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)未見(jiàn)顯著變化(p ＞0.05)，當(dāng)濃度大于5 mg·L-1時(shí)，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著降低，且隨濃度增加逐漸下降，具有明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系(p＜0.05)。

2.3 FLT對(duì)大豆幼苗長(zhǎng)度的影響

圖1 熒蒽(FLT)對(duì)大豆種子發(fā)芽指數(shù)的影響注:圖中標(biāo)有不同字母者表示數(shù)據(jù)組間差異顯著(p＜0.05)Fig.1 Effects of fluoranthene on germination index of soybean seedsNote:Data represented as mean±standard error.Values followed by the same letter are not significantly different(LSD,p＜0.05).

圖2 熒蒽(FLT)對(duì)大豆種子活力指數(shù)的影響注:圖中標(biāo)有不同字母者表示數(shù)據(jù)組間差異顯著(p＜0.05)Fig.2 Effects of fluoranthene on germination vitality of soybean seedsNote:Data represented as mean±standard error.Values followed by the same letter are not significantly different(LSD,p＜0.05).

實(shí)驗(yàn)測(cè)量并記錄了4 d、6 d、8 d和10 d的大豆幼苗長(zhǎng)度(圖3)，結(jié)果表明，發(fā)芽初期(4 d)，F(xiàn)LT對(duì)幼苗長(zhǎng)度的抑制作用并不明顯，僅在最高濃度(50 mg·L-1)時(shí)達(dá)顯著水平(p＜0.05);發(fā)芽中期(6 d)，熒蒽濃度小于15 mg·L-1時(shí)，對(duì)幼苗長(zhǎng)度的抑制作用不顯著，濃度大于等于15 mg·L-1時(shí)，幼苗長(zhǎng)度顯著降低(p＜0.05);發(fā)芽后期(8 d)和末期(10 d)，熒蒽小于等于5 mg·L-1時(shí)，對(duì)幼苗長(zhǎng)度抑制未達(dá)顯著，大于等于5 mg·L-1時(shí)，抑制作用達(dá)到顯著水平(p＜0.05)。綜上，F(xiàn)LT抑制大豆幼苗長(zhǎng)度，濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，處理時(shí)間越久，抑制作用越明顯。

3 討論(Discussion)

國(guó)內(nèi)外有關(guān)FLT對(duì)種子萌發(fā)影響的研究極少[7]，本文探索性地研究了大豆種子萌發(fā)對(duì)FLT的響應(yīng)。結(jié)果顯示FLT對(duì)大豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)和幼苗長(zhǎng)度均有不同程度的抑制作用。在較低濃度(小于15 mg·L-1)的FLT脅迫下，大豆發(fā)芽率與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異，較高濃度(大于等于15 mg·L-1)的FLT脅迫則顯著抑制了發(fā)芽率;發(fā)芽勢(shì)則對(duì)FLT的脅迫作用更加敏感，當(dāng)FLT濃度大于等于5 mg·L-1時(shí)，體現(xiàn)出顯著的抑制作用，表明FLT對(duì)大豆種子發(fā)芽起到推遲作用，這與Kummerová對(duì)FLT影響其他種子發(fā)芽的研究結(jié)果一致[7]。

多環(huán)芳烴具有高度的脂溶性，F(xiàn)LT也不例外，容易與生物膜發(fā)生作用，使膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，從而抑制植物生長(zhǎng)和細(xì)胞的代謝活性。種子發(fā)芽過(guò)程中，75%的脂類(lèi)會(huì)被乙醛酸循環(huán)轉(zhuǎn)化成糖類(lèi)，水解和脂肪酸的β-氧化也是脂類(lèi)代謝的重要過(guò)程，F(xiàn)LT或者其光解產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)促使活性氧物質(zhì)(ROS)生成，造成脂質(zhì)過(guò)氧化[6-8]，也可能會(huì)抑制或破壞脂類(lèi)代謝中的酶活性。此外，F(xiàn)LT進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在微粒體水平發(fā)生氧化生物轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物可能成為氧化磷酸化反應(yīng)的脫偶聯(lián)劑，從而阻礙種子細(xì)胞的呼吸代謝，減少細(xì)胞能量供應(yīng)。

FLT脅迫時(shí)間越久、濃度越高，幼苗長(zhǎng)度受到的抑制作用越明顯，這可能與FLT的生物轉(zhuǎn)化酶合成有關(guān)。外源化合物的生物轉(zhuǎn)化酶往往具有可誘導(dǎo)性，隨脅迫時(shí)間和脅迫濃度的增加，F(xiàn)LT的生物轉(zhuǎn)化酶合成量變大，F(xiàn)LT的中間產(chǎn)物隨之增多，呼吸代謝的阻礙和破壞更加嚴(yán)重，導(dǎo)致細(xì)胞能量產(chǎn)生效率不斷降低，從而抑制蛋白質(zhì)的合成代謝途徑。FLT與大豆種子萌發(fā)代謝過(guò)程中酶的相互作用機(jī)制比較復(fù)雜，有待在細(xì)胞和分子水平上做進(jìn)一步深入研究。

圖3 熒蒽(FLT)對(duì)大豆幼苗長(zhǎng)度的影響注:圖中標(biāo)有不同字母者表示數(shù)據(jù)組間差異顯著(p＜0.05)。Fig.3 Effects of fluoranthene on length of soybean seedlingsNote:Data represented as mean±standard error.Values followed by the same letter are not significantly different(LSD,p＜0.05).

[1]劉增俊,滕應(yīng),黃標(biāo),等.長(zhǎng)江三角洲典型地區(qū)農(nóng)田土壤多環(huán)芳烴分布特征與源解析[J].土壤學(xué)報(bào),2010,(6):1110－1117 Liu Z J,Teng Y,Huang B,et al.Distribution and sources analysis of PAHs in farmland soils in areas typical of the Yangtze River Delta,China[J].Acta Pedologica Sinica,2010,(6):1110－1117(in Chinese)

[2]呂金剛,畢春娟,陳振樓,et al.上海市崇明島農(nóng)田土壤中多環(huán)芳烴分布和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[J].環(huán)境科學(xué),2012,12):4270－4275 Lu J G,Bi C J,Chen Z L,et al.Distribution and ecological risk assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons in agricultural soil of the Chongming Island in Shanghai[J].Environmental Science,2012,(12):4270－4275(in Chinese)

[3]Tao S,Cui Y H,Xu F L,et al.Polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)in agricultural soil and vegetables from Tianjin[J].The Science of the Total Environment,2004,320(1):11－24

[4]宋玉芳，孫鐵珩，張麗珊.土壤－植物系統(tǒng)中多環(huán)芳烴和重金屬的行為研究[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),1995,(4):417－422 Song Y F,Sun T H,Zhang L S.Behaviors of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)and heavy metals in soilplant system[J].Chinese Journal of Applied Ecology,1995,(4):417－422(in Chinese)

[5]Kolb M,Harms H.Metabolism of fluoranthene in different plant cell cultures and intact plants[J].Environmental Toxicology and Chemistry,2000,19(5):1304－1310

[6]劉泓,葉媛蓓,崔波,等.多環(huán)芳烴熒蒽誘導(dǎo)擬南芥氧化脅迫[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2008,(02):413－418 Liu H,Ye Y B,Cui B,et al.Responses of Arabidopsis thaliana to oxidative stress induced by polycyclic aromatic hydrocarbon fluoranthene[J].Chinese Journal of Applied Ecology,1995,(4):417－422(in Chinese)

[7]Kummerová M,Slovák L,Mazánková J,et al.The effect of fluoranthene on the germination of plants[J].Toxicological&Environmental Chemistry,1997,60(1-4):235－244

[8]Oguntimehin I,Eissa F,Sakugawa H.Negative effects of fluoranthene on the ecophysiology of tomato plants(Lycopersicon esculentumMill):Fluoranthene mists negatively affected tomato plants[J].Chemosphere,2010,78(7):877－884