曹閃，樓欽欽，魏無(wú)際，秦占芬,*

1.南京工業(yè)大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京210009

2.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085

隨著化工業(yè)、制造業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的快速發(fā)展，工業(yè)原料、重金屬、農(nóng)藥、藥物等各類化學(xué)物質(zhì)大量排放進(jìn)入環(huán)境。其中一些化學(xué)物質(zhì)具有內(nèi)分泌干擾作用，可能影響野生動(dòng)物和人體正常的生長(zhǎng)發(fā)育。有文獻(xiàn)顯示，目前發(fā)現(xiàn)的野生動(dòng)物種群數(shù)量下降[1,2]、性別分化異常[3-5]、雄性精子質(zhì)量下降[6]、生殖功能障礙[7-11]等可能與內(nèi)分泌干擾物有關(guān)。

非洲爪蟾卵母細(xì)胞個(gè)體較大、易獲得、操作方便，一直以來(lái)廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)與調(diào)節(jié)、蛋白功能、離子通道等研究中[12-16]。卵母細(xì)胞在成熟前停滯在第一次減數(shù)分裂前期，可在體外經(jīng)孕酮等激素誘導(dǎo)發(fā)生生發(fā)泡破裂(GVBD)，在卵母細(xì)胞動(dòng)物極出現(xiàn)一個(gè)外緣著色較深、邊緣整齊的白色小斑，標(biāo)志著卵母細(xì)胞成熟。GVBD的發(fā)生可通過(guò)三氯乙酸固定卵母細(xì)胞后切開觀察細(xì)胞核是否消失來(lái)確定。非洲爪蟾GVBD在發(fā)育生物學(xué)、生殖學(xué)研究[17-21]中已有一定應(yīng)用，由于該過(guò)程受激素調(diào)節(jié)與控制，較容易受到內(nèi)分泌干擾物的影響，卵母細(xì)胞GVBD方法也被嘗試用于內(nèi)分泌干擾物的研究[22,23]。Pickford等[23]通過(guò)GVBD方法篩查[24]發(fā)現(xiàn)17α-乙炔基雌二醇也能抑制孕酮誘導(dǎo)的非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD發(fā)生。Pickford等[23]基于20次重復(fù)試驗(yàn)的研究結(jié)果顯示孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)生50%GVBD的濃度范圍為2.5～400 nmol·L-1，且目前用于篩查藥物的GVBD方法暴露時(shí)間多選為24 h[22,23]，非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD試驗(yàn)方法存在著來(lái)源于不同個(gè)體的卵母細(xì)胞對(duì)孕酮的敏感性差異過(guò)大、暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

鑒于此，本文擬從減少個(gè)體敏感性的差異、提高敏感性、縮短試驗(yàn)時(shí)間等方面，優(yōu)化非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD試驗(yàn)方法，選擇甲氧氯作為陽(yáng)性參照物驗(yàn)證優(yōu)化方法，之后應(yīng)用此方法研究某些化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)分泌干擾作用。Loutradis等[25]研究發(fā)現(xiàn)，米非司酮能夠明顯抑制經(jīng)HCG處理的小鼠排卵，而Pickford等[23]報(bào)道米非司酮不影響孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞GVBD，也就是說(shuō)米非司酮對(duì)排卵的作用還有爭(zhēng)議。Pritts等[26]發(fā)現(xiàn)來(lái)曲唑在體內(nèi)可干擾激素的分泌，對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育有一定的影響。咪鮮胺也是一種可疑的內(nèi)分泌干擾物，有人報(bào)道咪鮮胺與促黃體激素協(xié)同促進(jìn)虹鱒魚濾泡成熟[27]。因此，本研究用優(yōu)化的非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD試驗(yàn)研究這三種化學(xué)物質(zhì)的在此過(guò)程的內(nèi)分泌干擾作用。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器:眼科剪、鑷子、帶線縫合針、恒溫培養(yǎng)箱(MIR-153,Sanyo,Japan)、培養(yǎng)皿(Corning,USA)、玻璃離心管、體式顯微鏡(SZ660T2L,Optec,China)、搖床(QB-128,Kylin-Bell,China)。

試劑:孕酮(Dr.Ehrenstorfer,Germany)、人絨毛膜促性腺激素(HCG，煙臺(tái)北方制藥有限公司)、咪鮮胺(Fluka,USA)、來(lái)曲唑(European pharmacopeia reference standard)、甲氧氯(AccuStandard,USA)、米非司酮(AccuStandard,USA)、HEPES(Sigma,USA)、MS-222(Sigma,USA)、膠 原 酶 (type1A,sigma,USA)、三 氯 乙 酸(Biotopped,China)、青鏈雙抗(Biotopped,China)、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?，?gòu)自北京試劑公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 非洲爪蟾及HCG預(yù)注射

成年雌性非洲爪蟾飼養(yǎng)于盛有去氯自來(lái)水的玻璃缸內(nèi)，水溫(22±2)℃，明暗光照射周期為12 h:12 h。成蛙每周喂兩次，飼料為豬肝:商品飼料按1:1配比，喂食2 h后換水。試驗(yàn)前2周，背部淋巴囊預(yù)注射100 IU HCG。

1.2.2 溶液配制

OR-2溶液:準(zhǔn)確稱量4.797 g NaCl;0.186 g KCl;0.203 g MgCl2·6H2O;1.192 g HEPES混合溶于雙蒸水中，混勻定容至1 000 mL，用1 mol·L-1NaOH 調(diào) pH值至7.4～7.6，高壓高溫滅菌后分裝保存于4℃以備使用。

ND-96溶液:準(zhǔn)確稱量5.616 g NaCl;0.149 g KCl;0.200 g CaCl2;0.203 g MgCl2·6H2O;1.192 g HEPES;0.275 g C3H3NaO3混合溶于雙蒸水中，混勻定容至1 000 mL，用 1 mol·L-1NaOH 調(diào) pH 值至7.4 ～7.6，高壓高溫滅菌后分裝保存于4℃以備使用。

膠原酶消化溶液:準(zhǔn)確稱量0.15 g膠原酶，溶于盛有10 mL OR-2溶液的玻璃離心管中，配制成10×溶液存放于4℃以備使用。

1.2.3 非洲爪蟾卵母細(xì)胞獲取與體外培養(yǎng)

預(yù)注射HCG的雌性爪蟾，用MS-222麻醉(若翻正反射消失，說(shuō)明已經(jīng)被麻醉);腹部向上平放于托盤上，用酒精棉球擦拭腹部皮膚以消毒，然后用針頭挑起下腹部正中偏右的皮膚，用眼科剪剪開1 cm左右小口，再剪開小口內(nèi)部肌肉層，即可看到卵母細(xì)胞;用鑷子和剪刀小心取出所需量的卵巢小葉，將之放入預(yù)先配制好的含有青鏈霉素的OR-2溶液的培養(yǎng)皿中;然后分別縫合肌肉層和皮膚層(注意趕出皮膚層與肌肉層之間的氣泡);最后將爪蟾放于淺水中休息3～4 h，水面不要沒過(guò)頭部，待其慢慢恢復(fù)體力后放回飼養(yǎng)缸內(nèi)。取出的卵巢小葉用鑷子撕破包裹在卵母細(xì)胞外層的膜性組織，用剪刀剪成20～30個(gè)卵母細(xì)胞團(tuán)，此過(guò)程應(yīng)避免剪刀和鑷子刺及細(xì)胞造成損傷;用已滅菌的移液管將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有10 mL膠原酶溶液的玻璃離心管中，置于搖床上搖動(dòng)1 h，再重新更換膠原酶溶液繼續(xù)搖動(dòng)40 min～1 h，此時(shí)看到大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)分離成單個(gè)細(xì)胞。除去消化液，用含青鏈霉素的OR-2溶液清洗5～6次，再用ND-96溶液清洗2～3次，轉(zhuǎn)入含ND-96溶液培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下觀察并挑選出表面光滑，無(wú)殘留纖維組織及毛細(xì)血管的V～VI期卵母細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中20℃培養(yǎng)以用于后續(xù)試驗(yàn)。以上實(shí)驗(yàn)操作均在常溫下進(jìn)行。

1.3 孕酮誘導(dǎo)非洲爪蟾GVBD的時(shí)間和濃度優(yōu)化

孕酮溶于 DMSO中配成 105μmol·L-1儲(chǔ)存液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用 ND-96 溶液釋成 1 nmol·L-1，10 nmol·L-1，100 nmol·L-1，1 000 nmol·L-14個(gè)濃度梯度，向12孔培養(yǎng)板中分別加入2 mL稀釋后的孕酮溶液，每個(gè)暴露濃度設(shè)置3個(gè)平行孔，每孔隨機(jī)放置20個(gè)卵母細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置DMSO溶劑對(duì)照組。之前的文獻(xiàn)報(bào)道，暴露時(shí)間多采用 24 h，在我們預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察到經(jīng)24h，12h，8h卵母細(xì)胞的成熟率已經(jīng)很高，甚至100%，因此我們選擇4 h和8 h來(lái)優(yōu)化方法。在培養(yǎng)箱(18℃ ～22℃)經(jīng)孕酮誘導(dǎo)4 h、8 h后，觀察并記錄發(fā)生GVBD的卵母細(xì)胞個(gè)數(shù)，并用10%三氯乙酸溶液固定確認(rèn)核是否消失來(lái)確認(rèn)。統(tǒng)計(jì)每組發(fā)生GVBD的卵母細(xì)胞所占的百分比(GVBD%)，同時(shí)用概率分析(Probit analysis)計(jì)算4 h后誘導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)生50%GVBD的孕酮濃度值(EC50)。

1.4 甲氧氯對(duì)孕酮誘導(dǎo)GVBD的影響

甲氧氯溶于 DMSO中配成 5×105μmol·L-1儲(chǔ)存液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用10 nmol·L-1的孕酮溶液(根據(jù)計(jì)算出的EC50范圍選擇)分別稀釋成 100 nmol·L-1，1 000 nmol·L-1，10 000 nmol·L-13個(gè)濃度，向12孔培養(yǎng)板中分別加入2 mL稀釋后的甲氧氯溶液，每個(gè)暴露濃度設(shè)置3個(gè)平行孔，每孔隨機(jī)放置20個(gè)卵母細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置10 nmol·L-1孕酮作為對(duì)照組。在培養(yǎng)箱(20℃)暴露4 h后觀察并記錄發(fā)生GVBD的卵母細(xì)胞的個(gè)數(shù)，并用10%三氯乙酸溶液固定確認(rèn)核是否消失來(lái)確認(rèn)。統(tǒng)計(jì)兩次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD%。

1.5 米非司酮、咪鮮胺，來(lái)曲唑?qū)?duì)孕酮誘導(dǎo)GVBD的影響

米非司酮、咪鮮胺、來(lái)曲唑溶于DMSO中分別配成 105μmol·L-1、106μmol·L-1、106μmol·L-1儲(chǔ)存液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用10 nmol·L-1孕酮溶液(根據(jù)計(jì)算出的EC50范圍選擇)分別稀釋成 100 nmol·L-1，1 000 nmol·L-1兩個(gè)濃度，向12孔培養(yǎng)板中分別加入2 mL稀釋后的米非司酮、咪鮮胺、來(lái)曲唑溶液，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行孔，每孔隨機(jī)放置20個(gè)卵母細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置10 nmol·L-1孕酮作為對(duì)照組。在培養(yǎng)箱(20℃)暴露4 h后觀察記錄，記錄方法如上所述。統(tǒng)計(jì)兩次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD%。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用概率分析(Probit analysis)計(jì)算EC50。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的差異采用方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，顯著性水平為p＜0.05，數(shù)據(jù)分析使用SPSS16.0版本(IBM,USA)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 孕酮誘導(dǎo)非洲爪蟾GVBD的時(shí)間和濃度優(yōu)化

圖1表示的是經(jīng)孕酮誘導(dǎo)4 h、8 h后，非洲爪蟾卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD%，數(shù)據(jù)反映的是來(lái)自3只雌性非洲爪蟾的卵母細(xì)胞的GVBD趨勢(shì)。在不同孕酮濃度(1 nmol·L-1、10 nmol·L-1、100 nmol·L-1、1000 nmol·L-1)經(jīng)誘導(dǎo)4 h后，非洲爪蟾卵母細(xì)胞均發(fā)生GVBD現(xiàn)象，GVBD%分別為10.56%、53.89%、85.00%、98.33%;經(jīng)誘導(dǎo)8 h后，GVBD%分別為25.00%、67.78%、91.67%、98.33%。不同個(gè)體來(lái)源的卵母細(xì)胞經(jīng)孕酮誘導(dǎo)4 h后的GVBD%結(jié)果如圖2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在相同孕酮濃度、相同誘導(dǎo)時(shí)間下，不同個(gè)體的卵母細(xì)胞所產(chǎn)生的GVBD%不同，非洲爪蟾卵母細(xì)胞對(duì)孕酮的敏感性存在個(gè)體差異?；?次孕酮誘導(dǎo)非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果，得到誘導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)生50%GVBD的孕酮濃度范圍為5.15 nM～58.70 nmol·L-1。卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD卵細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核的變化如圖3所示:與GV期相比，GVBD期卵母細(xì)胞動(dòng)物級(jí)形成一個(gè)白色斑點(diǎn)，白斑周圍著色較深;用10%三氯乙酸固定后切開，發(fā)現(xiàn)GV期卵母細(xì)胞(未成熟)核保持完整，GVBD期卵母細(xì)胞(成熟)核消失，即確實(shí)發(fā)生了GVBD現(xiàn)象。

圖1 時(shí)間對(duì)孕酮誘導(dǎo)非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD的影響Fig.1 Effect of time on progesterone induced Xenopus occyte GVBD in vitro

圖2 孕酮4h體外誘導(dǎo)非洲爪蟾的卵母細(xì)胞GVBD試驗(yàn)Fig.2 Doses of progesterone induced Xenopus occyte GVBD in vitro after 4 hours

圖3 A:未成熟的卵母細(xì)胞(GV期);B:孕酮誘導(dǎo)的成熟的卵母細(xì)胞(GVBD期)，動(dòng)物級(jí)出現(xiàn)白斑如圖中白色箭頭所指;C:用三氯乙酸固定后切開的未成熟的卵母細(xì)胞細(xì)胞核保持完整如圖中白色箭頭所指;D:用三氯乙酸固定后切開的成熟的卵母細(xì)胞細(xì)胞核完全消失如圖中白色箭頭所指。Fig.3 A:Immature oocyte(GV stage);B:Mature oocyte induced by progesterone(GVBD stage),white spot appeared on the animal pole(white arrow);C:Immature oocyte(GV stage)with intact nucleus(white arrow)was observed after fixing with trichioroacetic acid and cracking open;D:when GVBD occurring,mature oocyte nucleus with disappeared nucleus(white arrow)was observed after fixing with trichioroacetic acid and cracking open.

2.2 甲氧氯對(duì)孕酮誘導(dǎo)的非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD的影響

甲氧氯對(duì)孕酮誘導(dǎo)的非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD的影響如圖4所示。將孕酮對(duì)照組GVBD%設(shè)置為100% ，100 nmol·L-1、1 000 nmol·L-1、10 000 nmol·L-1甲氧氯暴露組卵母細(xì)胞GVBD%分別為34.93%、11.91%、10.06%，顯示甲氧氯對(duì)孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟具有抑制作用，且隨著甲氧氯濃度增大，抑制作用增強(qiáng)。

圖4 甲氧氯對(duì)孕酮誘導(dǎo)非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD的影響(*表示與對(duì)照組相比差異顯著，P＜0.05)。Fig.4 Effects of various concentrations of methoxychlor on progesterone induced Xenopus occyte GVBD(Statistically significant differences(P＜0.05)between treatment groups and the control are shown as*).

圖5 米非司酮、咪鮮胺、來(lái)曲唑?qū)υ型T導(dǎo)非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD的影響(*表示與對(duì)照組相比差異顯著，p＜0.05)。Fig.5 Effects of various concentrations of mifepristone,prochloraz,letrozole on progesterone-induced Xenopus occyte GVBD(Statistically significant differences(P＜0.05)between treatment groups and the control are shown as*).

2.3 米非司酮、咪鮮胺、來(lái)曲唑?qū)υ型T導(dǎo)的非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD的影響

圖5反映的是米非司酮、咪鮮胺、來(lái)曲唑?qū)υ型T導(dǎo)的非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD的影響:將對(duì)照組GVBD%設(shè)置為100%，米非司酮100 nmol·L-1、1 000 nmol·L-1暴露組卵母細(xì)胞GVBD%分別為106.67%，97.95%，對(duì)孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟過(guò)程沒有顯著影響。咪鮮胺和來(lái)曲唑 100 nmol·L-1、1 000 nmol·L-1暴露組卵母細(xì)胞GVBD%分別為100.49%、101.14%和97.57%、99.56%，兩種藥物對(duì)孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟過(guò)程均沒有顯著影響。

3 討論(Discussion)

有文獻(xiàn)報(bào)道[23]，非洲爪蟾卵母細(xì)胞對(duì)孕酮的敏感性存在很大的個(gè)體差異，孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)生50%GVBD 的濃度范圍從 2.5 nmol·L-1～ 400 nmol·L-1，而且一般在暴露24h后才會(huì)有較高的誘導(dǎo)率。如此大的個(gè)體差異會(huì)增加結(jié)果的不確定性，有相應(yīng)提高實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)的要求。Fortune等[28]曾發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)非洲爪蟾卵巢組織時(shí)用HCG孵育后，孕酮濃度明顯升高。而且，在其它誘導(dǎo)非洲爪蟾排卵的研究中，HCG預(yù)注射會(huì)大大提高誘導(dǎo)排卵的效率。因此，本研究希望通過(guò)HCG預(yù)注射處理，提高卵母細(xì)胞對(duì)孕酮誘導(dǎo)的敏感性，降低個(gè)體敏感性的差異。結(jié)果我們?cè)陬A(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，非洲爪蟾經(jīng)提前預(yù)注射HCG處理，其卵母細(xì)胞對(duì)孕酮誘導(dǎo)的敏感性大大提高，一定劑量下孕酮暴露12 h，GVBD發(fā)生的百分率幾乎到100%?？紤]到用非洲爪蟾GVBD試驗(yàn)檢測(cè)化學(xué)品內(nèi)分泌干擾效應(yīng)時(shí)，如果孕酮本身的誘導(dǎo)效應(yīng)過(guò)強(qiáng)可能會(huì)掩蓋測(cè)試物本身的效應(yīng)，而且卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD后，如果在培養(yǎng)液中的培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，卵細(xì)胞狀態(tài)會(huì)變差，影響后續(xù)顯微鏡確定GVBD的準(zhǔn)確性，因此孕酮和測(cè)試物的暴露應(yīng)該控制在一個(gè)相對(duì)短的時(shí)間。同時(shí)，如果暴露時(shí)間過(guò)短，一些化學(xué)測(cè)試物可能會(huì)因?yàn)槟承├砘再|(zhì)而不能充分起作用。所以，本研究在設(shè)置孕酮誘導(dǎo)暴露時(shí)間時(shí)，選擇了4 h和8 h兩個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞經(jīng)孕酮誘導(dǎo)4 h后已有相當(dāng)比例的卵出現(xiàn)GVBD，因此，我們選擇4 h作為暴露時(shí)間，將更有利于觀察測(cè)試物對(duì)卵母細(xì)胞從GVBD啟動(dòng)到完全成熟過(guò)程的影響。

在4 h的暴露條件下，我們5次重復(fù)孕酮誘導(dǎo)GVBD試驗(yàn)，定量研究了不同個(gè)體對(duì)孕酮敏感性的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕酮誘導(dǎo)卵母細(xì)胞發(fā)生50%GVBD的濃度范圍為 5.15 nmol·L-1～ 58.70 nmol·L-1。這一范圍的誘導(dǎo)劑量明顯低于Pickford等[23]研究中的2.5 nmol·L-1～400 nmol·L-1的孕酮?jiǎng)┝?，顯示本研究中的非洲爪蟾卵母細(xì)胞對(duì)孕酮有較高的敏感性，而且個(gè)體差異比Pickford等的研究明顯降低。證明HCG預(yù)注射非洲爪蟾對(duì)孕酮誘導(dǎo)GVBD試驗(yàn)有重要的意義。

在提高非洲爪蟾卵母細(xì)胞對(duì)孕酮誘導(dǎo)的敏感性、縮小個(gè)體差異、縮短暴露時(shí)間方面，對(duì)孕酮誘導(dǎo)GVBD試驗(yàn)進(jìn)行了優(yōu)化后，本研究選擇以前報(bào)道中可抑制孕酮誘導(dǎo)GVBD的甲氧氯作為參考物質(zhì)，對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲氧氯暴露濃度為100nmol·L-1、1 000nmol·L-1、10 000 nmol·L-1時(shí)，GVBD%為34.93%、11.91%、10.07%，與Bodart等人[22]得出的甲氧氯暴露濃度為 62.5 nmol·L-1、250nmol·L-1、4 000 nmol·L-1時(shí) GVBD% 為 94.8%、76.35%、32.93%的結(jié)果相比，發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)方法下甲氧氯對(duì)非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD抑制作用更為明顯，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)方法可靠且更為靈敏。

來(lái)曲唑是一種芳香化酶抑制劑，在體內(nèi)可干擾生殖激素的平衡，對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育有一定的影響[26]。研究顯示咪鮮胺在體外可單獨(dú)或與促黃體激素協(xié)同促進(jìn)虹鱒魚濾泡成熟，表現(xiàn)出一定的內(nèi)分泌干擾作用[27]。但在本研究中，這兩種化學(xué)物質(zhì)對(duì)孕酮誘導(dǎo)GVBD未產(chǎn)生影響，雖然這兩種化學(xué)物質(zhì)在某些環(huán)節(jié)上具有內(nèi)分泌干擾作用，但在GVBD的成熟上沒有干擾作用。

米非司酮是一種抗早孕藥，通過(guò)與孕酮受體結(jié)合，抑制孕酮作用。Loutradis等[25]曾報(bào)道，米非司酮能夠明顯抑制經(jīng)HCG處理的小鼠的排卵，并認(rèn)為此現(xiàn)象是米非司酮是通過(guò)與孕酮受體結(jié)合而影響了卵巢的激素水平而導(dǎo)致的。而本研究中，我們卻未發(fā)現(xiàn)米非司酮對(duì)孕酮誘導(dǎo)的非洲爪蟾GVBD有明顯的抑制作用。這一結(jié)果與Pickford[23]等的報(bào)道一致。雖然孕酮誘導(dǎo)非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD是生物學(xué)上研究卵細(xì)胞成熟過(guò)程及其機(jī)制的良好模型，但目前對(duì)這一誘導(dǎo)機(jī)制的認(rèn)識(shí)并不完全清楚。最近Evaul等[29]指出，卵母細(xì)胞成熟過(guò)程存在激素與受體的交互介導(dǎo)作用，孕酮誘導(dǎo)非洲爪蟾卵母細(xì)胞成熟是通過(guò)與孕酮受體、睪酮受體(AR)結(jié)合而導(dǎo)致的，這種結(jié)合作用和孕酮濃度高低沒有關(guān)系。本研究中發(fā)現(xiàn)的孕酮受體抑制劑米非司酮不能抑制孕酮誘導(dǎo)的GVBD，為Evaul等人的觀點(diǎn)提供了支持。

綜上所述:本文通過(guò)提高個(gè)體敏感性、縮小個(gè)體差異、縮短試驗(yàn)時(shí)間等方面對(duì)非洲爪蟾卵母細(xì)胞GVBD試驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn)，優(yōu)化后的GVBD試驗(yàn)方法可用于篩查干擾該過(guò)程的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)，關(guān)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞體外成熟機(jī)制及環(huán)境化學(xué)物質(zhì)對(duì)該過(guò)程的影響途徑有待于更深入的研究。

致謝:特別感謝中國(guó)軍事科學(xué)研究院卓仁恭同學(xué)的幫助。

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