王光演，牛志宏，孫貽娟，馮云

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院生殖中心，上海200025）

月經(jīng)中期黃體生成素（LH）峰出現(xiàn)促使卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體發(fā)生一系列變化，最終誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)、卵泡墻破裂和黃體形成。但卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞不表達(dá)或僅微量表達(dá)LH受體，因此需要通過相關(guān)信號來介導(dǎo)LH峰效應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子樣因子（EGF-like factor）通過旁分泌和自分泌途徑介導(dǎo)LH 峰效應(yīng)［1］。EGF-like factor包括雙調(diào)蛋白（Areg）、上皮調(diào)節(jié)蛋白（Ereg）和細(xì)胞調(diào)節(jié)素（BTC），其中Areg在人卵泡液中含量最高［2］。本文探討體外受精／卵胞漿內(nèi)單精子注射（IVF／ICSI）促排卵中依據(jù)誘導(dǎo)排卵日雌二醇（E2）水平，減少人絨毛膜促性腺激素（HCG）誘導(dǎo)排卵劑量對卵泡液Areg表達(dá)及卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響。

資料與方法

一、研究對象

收集2013年4月～8月于本院生殖中心行IVF／ICSI助孕患者，入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）卵巢儲備功能正常：年齡≤35歲，基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）≤12U／L，雙側(cè)竇卵泡數(shù)≥6枚；（2）常規(guī)長方案促排卵；（3）雙方染色體核型正常；（4）排除子宮腺肌病、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征及甲狀腺功能異常。共納入185例患者，根據(jù)HCG誘導(dǎo)排卵劑量分為4組：3 000U 組（A 組）、4 000U 組（B組）、5 000U 組（C組）和7 000U組（D組）。

二、研究方法

1．治療方案：采用常規(guī)長方案促排卵，即月經(jīng)黃體中期開始使用促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a）（達(dá)必佳，輝瑞，德國）降調(diào)節(jié)，0．1mg皮下肌注7d后改0．05mg至HCG誘導(dǎo)，月經(jīng)第3～5天啟動促排。促性腺激素（Gn）包括重組FSH（果納芬，默克雪蘭諾，瑞士）或尿源性FSH（麗申寶，珠海麗珠制藥）。陰道B超下監(jiān)測卵泡發(fā)育，結(jié)合血清激素水平調(diào)整促排藥物劑量。采用化學(xué)發(fā)光法（儀器：DXI800，BECKMAN，美國）測定血清激素水平。當(dāng)優(yōu)勢卵泡群中有兩個或以上卵泡直徑≥2．2cm時予以注射用HCG（珠海麗珠制藥）誘導(dǎo)排卵。HCG誘導(dǎo)排卵劑量的確定依據(jù)誘導(dǎo)排卵日血清E2水平，根據(jù)本中心前期臨床實踐經(jīng)驗及文獻(xiàn)總結(jié)，高E2水平（＞25 690pmol／L）者予以 HCG 3 000U；E2水平介于22 020～25 690pmol／L之間者予以 HCG 4 000U；正常E2水平者（14 680～22 020pmol／L）予以 HCG 5 000U；低E2水平者（＜14 680pmol／L）予以HCG 7 000U。34～36h后B超引導(dǎo)下經(jīng)陰道行取卵術(shù)，根據(jù)男方精液情況行常規(guī)IVF或ICSI。第3天根據(jù)胚胎形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)即卵裂球數(shù)目、碎片程度和胚胎極性評估胚胎，卵裂球數(shù)目：8～10細(xì)胞為4分，6～7細(xì)胞為3分，5細(xì)胞為2分；碎片程度：碎片占胚胎體積＜5%為4分，占5%～10%為3分，占10%～25%為2分，占25%～50%為1分。胚胎極性：卵裂球大小均勻為1分，不均勻為0分。三者得分相加即為總評分，融合胚為10分，評分≥5分為可用胚胎，≥9分為優(yōu)質(zhì)胚胎。

2．卵泡液收集及檢測：取卵同時收集首管單卵泡液，隨機選取一側(cè)卵巢中直徑為19～21mm的優(yōu)勢卵泡，行首管單卵泡單獨穿刺，吸取卵泡液并單獨放至培養(yǎng)皿中，待吸取卵母細(xì)胞后，收集皿中卵泡液。卵泡液于室溫下500r／min離心10min，吸取其上清液分裝至1．5ml EP管直接－80℃凍存待測。Areg的檢測方法為夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（DY262，R＆D，美 國），靈 敏 度 15．6～1 000pg／ml。卵泡液HCG的檢測方法與血清性激素水平的檢測方法相同。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用χ2檢驗，計數(shù)資料采用ANOVA檢驗，兩變量間相關(guān)性分析采用Spear-man檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、4組患者一般情況、促排卵情況及實驗室結(jié)局比較

4組患者的年齡、不育年限、基礎(chǔ)FSH、LH、E2水平等一般情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。D組體重指數(shù)（BMI）高于其他3組，A組低于C組、D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；B組與C組間無顯著性差異（P＞0．05）（表1）。B組、C組Gn促排卵天數(shù)少于D組（P＜0．05），A組和B組Gn用量少于C組和D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。4組HCG日E2值組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）。4組 HCG日LH 值無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）（表1）A組和B組獲卵數(shù)分別與其他3組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。A組受精率高于C組，A組和B組可用胚胎數(shù)多于C組和D組，上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。4組的卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）（表1）。其中A組發(fā)生2例中度卵巢過度刺激綜合征（OHSS），其余3組無OHSS發(fā)生。

二、4組卵泡液中Areg和HCG水平比較

4組Areg濃度無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）。D組HCG水平與A組、B組比較，C組與A組比較，有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）（表2）。

進(jìn)一步比較同一患者卵泡液Areg與HCG水平是否存在相關(guān)性，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)卵泡液Areg表達(dá)與HCG水平之間存在相關(guān)性。

表1 4組一般情況、促排卵情況及實驗室結(jié)局的比較［（±s），%（n）］

表1 4組一般情況、促排卵情況及實驗室結(jié)局的比較［（±s），%（n）］

注：與其他3組比較，aP＜0．05；與C、D組比較，b P＜0．05；與B、C組比較，c P＜0．05；與C組比較，d P＜0．05

組 別 例數(shù) 年齡（歲） 不育年限（年） BMI（kg／m2） 基礎(chǔ)FSH（U／L） 基礎(chǔ)LH（U／L）A組 69 29．68±3．84 3．81±2．30 20．44±2．08b 7．17±1．68 4．43±1．70 B組 31 29．54±3．14 3．90±2．18 21．28±2．70 7．36±1．87 4．32±2．08 C組 67 29．79±3．87 4．25±3．02 21．40±2．86 7．48±1．54 4．02±1．71 D組 18 29．77±3．73 3．95±2．80 22．79±2．81a 7．74±1．80 4．69±2．46組 別 例數(shù) 基礎(chǔ)E2（pmol／L） Gn天數(shù)（d） Gn用量（U） HCG日E2（pmol／L） LH（U／L）A組 69 123．4±58．4 11．83±1．69 1 821±646b 29 545±4 535a 1．17±0．76 B組 31 119．6±51．1 11．35±1．47 2 043±759b 22 587±2 467a 1．01±0．44 C組 67 122．3±60．4 11．70±1．58 2 500±841 17 992±3 334a 1．11±0．50 D組 18 117．8±47．9 12．61±1．68c 2 649±978 11 391±2 924a 1．17±0．78組 別 例數(shù) 獲卵數(shù)（枚） MII卵率 受精率 卵裂率 可用胚胎數(shù)（枚） 優(yōu)質(zhì)胚胎率A組 69 17．03±4．73a78．57 71．83（844／1 175）d 99．53（840／844） 7．32±4．45b 10．30（52／505）B組 31 14．32±3．81a77．01 70．95（315／444） 99．37（313／315） 7．13±3．71b 11．31（25／221）C組 67 12．19±3．88 76．32 67．32（550／817） 98．91（544／550） 5．46±2．98 11．75（43／366）D組 18 10．89±2．72 77．78 65．82（129／196） 99．22（128／129） 4．72±2．30 5．88（5／85）

表2 四組患者卵泡液中Areg和HCG水平的比較（±s）

表2 四組患者卵泡液中Areg和HCG水平的比較（±s）

注：與 A、B組比較，aP＜0．05；與 A組比較，b P＜0．05

組 別 例數(shù) Areg（ng／mL） HCG（U／L）A組69 90．36±38．82 23．30±10．99 B組 31 82．46±36．72 29．70±20．86 C組 67 93．63±42．71 32．84±18．97b D組 18 98．83±50．62 40．14±20．15a

討 論

在臨床促排卵中，外源性HCG作為誘導(dǎo)排卵藥物，通過作用于LH／HCG共同受體模擬LH峰效應(yīng)。但由于HCG在血中的半衰期長于LH，既往臨床上常用的HCG誘導(dǎo)排卵劑量為10 000U，在卵巢高反應(yīng)者中容易誘發(fā)發(fā)生OHSS。目前減少HCG誘導(dǎo)排卵劑量是臨床促排卵時預(yù)防卵巢高反應(yīng)患者發(fā)生OHSS的一項策略［3］。本文主要研究目的是為驗證對于卵巢高反應(yīng)者減少HCG誘導(dǎo)排卵劑量是否可以降低OHSS發(fā)生，同時不影響卵母細(xì)胞的成熟度。因為樣本收集原因，誘導(dǎo)排卵日相似水平E2值樣本數(shù)較少，難以達(dá)到統(tǒng)計要求。故本文采用根據(jù)扳機日血清E2水平不同，階梯式減少HCG誘導(dǎo)排卵劑量進(jìn)行分組，對于卵巢高反應(yīng)者HCG誘導(dǎo)排卵劑量降至3 000U。

本研究按HCG日E2值分組，E2值可以作為卵巢反應(yīng)的一個指標(biāo)。4組患者的一般情況中年齡、不育年限、基礎(chǔ)性激素水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05），4組的BMI存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05），高E2值、Gn用量少的組BMI較低，這與關(guān)小紅等［4］的報道相符。他們報道BMI與卵巢反應(yīng)有關(guān)，隨著BMI降低，卵巢反應(yīng)增高，他們按BMI值大小分組（＜18．5kg／m2、18．5～24．9kg／m2、＞24．9kg／m2），其結(jié)果顯示低BMI組卵巢反應(yīng)好，其獲卵數(shù)、HCG日E2值高于高BMI組，Gn天數(shù)和Gn使用支數(shù)均少于高BMI組。

Schmidt等［5］報道對于卵巢高反應(yīng)患者減少HCG劑量不影響IVF結(jié)局，他們對HCG日E2值為14 680～18 350pmol／L者使用3 300UHCG，E2值為9 175～14 680pmol／L者使用5 000U HCG，結(jié)果顯示兩組的MII卵率、受精率無統(tǒng)計學(xué)差異。此外Nargund等［6］報道對于OHSS高危者HCG劑量降至2 500U仍不影響IVF結(jié)局。本研究中A組受精率高于C組，4組的卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率無統(tǒng)計學(xué)差異，A組和B組最終獲得的可用胚胎數(shù)高于C組和D組，說明對于卵巢高反應(yīng)患者HCG誘導(dǎo)排卵劑量降至3 000U并不影響卵母細(xì)胞成熟度，和上述文獻(xiàn)報道一致。

OHSS是IVF／ICSI過程中較嚴(yán)重的并發(fā)癥，好發(fā)于卵巢高反應(yīng)者，尤其是E2水平高、卵泡數(shù)多同時BMI較低者，預(yù)防OHSS發(fā)生在臨床促排卵操作中至關(guān)重要。本研究中A組發(fā)生2例中度OHSS，因樣本數(shù)較少，不能進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。但Kashyap等［3］一項大樣本研究證實對于卵巢高反應(yīng)者減少HCG誘導(dǎo)排卵能夠有效減少OHSS發(fā)生，他們比較同一HCG誘導(dǎo)排卵劑量1 790例，和依據(jù)HCG日E2值不同階梯式降低誘導(dǎo)排卵劑量的836例（E2值25 690～40 370pmol／L，HCG誘導(dǎo)排卵劑量為3 300～4 000U；E2值14 680～25 690pmol／L，HCG誘導(dǎo)排卵劑量5 000U；E2值＜14 680pmol／L，HCG誘導(dǎo)排卵劑量10 000U），結(jié)果顯示依據(jù)HCG日E2值減少HCG誘導(dǎo)排卵劑量后OHSS發(fā)生率明顯降低（OR：3．97），并且不影響最終妊娠結(jié)局。

Areg屬于EGF-like factor家族，在人卵泡液中的含量明顯高于其他幾個EGF-like factor成員［2］。LH峰出現(xiàn)或HCG誘導(dǎo)排卵后，作用于LH／HCG受體誘導(dǎo)卵泡顆粒細(xì)胞表達(dá)Areg。Areg通過相關(guān)途徑誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂恢復(fù)以及排卵相關(guān)基因，如環(huán)氧化酶2、透明質(zhì)酸合成酶2及腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6等的表達(dá)，促使卵丘擴展以及排卵反應(yīng)［7－8］。在卵母細(xì)胞體外成熟試驗（IVM）培養(yǎng)液中，添加Areg不但能夠增加MII卵，同時可促進(jìn)胚胎發(fā)育，Peluffo等［9］對恒河猴進(jìn)行試驗，結(jié)果顯示添加Areg組的＞8細(xì)胞胚胎數(shù)明顯多于未添加Areg組；同樣Ben-Ami等［10］在人的實驗中，結(jié)果也顯示添加Areg組發(fā)育到第2天（D2）、D3胚胎數(shù)明顯增多。Zamah等［2］的一項IVF／ICSI取卵后卵母細(xì)胞行單孔培養(yǎng)的研究，結(jié)果顯示不成熟的GV期卵母細(xì)胞或發(fā)育為異常胚胎的卵泡液中Areg水平明顯低于正常卵母細(xì)胞。此外Liu等［11］研究報道卵泡液Areg水平與可用胚胎數(shù)成正相關(guān)（r＝0．26，P＝0．01）。本研究結(jié)果顯示4組卵泡液Areg水平無統(tǒng)計學(xué)差異，進(jìn)一步提示卵巢高反應(yīng)患者HCG誘導(dǎo)排卵劑量降至3 000U并不影響卵母細(xì)胞成熟。

Chan等［12］研究顯示高劑量 HCG組血 HCG和卵泡液HCG水平均高于低劑量HCG組，提示卵泡液HCG可能為外源性的，另外他們認(rèn)為卵泡液和血中低水平HCG并不影響卵母細(xì)胞成熟。本研究結(jié)果顯示卵泡液HCG值與HCG誘導(dǎo)排卵劑量相關(guān)，與Chan等［12］報道的結(jié)果相似。Zamah等［2］研究發(fā)現(xiàn)單卵泡液中Areg與HCG成正相關(guān)（P＝0．016）。本研究將卵泡液中Areg與HCG水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果與之前的文獻(xiàn)報道［11］相似，未發(fā)現(xiàn)Areg與HCG存在相關(guān)性。Peluffo等［9］在恒河猴促排卵模型中研究顯示卵泡液Areg在HCG注射后12h、24h升高，而36h已經(jīng)開始下降。因取材困難，目前尚無人促排卵誘導(dǎo)排卵后卵泡液Areg表達(dá)時間譜。本研究取卵時間為HCG注射后34～36h，此時卵泡液Areg水平已經(jīng)處于下降期。因此我們猜測卵泡液中Areg可能與HCG相關(guān)性不大，仍需進(jìn)一步實驗研究驗證。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，減少HCG誘導(dǎo)排卵劑量并不影響卵泡液中Areg表達(dá)，卵泡液HCG水平與HCG誘導(dǎo)排卵劑量有關(guān)；依據(jù)HCG日E2水平不同，階梯式降低HCG誘導(dǎo)排卵劑量至3 000U的方法在臨床上有一定的可行性，需要大樣本研究驗證。

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