郭永，何森，2，蘇晨，，張瑤楠，王乾興，鄒檢平＊

（1．國家人口計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京100081；2．沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽110016；3．遵義醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，遵義563000）

乳腺癌患者中約有2／3的病人使用激素療法，但臨床療效仍不夠理想，目前各國科學(xué)家都在尋找新型抗乳腺癌藥物。已有研究報道證實米非司酮具有抗婦科腫瘤作用，但其機制尚不明晰，從而制約了其進一步的臨床應(yīng)用。本研究通過四甲基偶氮唑鹽法（MTT）測定不同濃度下米非司酮對乳腺癌MCF-7和T47D兩種細胞系增殖的抑制率，從而分別計算出兩種細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。本實驗研究可為后期開展米非司酮抗乳腺癌分子機制研究奠定實驗基礎(chǔ)。

材料與方法

一、研究對象

1．細胞系：乳腺癌細胞系 MCF-7和T47D購自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心。MCF-7和T47D分別用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．主要試劑：米非司酮（Sigma，美國），DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、FBS、0．25%胰蛋白酶（GIBCO，美國），MTT、二甲基亞砜（DMSO）（Amerosco，美國）。

二、實驗方法

1．MTT法檢測細胞IC50：取對數(shù)生長期的MCF-7和T47D細胞，用0．25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，分別以DMEM和RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%FBS）調(diào)整細胞懸液濃度為4×104／ml接種于96孔板，每孔100μl，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，加入米非司酮試劑，使其終濃度分別為0．01、0．1、0．5、1、2．5、10、25、50和100μmol／L，并設(shè)立空白組（不接種細胞）、對照組（接種細胞，但不加米非司酮）。每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔。將培養(yǎng)板放置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，各孔均 加 入 20 μl MTT 溶 液 （5mg／ml，即 0．5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。取6個孔的吸光值均數(shù)，按公式計算細胞抑制率（IR）：IR＝［對照組光吸收值（OD）值－實驗組OD值］／對照組OD值×100%。以平均抑制率為Y軸，米非司酮濃度為X軸分別繪制米非司酮濃度對兩種細胞抑制率的散點圖。通過直線回歸分別計算米非司酮對 MCF-7和T47D細胞的IC50。

2．細胞處理方法及實驗分組：根據(jù)細胞IC50實驗結(jié)果，分別用濃度為0．25、2．5、25和50μmol／L米非司酮處理人乳腺癌細胞系MCF-7和T47D細胞，處理1、2和3d后分別收集不同處理組細胞。根據(jù)米非司酮的濃度分為：對照組（control，以空白溶劑代替米非司酮）、0．25μmol／L組、2．5μmol／L組、25μmol／L組、50μmol／L組。

3．細胞形態(tài)學(xué)觀察：分別在米非司酮處理細胞1、2和3d后，用倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化和生長情況。

4．米非司酮處理后乳腺癌細胞增殖實驗：根據(jù)米非司酮處理乳腺癌細胞系MCF-7和T47D的細胞IC50結(jié)果，選取4個濃度梯度進行細胞增殖實驗。待細胞貼壁后，去上清，加含不同濃度米非司酮（0．25、2．5、25和50μmol／L）的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；每24h取出一板培養(yǎng)板棄去培養(yǎng)液，每孔加入新培養(yǎng)液90μl以及5mg／ml的MTT 10μl，繼續(xù)37℃培養(yǎng)4h；將培養(yǎng)板棄去上清，加入200μl DMSO溶解顆粒物，準(zhǔn)備檢測。檢測前搖晃培養(yǎng)板10s，混勻顏色。在酶聯(lián)檢測儀上，波長570nm處檢測各孔的OD；根據(jù)各孔吸光度值，繪制細胞增殖抑制曲線。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果采用SPSS 17．0軟件進行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以（±s）表示，采用單因素方差分析，IR值采用直線回歸分析，以P＜0．05為顯著性差異。

結(jié) 果

一、米非司酮對MCF-7和T47D細胞IC50檢測結(jié)果

米非司酮對乳腺癌MCF-7和T47D細胞均有抑制作用，米非司酮作用48h后，其抑制率均隨著米非司酮濃度的增加而變化，存在明顯的量效關(guān)系。米非司酮作用 MCF-7細胞48h后，1、2．5、10、25、50和100μmol／L組的OD值與對照組比較，均有顯著性差異（P＜0．05）；而作用于T47D細胞48h后，2．5、10、25、50和100μmol／L組的 OD 值與對照組比較，均有顯著性差異（P＜0．05）。通過對兩種細胞IR值直線回歸分析，米非司酮對MCF-7細胞的IC50為51．21μmol／L，對T47D細胞的IC50為54．29μmol／L（表1，圖1）。

表1 不同濃度米非司酮處理MCF-7和T47D細胞OD值和IR值（±s）

表1 不同濃度米非司酮處理MCF-7和T47D細胞OD值和IR值（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0．05

組 別MCF-7 T47D OD值 IR值 OD值 IR值0．57±0．04 0．00±0．00 0．54±0．03 0．00±0．00 0．01μmol／L 0．56±0．02 0．93±0．92 0．52±0．02 4．17±0．97 0．1μmol／L 0．55±0．03 4．00±1．03 0．52±0．04 4．04±1．74 0．5μmol／L 0．54±0．07 4．99±1．45 0．51±0．01 6．14±1．99 1．0μmol／L 0．53±0．07＊ 7．74±1．29＊ 0．50±0．02 6．98±2．03 2．5μmol／L 0．52±0．04＊ 9．56±2．18＊ 0．48±0．02＊ 11．82±3．04＊10μmol／L 0．51±0．03＊ 11．35±2．85＊ 0．46±0．06＊ 14．19±4．68＊25μmol／L 0．48±0．05＊ 16．16±3．44＊ 0．43±0．08＊ 19．63±3．23＊50μmol／L 0．18±0．03＊ 68．53±5．68＊ 0．20±0．09＊ 63．36±7．10＊100μmol／L 0．06±0．01＊ 89．41±2．17＊ 0．09±0．09＊ 83．47±4．69對照組＊

圖1 米非司酮對乳腺癌MCF-7和T47D細胞的生長抑制作用

二、米非司酮作用乳腺癌細胞后形態(tài)學(xué)變化

米非司酮作用乳腺癌MCF-7和T47D細胞后，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各組細胞體積變小，細胞間的鏈接消失，細胞內(nèi)明顯有黑色小顆粒聚集。25和50μmol／L濃度米非司酮對 MCF-7乳腺癌細胞株生長抑制作用明顯，特別是50μmol／L干預(yù)24h后即可觀察到貼壁細胞生長速度減慢，細胞內(nèi)出現(xiàn)小顆粒，在高倍鏡下可見明顯的核質(zhì)濃縮。上述現(xiàn)象隨時間的延長和劑量的增加更加明顯。對MCF-7和T47D細胞，低劑量0．25μmol／L組米非司酮處理后細胞形態(tài)變化均不明顯；但高劑量米非司酮，特別是50μmol／L組干預(yù)3d后，細胞形態(tài)變化明顯，由貼壁狀態(tài)變化為懸浮狀態(tài)，說明有細胞死亡（圖2、3）。

三、米非司酮處理乳腺癌細胞后細胞增殖能力檢測

不同濃度的米非司酮對乳腺癌細胞系MCF－7和T47D的增殖均有抑制作用，且呈濃度依賴性。隨著米非司酮濃度的增加，增殖抑制作用越顯著（圖4、5）。

討 論

圖2 米非司酮處理后MCF-7形態(tài)學(xué)觀察（100×）

圖3 米非司酮處理后T47D形態(tài)學(xué)觀察（100×）

圖4 米非司酮處理后乳腺癌細胞系MCF-7生長曲線

圖5 米非司酮處理后乳腺癌細胞系T47D生長曲線

乳腺癌發(fā)病率已經(jīng)占據(jù)全球女性惡性腫瘤的首位，是世界上五大惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的數(shù)據(jù)，全世界乳腺癌年發(fā)病人數(shù)高達120萬人，年死亡人數(shù)約為50萬。目前臨床上治療乳腺癌的常規(guī)藥物有希羅達（卡培他濱片）、芙瑞（來曲唑片）、速萊（依西美坦片）、赫賽汀（注射用曲妥珠單抗）等，但各自有不同的臨床適應(yīng)癥。乳腺癌患者多使用激素療法［1］，主要藥物有三苯氧胺、甲孕酮、甲地孕酮等，這類藥物的作用機理都是阻斷人雌激素來源，目前有效率僅為30%～50%，臨床療效仍不夠理想［2－4］。現(xiàn)在科學(xué)家們都在尋找新型內(nèi)分泌治療乳腺癌的藥物。米非司酮是孕酮受體拮抗劑，米非司酮分子式為C29H35NO2，化學(xué)結(jié)構(gòu)為17β羥-11β［4-二甲基苯胺］-17-丙炔基-4，9雙烯-3酮，在上個世紀(jì)由法國Roussel-Uclaf公司合成，原代號RU-486。作為一種人工合成的炔諾酮衍生物，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)與孕酮相似，具有甾體結(jié)構(gòu)，能與孕酮受體結(jié)合，產(chǎn)生較強的抗孕酮作用，主要應(yīng)用于終止早孕，同時也有抗著床、誘導(dǎo)月經(jīng)及促進宮頸成熟等作用［5］。自1993年 Murphy等人［6］首次發(fā)表了米非司酮能縮小子宮肌瘤的臨床報道以來，大量的研究報道已經(jīng)證實米非司酮具有抗腫瘤作用，包括乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮平滑肌瘤等婦產(chǎn)科腫瘤［7－11］。

在新型抗乳腺癌藥物的篩選過程中，各種乳腺癌細胞系的應(yīng)用起了不可忽視的作用，這些來自于不同遺傳背景的、具有不同激素受體表型的乳腺癌細胞系為體內(nèi)外研究乳腺癌的生物學(xué)特性、治療提供了有形的載體，涉及到新型藥物發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)和臨床前研究等各個方面。在細胞生物學(xué)方面，本研究選用的兩個乳腺癌細胞系各有其代表性：MCF-7為人乳腺癌上皮細胞系，雌激素受體（ER）和孕酮受體（PR）為陽性［12］；T47D 為人乳腺導(dǎo)管癌上皮細胞系，ER陰性，PR雖然為陽性［13］，但不受雌二醇調(diào)控。這兩種細胞在病理分型、激素受體亞型上均不相同，因此本研究選用這兩種細胞系對米非司酮進行研究具有較好的代表性。在藥理學(xué)研究方面，IC50，是指“生物學(xué)反應(yīng)”被抑制一半時抑制劑的濃度。在細胞增殖方面，可以理解為一定濃度的某種藥物抑制腫瘤細胞的50%停止增殖，該濃度稱為50%抑制濃度，即不增殖細胞與全部細胞數(shù)之比等于50%時所對應(yīng)的濃度，IC50值可以用來衡量藥物抑制增殖的能力，即抑制能力越強，該數(shù)值越低，也可以反向說明某種細胞對藥物的耐受程度。該指標(biāo)是抗腫瘤藥物篩選及臨床前研究中得重要方法，對于后續(xù)藥物功能和機制得研究至關(guān)重要。

本研究結(jié)果表明：經(jīng)過3d5組不同濃度的米非司酮處理，米非司酮對乳腺癌細胞增殖的抑制作用具有時間和劑量依賴性，隨劑量的增加和時間的延長，米非司酮對乳腺癌的抑制作用越強。在低劑量處理組（0．25μmol／L和2．5μmol／L）中以抑制細胞增殖為主，在高劑量組（25μmol／L和50μmol／L）中可能同時以抑制細胞增殖和促進細胞凋亡為主，不同劑量對乳腺癌細胞抑制作用的分子機制及其與臨床應(yīng)用上的相關(guān)性將是我們下一步深入研究的內(nèi)容。

［1］ Chlebowski RT，Kim JS，Haque R．Adherence to endocrine therapy in breast cancer adjuvant and prevention settings［J］．Cancer Prev Res（Phila），2014，［Epub ahead of print］．

［2］ Yip CH，Smith RA，Anderson BO，et al．Guideline implementation for breast healthcare in low-and middleincome countries：early detection resource allocation ［J］．Cancer，2008，113（8supple）：2244-2256．

［3］ Ziller V，Kalder M，Albert US，et al．Adherence to adjuvant endocrine therapy in postmenopausal women with breast cancer［J］．Ann Oncol，2009，20：431-436．

［4］ Lin JH，Zhang SM，Manson JE．Predicting adherence to tamoxifen for breast cancer adjuvant therapy and prevention［J］．Cancer Prev Res（Phila），2011，4：1360-1365．

［5］ 裴開顏，肖碧蓮 ．每周一次口服米非司酮用于避孕的機理研究 ［J］．生殖醫(yī)學(xué)雜志，2008，17：6-10．

［6］ Murphy AA，Kettel LM，Morales AJ，et al．Regression of uterine leiomyomata in response to the antiprogesterone RU 486 ［J］．J Clin Endocrinol Metab，1993，76：513-517．

［7］ Benagiano G，Bastianelli C，F(xiàn)arris M．Selective progesterone receptor modulators 3：use in oncology，endocrinology and psychiatry ［J］．Expert Opin Pharmacother，2008，9：2487-2496．

［8］ Ramondetta LM，Johnson AJ，Sun CC，et al．Phase 2trial of mifepristone（RU-486）in advanced or recurrent endometrioid adenocarcinoma or low-grade endometrial stromal sarcoma［J］．Cancer，2009，115：1867-1874．

［9］ Rocereto TF，Brady WE，Shahin MS，et al．A phase II evaluation of mifepristone in the treatment of recurrent or persistent epithelial ovarian，fallopian or primary peritoneal cancer：agynecologic oncology group study ［J］．Gynecol Oncol，2010，116：332-334．

［10］ Chabbert-Buffet N， Ouzounian S， Kairis AP， et al．Contraceptive applications of progesterone receptor modulators［J］．Eur J Contracept Reprod Health Care，2008，13：222-230．

［11］ Benad P，Rauner M，Rachner TD，et al．The anti-progestin RU-486inhibits viability of MCF-7breast cancer cells by suppressing WNT1 ［J］．Cancer Lett，2011，312：101-108．

［12］ Harrell JC，Dye WW，Allred DC，et al．Estrogen Receptor Positive Breast Cancer Metastasis：Altered Hormonal Sensitivity and Tumor Aggressiveness in Lymphatic Vessels and Lymph Nodes［J］．Cancer Res，2006，66：9308-9315．

［13］ Horwitz KB，Mockus MB，Lessey BA．Variant T47Dhuman breast cancer cells with high progesterone-receptor levels despite estrogen and antiestrogen resistance［J］．Cell，1982，28：633-642．