陳晟，吳志英

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福州 350005；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200040

動(dòng)態(tài)突變疾病是指基因編碼區(qū)或非編碼區(qū)發(fā)生核苷酸重復(fù)序列異常擴(kuò)增導(dǎo)致的一類遺傳性疾病，根據(jù)其發(fā)生擴(kuò)增的分子生物學(xué)機(jī)制不同，大致可分為三類：第一類是異常擴(kuò)增引起轉(zhuǎn)錄過程受阻，如脆性X綜合征(Fragile X syndrome, FXS)、Friedreich共濟(jì)失調(diào)(Friedreich ataxia, FRDA)等；第二類是異常擴(kuò)增導(dǎo)致病理性RNA毒性蓄積，如強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良癥癥1型(Myotonic dystrophy 1, DM1)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)10型(Spinocerebellar ataxia 10, SCA10)等；以上兩類均為非編碼區(qū)重復(fù)序列異常擴(kuò)增。第三類為編碼區(qū)核苷酸重復(fù)序列異常擴(kuò)增，如較為常見的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)3型(Spinocerebellar ataxia 3, SCA3)、亨廷頓舞蹈病(Huntington's disease, HD)和肯尼迪病(Kennedy disease, KD)等，因其為CAG三核甘酸重復(fù)序列異常擴(kuò)增，所以又稱為多聚谷氨酰胺疾病(Polyglutamine disease)，簡稱polyQ疾病[1]。目前已知的PolyQ疾病共有9種，分別為HD、KD及7種SCA，這9種PolyQ疾病的CAG重復(fù)序列異常擴(kuò)增一般不超過100次，可以通過普通PCR進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)合凝膠電泳或毛細(xì)管電泳片段分析進(jìn)行檢測。而對于第一類和第二類涉及非編碼區(qū)重復(fù)序列異常擴(kuò)增的動(dòng)態(tài)突變疾病，其重復(fù)序列擴(kuò)增次數(shù)常常超過100次，甚至達(dá)到1000次以上，對于這些超大片段動(dòng)態(tài)突變疾病，普通PCR擴(kuò)增無法檢測出超大片段，而傳統(tǒng)檢測方法如Southern blot費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且需要高質(zhì)量的DNA標(biāo)本，很難推廣應(yīng)用于臨床。在此情況下，重復(fù)引物PCR技術(shù)(Repeat-primed PCR assay)應(yīng)運(yùn)而生，首先用于DM1的基因診斷，并陸續(xù)用于強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良癥2型(Myotonic dystrophy 2, DM2)、FRDA、SCA10型以及C9orf72基因突變引起的額顳葉癡呆(Frontotemporal dementia,FTD)或肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)合并額顳葉癡呆(ALS-FTD)等疾病的基因檢測。本文將簡要介紹重復(fù)引物PCR技術(shù)的原理并分別闡述重復(fù)引物PCR技術(shù)在上述疾病基因檢測中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 重復(fù)引物PCR技術(shù)原理

重復(fù)引物 PCR技術(shù)最初稱為三引物 PCR法(Triplet repeat-primed PCR, TP-PCR)。1996年，Warner等[2]發(fā)明此種方法用以診斷DM1超大片段動(dòng)態(tài)突變患者。TP-PCR法有別于傳統(tǒng)PCR，其反應(yīng)中加入3個(gè)引物，分別為熒光標(biāo)記的上游引物P1、與人類無同源性的21個(gè)堿基組成的通用引物P3以及由5個(gè)CAG重復(fù)加上通用引物P3(又稱tail，P3尾)組成的引物 P4，3個(gè)引物以一定比例加入反應(yīng)體系，具體反應(yīng)過程為：引物P1與P4首先擴(kuò)增出長度相差3 bp的一組PCR產(chǎn)物，這些產(chǎn)物隨后被引物P1和P3再次擴(kuò)增，到了循環(huán)晚期，由于加入體系的量少，引物P4首先被耗盡，保證了循環(huán)早期產(chǎn)生的相差3 bp的PCR產(chǎn)物能夠充分?jǐn)U增，最后采用熒光毛細(xì)管電泳檢測PCR終產(chǎn)物，此法實(shí)際上是擴(kuò)增并檢測了一組相差1個(gè)CTG重復(fù)的小片段(圖1)[2]。

2 重復(fù)引物 PCR技術(shù)與其他超大片段動(dòng)態(tài)突變基因檢測技術(shù)比較

除重復(fù)引物PCR技術(shù)外，Southern blot雜交[3]、長模板PCR擴(kuò)增TM法[4]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR聯(lián)合微衛(wèi)星標(biāo)記連鎖分析法[5]等也可用于超大片段動(dòng)態(tài)突變基因檢測。與重復(fù)引物PCR技術(shù)相比，這些方法各有利弊(表1)。

圖1 TP-PCR技術(shù)原理示意圖

表1 幾種超大片段動(dòng)態(tài)突變疾病基因檢測技術(shù)比較

3 重復(fù)引物PCR技術(shù)在DM1和DM2中的應(yīng)用

DM 是一種累及全身多系統(tǒng)的常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率約為 1/8000[6]，根據(jù)致病基因及其臨床表現(xiàn)，可分為兩型：DM1和DM2，國內(nèi)常見DM1，而芬蘭、德國等國家和地區(qū) DM2相對較為常見。DM 臨床表現(xiàn)多種多樣，除了肌無力、肌強(qiáng)直和彩虹樣白內(nèi)障為3大主要臨床表現(xiàn)外，還可累及心臟、內(nèi)分泌腺體、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等。

DM1為DMPK基因3′非翻譯區(qū)的CTG三核甘酸重復(fù)異常擴(kuò)增而致病，正常人該區(qū)域CTG重復(fù)一般為5～37次[7]，重復(fù)次數(shù)38～50次為前突變，重復(fù)次數(shù)50～100次者患病，但癥狀輕微，重復(fù)次數(shù)100次以上患者出現(xiàn)明顯癥狀[8]，部分患者重復(fù)次數(shù)可多達(dá)數(shù)千次。Warner等[2]利用TP-PCR法檢測出76名DM1患者，而以傳統(tǒng)的Southern blot檢測有1例患者未被檢出異常擴(kuò)增，其原因可能是Southern blot檢測本身對樣品質(zhì)量要求較高，且雜交過程不穩(wěn)定，因此TP-PCR法用于檢測DM1靈敏度與特異度均較高。然而，該方法也并非萬無一失。近年有文獻(xiàn)報(bào)道，約5%異常擴(kuò)增序列可能存在CCG、CTC和GGC等干擾序列，這些干擾序列將影響引物與序列的結(jié)合，導(dǎo)致假陰性結(jié)果出現(xiàn)[9]。針對此情況，Radvansky等[10]提出應(yīng)用雙向熒光標(biāo)記 TP-PCR法以提高檢測的靈敏度。自Warner等人發(fā)明TP-PCR以來，該方法逐漸成為DM1的常規(guī)基因診斷方法，然而國內(nèi)直到2012年始才有文獻(xiàn)針對DM1基因檢測進(jìn)行報(bào)道。李韻等[11]報(bào)道了以TP-PCR法確診了19個(gè)家系共20名DM1患者以及24名健康對照，首次在中國人群中驗(yàn)證了該方法的可靠性和臨床實(shí)用性。本中心亦對30余名臨床擬診DM1患者進(jìn)行了TP-PCR檢測，除 1名患者存在打斷序列導(dǎo)致擴(kuò)增失敗外，其余患者均成功擴(kuò)增。圖2分別為某正常人A和某患者B的TP-PCR檢測結(jié)果。

盡管與DM1臨床表現(xiàn)有一定相似性，但DM2為ZNF9基因1號內(nèi)含子區(qū)發(fā)生CCTG四核苷酸重復(fù)異常擴(kuò)增而致病，患者四核苷酸重復(fù)異常擴(kuò)增次數(shù)為75～11000次，平均重復(fù)次數(shù)可高達(dá)5000余次[7]。針對DM2的重復(fù)引物PCR法直到2003年才首次被報(bào)道[12]，其引物設(shè)計(jì)思路仍然沿襲 Warner等人的TP-PCR思路，唯一區(qū)別在于將熒光標(biāo)記加在了通用引物序列上，該研究結(jié)果證明，重復(fù)引物PCR技術(shù)不僅適用于三核苷酸動(dòng)態(tài)突變，亦可以推廣于四核苷酸，甚至是五核苷酸或六核苷酸動(dòng)態(tài)突變。遺憾的是，由于亞洲人群DM2發(fā)病率較低，國內(nèi)目前鮮有DM2基因確診陽性的報(bào)道。

圖2 本中心DM1 TP-PCR檢測結(jié)果

4 重復(fù)引物PCR技術(shù)在FRDA、SCA10及其他共濟(jì)失調(diào)中的應(yīng)用

FRDA是歐美人群最常見的常染色體隱性共濟(jì)失調(diào)，其發(fā)病率最高可達(dá)1/30000[13]，約占?xì)W美地區(qū)常染色體隱性共濟(jì)失調(diào)的半數(shù)。FRDA主要臨床特征為兒童期發(fā)病，肢體進(jìn)行性共濟(jì)失調(diào)，伴發(fā)音困難、深感覺消失、脊柱側(cè)突、弓形足、心臟損害和糖尿病等。FRDA的致病基因是位于9q13的Frataxin基因(FXN)，除了少數(shù)患者為點(diǎn)突變外，95%的患者為該基因1號內(nèi)含子區(qū)發(fā)生GAA三核甘酸重復(fù)異常擴(kuò)增而致病[14～16]。在正常人中，GAA重復(fù)次數(shù)小于34～36次，一般為6～12次，患者兩條等位基因重復(fù)次數(shù)均大于66次，最高可達(dá)1500次，小于200次重復(fù)的患者較為罕見[17～20]。

SCA10是一種以小腦性共濟(jì)失調(diào)和癲癇為主要表現(xiàn)的常染色體顯性遺傳性共濟(jì)失調(diào)，由 ATXN10基因9號內(nèi)含子區(qū)發(fā)生ATTCT五核苷酸重復(fù)異常擴(kuò)增導(dǎo)致[21]。正常人該區(qū)域五核苷酸重復(fù)次數(shù)為10～22次，以13和14次最為多見，患者可出現(xiàn)280次以上的重復(fù)異常擴(kuò)增，目前報(bào)道的最高重復(fù)次數(shù)可達(dá)4500次，其相應(yīng)的區(qū)域長達(dá)22.5 kb。除此之外，作為第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的非編碼區(qū)重復(fù)序列擴(kuò)增所致病的亞型，SCA8是由ATXN8/ATXN8OS發(fā)生CAG/CTG雙向性異常擴(kuò)增致病[22,23]，其臨床表現(xiàn)主要為小腦共濟(jì)失調(diào)并伴有步態(tài)痙攣和大腦半球萎縮[24,25]。SCA12則是由于PPP2R2B基因非編碼區(qū)內(nèi)的CAG重復(fù)序列異常擴(kuò)增所致，主要臨床表現(xiàn)為震顫、步態(tài)共濟(jì)失調(diào)、辨距不良、腱反射亢進(jìn)、運(yùn)動(dòng)活動(dòng)減少、異常眼球運(yùn)動(dòng)及老年患者常見的癡呆。盡管目前報(bào)道SCA12的異常擴(kuò)增次數(shù)為55～78次[26,27]，但由于報(bào)道例數(shù)太少，不能排除存在超大片段重復(fù)異常擴(kuò)增的可能。

2004年，Cagnoli等[28]首次報(bào)道應(yīng)用重復(fù)引物PCR技術(shù)進(jìn)行FRDA、SCA10和SCA12的基因檢測。在這項(xiàng)研究中，共納入43例FRDA患者、28例FRDA攜帶者、10例SCA10患者、6例SCA12患者以及152名健康對照，結(jié)果顯示，運(yùn)用重復(fù)引物PCR法對FRDA、SCA10和SCA12患者或攜帶者進(jìn)行相應(yīng)目的片段擴(kuò)增均獲得成功，其結(jié)果與直接PCR(僅用于 SCA12)或 Southern blot一致，F(xiàn)RDA和 SCA10的最大擴(kuò)增片段分別達(dá)到1430次和3700次[28]。這項(xiàng)研究不僅將重復(fù)引物PCR技術(shù)的應(yīng)用范圍再次進(jìn)行了擴(kuò)展，證實(shí)了五核苷酸重復(fù)異常擴(kuò)增亦可運(yùn)用該方法進(jìn)行檢測，而且首次將該技術(shù)應(yīng)用于常染色體隱性遺傳病的基因檢測中，提出了隱性遺傳方式的識圖方法。然而，Cagnoli等人也承認(rèn)應(yīng)用該方法擴(kuò)增 SCA8并未取得成功，考慮其擴(kuò)增失敗的原因可能是局部復(fù)雜的構(gòu)象限制了重復(fù)引物PCR法對目的片段的擴(kuò)增效率。近年來陸續(xù)有學(xué)者成功應(yīng)用重復(fù)引物PCR技術(shù)對SCA8致病基因ATXN8/ATXN8OS致病片段進(jìn)行擴(kuò)增[29～31]，提示盡管在診斷SCA8的靈敏度上較診斷其他超大片段動(dòng)態(tài)突變疾病略低，但重復(fù)引物 PCR仍不失為一種高效且低成本的SCA8基因診斷技術(shù)。

東亞地區(qū)具有FRDA典型GAA重復(fù)異常擴(kuò)增的患者很罕見[32]，國內(nèi)對本病多是符合臨床表現(xiàn)的個(gè)案報(bào)道，缺乏基因檢測陽性結(jié)果，可能的原因有兩種：一是FRDA具有種族特異性，東亞人群具有某種保護(hù)機(jī)制而不易發(fā)生FXN基因GAA重復(fù)異常擴(kuò)增；二是東亞人群尤其是中國人群該病致病突變可能多為歐美人群罕見的點(diǎn)突變而非動(dòng)態(tài)突變，但迄今為止國內(nèi)尚未有針對FXN基因點(diǎn)突變相關(guān)研究的報(bào)道。此外，針對SCA8和SCA10的基因檢測也均為陰性結(jié)果[33]，可能由于這兩型共濟(jì)失調(diào)在中國人群中罕見，亦可能由于重復(fù)引物PCR法并未得到充分推廣。

5 應(yīng)用重復(fù)引物 PCR技術(shù)檢測 C9orf72基因突變

新近在高加索人群中發(fā)現(xiàn) C9orf72基因是家族性 ALS合并 FTD(fALS-FTD)、家族性 ALS(fALS)以及家族性 FTD(fFTD)的致病基因[34,35]。該基因 1號內(nèi)含子區(qū)發(fā)生GGGGCC六核苷酸異常擴(kuò)增，患者重復(fù)次數(shù)須大于30次，最高可達(dá)1600次[34]。Majounie等[36]報(bào)道，在西方人群及其后裔中，該基因突變患者可占fALS患者的39.3%及fFTD患者的24.8%，即使在散發(fā)的ALS或FTD患者中，也有4%～8%攜帶該突變，然而具有該基因突變的患者都攜帶有部分或全部的奠基者單體型(Founder haplotype)，亞裔人群中，該基因突變罕見。

與其他超大片段動(dòng)態(tài)突變不同，C9orf72基因突變在首次報(bào)道時(shí)就應(yīng)用了重復(fù)引物PCR法進(jìn)行異?；蛘Ｖ貜?fù)序列的擴(kuò)增[34,35]。與應(yīng)用于擴(kuò)增 FRDA和SCA10致病基因的重復(fù)引物PCR法不同，用于擴(kuò)增 C9orf72基因GGGGCC突變的重復(fù)引物PCR技術(shù)又發(fā)生了一些變化，主要發(fā)生在兩個(gè)方面：一方面在于touchdown PCR技術(shù)被結(jié)合到重復(fù)引物PCR技術(shù)中。作為該突變的首次報(bào)道，DeJesus-Hernandez等[34]及 Renton等[35]在應(yīng)用重復(fù)引物PCR法時(shí)都聯(lián)合應(yīng)用了touchdown PCR技術(shù)。Touchdown PCR技術(shù)是指 PCR反應(yīng)中每個(gè)循環(huán)降低 1°C反應(yīng)退火溫度，直到達(dá)到目標(biāo)退火溫度，然后以此退火溫度再進(jìn)行10～25個(gè)循環(huán)普通PCR。其優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)一開始先以高溫?cái)U(kuò)增，從而保證了擴(kuò)增的嚴(yán)謹(jǐn)性，待目的片段的豐度上升后，降低擴(kuò)增的溫度，這樣又提高了擴(kuò)增效率。另一方面是DeJesus-Hernandez等[34]在引物設(shè)計(jì)中借鑒了 Hantash等[37]的思路，在上游引物的前端加入了錨定序列(Anchor sequence)，并在反應(yīng)體系中加入 7-脫氮-2′脫氧 GTP(7-deaza-2-deoxy-GTP)，使引物結(jié)合效率大大提高，從而增加了重復(fù)引物PCR法檢測超大片段重復(fù)序列的靈敏度。然而盡管方法有所改進(jìn)，但重復(fù)引物PCR法用于臨床檢測仍遇到了挑戰(zhàn)。最近一項(xiàng)囊括了全球14個(gè)實(shí)驗(yàn)室針對 C9orf72基因突變檢測可靠性的研究發(fā)現(xiàn)，參與研究的14個(gè)實(shí)驗(yàn)室中僅有5個(gè)實(shí)驗(yàn)室重復(fù)引物PCR檢測結(jié)果與Southern blot檢測結(jié)果完全一致，78份DNA標(biāo)本僅有50份在全部14個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)引物PCR檢測得到相同結(jié)果[38]。這一結(jié)果表明，應(yīng)用重復(fù)引物PCR法進(jìn)行C9orf72基因突變檢測可能存在一定假陽性或假陰性結(jié)果，主要問題在于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所采用的擴(kuò)增反應(yīng)條件不盡相同，以及部分實(shí)驗(yàn)室并未添加7-deaza-2-deoxyGTP而導(dǎo)致擴(kuò)增失敗[38]。

國內(nèi)對于 C9orf72基因突變的檢測開始較早。2012年 Zou等[39]率先對 20名 fALS患者及 324名sALS患者進(jìn)行C9orf72基因篩查，未發(fā)現(xiàn)該基因六核苷酸動(dòng)態(tài)突變。此后，Liu等[40]針對 61名 fALS患者進(jìn)行的C9orf72基因篩查也未報(bào)道陽性結(jié)果。最近，唐璐等[41]報(bào)道在 401例 sALS患者中篩查到 3例 C9orf72基因突變患者。綜合國內(nèi)目前已報(bào)道的資料，我們認(rèn)為重復(fù)引物PCR法是檢測C9orf72基因六核苷酸動(dòng)態(tài)突變的可靠方法，但中國人群遺傳背景異于西方人群，因此中國人群sALS及fALS的分子遺傳學(xué)機(jī)制很可能也與西方人群大為迥異，考慮到基因檢測的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，C9orf72基因突變篩查在中國ALS患者中并非首選。

6 結(jié)語與展望

自Warner等人發(fā)明三引物 PCR技術(shù)后，重復(fù)引物PCR技術(shù)因其低成本、高效率、方法簡便等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于DM、FRDA、FXS以及C9orf72基因突變引起的FTD或ALS-FTD等疾病的基因檢測中，隨著應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)的積累，重復(fù)引物PCR技術(shù)不斷得到改良，尤其是借鑒了錨定引物設(shè)計(jì)和 touchdown PCR技術(shù)后，檢測的靈敏度和特異度又有了較大的提升。但值得注意的是，即便該技術(shù)已經(jīng)如此簡便易行，但仍存在因反應(yīng)條件不達(dá)標(biāo)或?qū)嶒?yàn)者操作問題而導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或擴(kuò)增錯(cuò)誤的情況。因此，應(yīng)當(dāng)建立一套標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程以減小假陰性或假陽性結(jié)果出現(xiàn)的概率，而臨床醫(yī)生自身也應(yīng)當(dāng)保持審慎態(tài)度，將基因檢測結(jié)果僅作為臨床診斷的依據(jù)之一。隨著轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的深入，各類遺傳性疾病的臨床基因檢測商品化試劑盒必將逐漸取代繁瑣的實(shí)驗(yàn)室操作，從而大大降低技術(shù)的學(xué)習(xí)成本，重復(fù)引物PCR技術(shù)也必將在現(xiàn)有基礎(chǔ)上繼續(xù)發(fā)展，甚至可能為新的更簡便的技術(shù)所取代。

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