陳萬金，張奇杰，何瑾，林翔，王檸

福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福州 350005

脊髓性肌萎縮癥患者尿液細胞模型的建立

陳萬金，張奇杰，何瑾，林翔，王檸

福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，福州 350005

脊髓性肌萎縮癥(Spinal muscular atrophy, SMA)大多數(shù)在兒童或嬰幼兒期發(fā)病，表現(xiàn)為進行性、對稱性的肢體無力和肌肉萎縮，迄今尚無有效的治療方法，是嬰幼兒最常見的致死性遺傳病之一?；颊邅碓吹募毎凳窃摬⊙芯康闹匾ぞ撸蕾囉诩∪饣蚱つw活檢等創(chuàng)傷性手術的成纖維細胞培養(yǎng)較難被患者及家屬接受。文章收集SMA患者及健康對照的新鮮尿液，進行離心、尿液沉渣培養(yǎng)，觀察尿液細胞的生長狀況，用酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析患者尿液細胞中SMN(Survival of motor neuron)蛋白的表達量，應用免疫熒光染色觀察SMN蛋白在細胞內(nèi)的定位。共建立了11例SMA患者和14例健康對照的尿液細胞系，尿液細胞體外增殖旺盛，細胞形態(tài)及生長速度較穩(wěn)定?；颊邅碓吹哪蛞杭毎鸖MN1(Survival of motor neuron 1) 基因缺失突變、SMN蛋白表達量降低，熒光染色提示SMN蛋白在胞漿和胞核中均有定位。尿液細胞培養(yǎng)步驟簡單、無創(chuàng)傷性、患兒及其家屬的依從性好，是獲取和保存病人來源標本的有效方法，在脊髓性肌萎縮癥發(fā)病機制研究和臨床應用方面具有較好的應用價值。

脊髓性肌萎縮癥；運動神經(jīng)元生存蛋白；尿液；細胞培養(yǎng)

脊髓性肌萎縮癥(Spinal muscular atrophy, SMA)是一類較為常見的常染色體隱性遺傳病，也是嬰兒期最常見的致死性遺傳病之一[1]。SMA的致病基因為運動神經(jīng)元生存(Survival of motor neuron, SMN)基因[2]，編碼全長的SMN蛋白，主要參與前體信使RNA的剪接、軸突生長等多種重要功能[3～5]。SMN基因具有SMN1、SMN2兩種高度同源的拷貝，SMN1主要表達全長的具有完整功能的SMN蛋白，而SMN2主要表達缺失 7號外顯子的截短蛋白(SMNΔ7)，其具體的機制尚不明確。在SMN基因剪接和SMA發(fā)病機制研究中，疾病模型的建立尤其重要。本研究收集SMA患者的無菌尿液并進行細胞培養(yǎng)，成功建立了尿液來源的細胞系，并進行了SMN1缺失、SMN蛋白表達及定位分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本實驗收集的 SMA患者來自福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診和住院病人，經(jīng)臨床和SMN基因檢測明確，符合SMA的診斷標準[6]。本研究獲得福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者及其家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 尿液細胞的原代培養(yǎng)

尿液收集：無菌容器收集新鮮中段尿液，兒童50～200 mL，成人200～500 mL；囑患者大量飲水后留取中段尿液，為減少消毒劑對尿道周圍皮膚的刺激，一般無需局部消毒，但宜用溫水清潔。無菌離心管(50 mL或250 mL)分裝尿液，室溫下離心，轉速為1500～2000 r/min，離心時間5～10 min，棄上清，收集沉渣。對于兒童，若一次尿液量不夠原代培養(yǎng)，可多次收集、合并，新鮮尿液置于室溫保存，建議盡快進行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)基的制備及細胞培養(yǎng)：將上皮細胞培養(yǎng)基(美國 ScienCell)和 DMEM(美國GIBCO)1:1混合后，添加 10%的胎牛血清(美國GIBCO)和 1%的青霉素/鏈霉素(中國碧云天)。將尿液離心后收集的沉渣用上述培養(yǎng)基重懸后，移至細胞培養(yǎng)瓶(美國Corning)，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO)中培養(yǎng)。3～4 d后觀察細胞貼壁生長狀況，1周后根據(jù)細胞數(shù)，經(jīng)胰蛋白酶(0.25%，美國GIBCO)消化后，以1:1、1:2或1:3傳代培養(yǎng)。1.2.2 尿液細胞SMN基因突變分析

胰酶消化后，收集培養(yǎng)的尿液細胞，提取基因組DNA(QIAamp DNA blood mini kit, 德國QIAGEN)。采用聚合酶鏈反應-限制性酶切片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術進行SMN基因第7和第8號外顯子缺失分析[7]。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗分析尿液細胞 SMN蛋白表達量

將穩(wěn)定期的各株尿液細胞系經(jīng)胰蛋白酶消化、計數(shù)后，接種至96孔板，平均每孔10 000個細胞，每株細胞系重復3～6個孔。第2日，細胞貼壁后，去培養(yǎng)基，用甲醛(2.5%)室溫固定 30 min。PBS(Phosphate buffered saline, 1×)洗滌后，用0.1% Triton-X-100-PBS透膜5 min。5%脫脂奶粉-PBS室溫封閉1 h。SMN1抗體(1:500稀釋，美國GeneTex)37℃搖育2 h。0.05% Tween 20-PBS洗滌后，辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體(1:5000稀釋，中國武漢三鷹)室溫孵育1 h。0.05% Tween 20-PBS洗滌后，加入TMB one溶液(美國Promega)室溫顯色10～20 min，待液體變藍后，加入硫酸(2 mol/L)終止反應。酶標儀(美國BIO-RAD)檢測492 nm波長的吸光度，記錄OD值，Excel軟件分析。

1.2.4 尿液細胞SMN蛋白定位分析

將穩(wěn)定期的尿液細胞系經(jīng)胰蛋白酶消化、計數(shù)后，接種至滅菌的蓋玻片，于6孔板培養(yǎng)至80%左右的細胞密集度。去培養(yǎng)基，PBS清洗后，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，用預冷甲醇4℃透膜10 min。PBS清洗后，用含 1%BSA、4%羊血清和 0.4% Triton-X-100-PBS的封閉液4℃封閉過夜。SMN1抗體(1:200稀釋，美國GeneTex)和Fibrillarin抗體(1:100稀釋，美國Santa Cruz) 4℃孵育過夜。0.1% Triton-X-100-PBS洗滌后，在避光條件下，加入Alexa Fluor 594標記山羊抗兔 IgG(重鏈+輕鏈)抗體和 Alexa Fluor 488 標記山羊抗兔 IgG(重鏈+輕鏈)抗體(中國武漢三鷹)，室溫孵育1 h。0.1% Triton-X-100-PBS洗滌后，DAPI復染胞核5 min。PBS清洗后，抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡(德國Leica)觀察胞核、胞漿染色情況。

1.2.5 統(tǒng)計分析

采用t檢驗(SPSS統(tǒng)計軟件包)分析SMA患者和健康對照的SMN蛋白量的差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 尿液細胞的形態(tài)及生長特點

目前，本研究已成功獲得11例不同表型SMA患者和14例健康對照的尿液細胞系。新鮮尿液收集簡便、無創(chuàng)傷性，尿液細胞的建系成功率約 50%，通過適當增加尿液收集量、明膠或多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶，可使成功率提高至70%～80%。圖1顯示的是一例尿液細胞系典型的體外培養(yǎng)細胞形態(tài)和增殖特點。3 d左右，可在顯微鏡下觀察到數(shù)個細胞貼壁，而1周左右可見貼壁的細胞往外生長，呈簇狀，一般可見到兩種類型的細胞：一種呈狹長的梭形狀，細胞排列緊密(圖1A)；另一種則呈圓或橢圓形狀，細胞排列稀疏，狀如鵝軟石(圖 1B)，這兩種細胞在同一個細胞系中常同時存在。細胞生長大致經(jīng)歷增殖初期-快速期-穩(wěn)定期。穩(wěn)定期的尿液細胞增殖能力旺盛，平均2 d即可傳代或凍存，且細胞形態(tài)和倍增時間較穩(wěn)定，可穩(wěn)定傳至第4代左右(圖1，C～E)，穩(wěn)定期的細胞是進一步試驗研究的最佳時期。第 5代以后的尿液細胞往往趨向老化，細胞形態(tài)變化大、增殖能力明顯下降、貼壁牢固、不易消化傳代(圖1F)。

圖1 一例尿液細胞系典型的細胞形態(tài)和增殖特點A、B：原代尿液細胞(P0)貼壁、簇狀生長，可見梭形和橢圓形兩種細胞類型；C～F：原代細胞傳代擴增至第5代，其中第2～4代(P2-P4)細胞形態(tài)和增長速度穩(wěn)定，第5代(P5)細胞出現(xiàn)老化。標尺=100 μm。

2.2 SMA尿液細胞SMN1基因突變、SMN蛋白表達及定位分析

SMA患者來源的尿液細胞系同樣攜帶有 SMN基因的缺陷，具有SMN1的第7和第8號外顯子缺失(圖2A)。ELISA結果顯示，與健康對照相比，SMA患者的尿液細胞中SMN蛋白水平明顯下降(圖2B)，SMA患者和健康對照的平均吸光度(OD)值分別為0.45±0.03(n=11)與0.54±0.02(n=14)，t=3.597，p=0.004。SMN蛋白的細胞內(nèi)定位分析顯示，其在胞漿和胞核內(nèi)均有分布(圖3A)，當SMN與Fibrillarin雙標免疫熒光染色時，可見到胞核內(nèi)的Gems顆粒(圖3B)。

圖2 患者尿液細胞系SMN基因及蛋白表達分析A：瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示患者的尿液細胞攜帶有SMN1基因第7和第8號外顯子缺失；B：ELISA結果顯示，與健康對照相比，SMA患者的尿液細胞中SMN蛋白量下降。OD：吸光度。

圖3 疫熒光染色方法分析SMN蛋白在尿液細胞中的定位A：SMN蛋白在胞漿和胞核中均有表達；B：SMN蛋白和Fibrillarin蛋白雙標免疫熒光染色時，可見胞核內(nèi)的 Gems顆粒(箭頭所示)。標尺=50 μm。

3 討 論

目前，在SMA發(fā)病機制研究中主要采用NSC34、PC12等神經(jīng)元樣細胞、SMA患者來源的成纖維細胞以及SMA動物模型作為研究工具，它們?yōu)镾MA的病理研究、分子機制探索、藥物干預等提供了重要模型，但也存在一些不足[8]。NSC34、PC12細胞并非真正意義上的神經(jīng)元，且在進行蛋白功能研究時存在內(nèi)源性SMN基因干擾。成纖維細胞一般通過皮膚或肌肉活檢獲取組織標本，再經(jīng)原代培養(yǎng)獲得，雖是SMA患者來源的細胞，但由于其具有創(chuàng)傷性，使其來源受到限制。SMA動物模型制作較為困難，SMN1基因是一種管家基因，完全敲除后模型動物不能存活，而SMN2基因作為一種表型修飾基因，僅存在于人類中，故SMA動物模型的制作不僅需要敲除SMN1基因，還需敲入SMN2基因，因此SMA動物模型在普通實驗室推廣應用困難。

本文通過收集 SMA患者及健康對照的新鮮尿液，結合細胞培養(yǎng)技術，探索尿液沉渣中脫落的尿道上皮細胞的體外培養(yǎng)，并成功建立了患者及健康對照來源的尿液細胞系。SMA患者特異的尿液細胞攜帶有SMN基因缺陷，表達較低水平的SMN蛋白，在某種程度上，與成纖維細胞類似，能夠作為SMA的一種體外細胞模型。同時，SMN蛋白在尿液細胞的胞漿和胞核中均有表達，一般胞漿的SMN蛋白散在分布，而胞核內(nèi)的 SMN蛋白會自身聚集，與Fibrillarin等多種蛋白相互作用，募集多種Gemin蛋白，形成 Gems顆粒，與卡哈爾體等共同參與前體信使 RNA的剪接。研究發(fā)現(xiàn) SMA患者胞核中的Gems顆粒較正常人少，且Gems顆粒數(shù)與SMA的表型存在一定的關系[9]，尿液細胞中也可檢測到Gems顆粒，但不同患者尿液細胞中Gems顆粒數(shù)以及藥物干預后顆粒數(shù)的變化尚需進一步研究?？傊?，尿液細胞培養(yǎng)步驟簡單、尿液收集無創(chuàng)傷，容易被患兒及其家屬所接受，在臨床實踐中有其優(yōu)越之處。對諸如SMA等的一些遺傳疾病而言，是獲取和保存病人來源標本的有效方法。

正常人尿液中脫落的上皮細胞并不多，而且多數(shù)為衰老的細胞，體外增殖能力差。而在某些泌尿系統(tǒng)疾病患者，常有異常脫落的上皮細胞，Kumagai等[10]從嚴重慢性腎小球腎炎患兒的尿液中培養(yǎng)得到了近端小管細胞；Vogelmann等[11]在腎小球疾病和健康對照尿液中培養(yǎng)得到了足突細胞；這些細胞在體外均具有增殖能力，能夠用于相關疾病的發(fā)病機制研究。本文培養(yǎng)得到的尿液細胞系主要由兩種類型的細胞組成：一種呈梭形，細胞排列緊密；另一種呈圓或橢圓形，細胞排列稀疏，這與 D?rrenhaus的發(fā)現(xiàn)相似，他們將尿液細胞分為1型和2型，分別為尿道上皮細胞和腎小管細胞來源[12]，我們之前的研究也證實為足突細胞和尿道上皮細胞[13]。尿液細胞不像成纖維細胞，有其體外增殖特點，細胞增殖旺盛，但傳代數(shù)少、易老化，Vogelmann等[11]認為尿液來源的細胞多數(shù)屬于衰老細胞，在體外培養(yǎng)1～2周后會經(jīng)歷一個“危機期”，某些細胞發(fā)生凋亡。雖然，尿液細胞主要是上皮細胞來源、體外傳代能力較弱、易凋亡，但Zhou等[14]發(fā)現(xiàn)尿液細胞仍具有重編程為 iPS細胞的能力，且由于尿液細胞來源豐富、獲取簡便，具有優(yōu)越之處。國內(nèi)學者們也成功建立了健康個體尿液細胞誘導來源的iPS細胞庫[15]，獲得了系統(tǒng)性紅斑狼瘡、隱睪癥患者特異的尿液-iPS細胞模型[16,17]，Wang等[18]首次將尿液細胞直接誘導為神經(jīng)前體細胞，這些都為疾病的發(fā)病機制研究和藥物篩查提供了良好的細胞模型。

總之，尿液細胞培養(yǎng)簡便易行、重復性高，尿液收集無創(chuàng)傷性，患者及其家屬依從性好，是獲取SMA患者來源標本的有效方法，在SMA發(fā)病機制研究和臨床應用方面，有重要的應用前景和推廣價值。

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(責任編委: 吳志英)

The construction of urine-derived cell lines from patients with spinal muscular atrophy

Wanjin Chen, Qijie Zhang, Jin He, Xiang Lin, Ning Wang

Department of Neurology, First Affiliated Hospital, Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

Spinal muscular atrophy (SMA) is a common neurodegenerative disease in childhood and infancy, clinically characterized by progressive and symmetric muscular weakness and atrophy. Few effective therapies are available now, and SMA is one of the most common genetic causes of infantile mortality. SMA patient-derived cells are beneficial in basic research on this disease, but the most common model cell, fibroblasts can only be obtained through invasive procedures such as muscle or skin biopsy, which are unwelcome to patients and their families. In this study, fresh urine from SMA patients and healthy controls was collected and centrifuged, and the urine sediment was cultured in vitro. The growth characteristics of urine-derived cells were observed, and the survival of motor neu-ron (SMN) gene, and the amount and localization of SMN protein in different urine cell lines were investigated. In total, 25 urine cell lines from 11 SMA patients and 14 healthy controls were established. These urine-derived cells expand robustly in vitro with stable cell morphological characteristics. The urine cell lines derived from patients carry the SMN1 gene defect and express a low level of SMN protein, while the intracellular localization of SMN protein is normal. Urine-derived cell culture technology is simple, non-invasive and highly reproducible, a way of obtaining and storing rare cell samples from SMA patients with which to study the pathogenesis of SMA.

spinal muscular atrophy; survival of motor neuron protein; urine; cell culture

2014-07-01;

2014-08-13

國家自然科學基金項目(編號：81322017，81371261)，福建省自然科學基金杰出青年基金項目(編號：2012J06016)和國家臨床重點專科建設項目資助

陳萬金，副主任醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)遺傳病。E-mail: wanjinchen75@mail.fjmu.edu.cn

王檸，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，研究方向：神經(jīng)遺傳病與腦血管病。E-mail: ningwang@mail.fjmu.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.1168

時間: 2014-10-8 05:00:02 PM

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141008.1700.005.html