袁慧軍，盧宇

解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉研究所，北京 100853

耳聾(Hearing loss)是人類最常見的感覺神經(jīng)系統(tǒng)缺陷，根據(jù)2006年第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查報告，我國聽力殘疾者有2780萬人，占殘疾人總數(shù)的33.51%，其中0～6歲聽障兒童達13.9萬，每年新生聾兒 2～3萬[1]。我國 2008～2010年先天性聽力障礙發(fā)生率分別為1.99‰、2.15‰ 和2.19‰，呈逐年上升趨勢[2]。隨著年齡增長，由于遺傳因素和環(huán)境因素的共同作用，人群中的耳聾患病率也相應增加。遺傳性耳聾(Hereditary hearing loss)在感音神經(jīng)性聾患者中超過 50%，隨著國民生活水平和醫(yī)療保健水平的提高，致聾環(huán)境因素得到有效控制，遺傳因素逐漸成為耳聾的主要致病原因。

病因?qū)W研究是疾病預防和治療的基礎(chǔ)。遺傳性耳聾的系統(tǒng)性研究，使我們能從較深層次理解耳聾發(fā)生的病因及病理機制，為耳聾的分子遺傳學診斷、預防乃至治療提供新的方法。人類基因組學研究，特別是功能基因組學研究的成果，將為遺傳性耳聾的防治帶來巨大的裨益。近20年來遺傳性耳聾的研究取得了飛速發(fā)展，分子遺傳學診斷在臨床診斷和新生兒聽力基因聯(lián)合篩查中得到大量應用，但是仍有大多數(shù)遺傳性耳聾無法明確病因，即使對已知耳聾基因的研究也未完全闡明其致病機理。

2005年問世、2008年在全球普及的高通量測序技術(shù)，又稱“新一代測序”技術(shù)引發(fā)了疾病致病基因研究的革命，掀起了一場以發(fā)現(xiàn)遺傳疾病致病基因和基因功能研究為核心的學術(shù)熱潮。高通量測序技術(shù)堪稱測序技術(shù)發(fā)展歷程的一個里程碑，它可以并行對幾百萬個DNA分子同時測序，通過尋找突變位點鑒定遺傳性疾病的致病基因。新一代測序技術(shù)被多個機構(gòu)探索用于臨床檢測，國內(nèi)外多家公司已推出基于新一代測序技術(shù)的遺傳性耳聾基因檢測產(chǎn)品。全基因組測序、全外顯子組測序和大規(guī)模平行測序的發(fā)展，大力推動了遺傳性耳聾的基因研究和基因診斷的技術(shù)進步。

1 遺傳性耳聾的特點及研究現(xiàn)狀

遺傳性耳聾基因研究主要任務是鑒定致病基因突變，闡明分子致病機制，為臨床診斷、治療和預防提供新的方法和遺傳咨詢指導。耳聾具有高度遺傳異質(zhì)性，以耳聾為唯一癥狀的非綜合征型耳聾占所有遺傳性耳聾的70%，而綜合征型耳聾占30%。大部分的非綜合征型耳聾符合孟德爾遺傳方式，即單基因突變導致耳聾，按照遺傳方式分為常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳、X染色體連鎖和線粒體母系遺傳，分別占非綜合征型遺傳性耳聾的15%、80%、1%和～4%。據(jù)估計遺傳性耳聾的致病基因超過600個，目前已明確的非綜合征型耳聾基因超過70個，綜合征型耳聾基因超過150個，仍有大量的遺傳性耳聾致病基因還不明確。在耳聾人群中，常見致聾基因 GJB2、SLC26A4和線粒體 DNA 12S rRNA A1555G突變導致的耳聾病例占 30%～40%左右，其他單個致聾基因突變的遺傳負荷相對較低。高度的遺傳異質(zhì)性給遺傳性耳聾臨床基因診斷帶來極大挑戰(zhàn)。耳聾基因的突變類型多樣，包括點突變、小片段插入缺失(Indel)、拷貝數(shù)變異(Copy number variation，CNV)、結(jié)構(gòu)變異(Structural variation，SV)等，單一檢測技術(shù)難以奏效，檢測出的許多耳聾基因遺傳變異的致病性也還不完全清楚。

在NGS技術(shù)問世前，傳統(tǒng)的耳聾基因研究主要采用定位克隆策略，包括功能克隆、位置克隆、候選基因克隆、位置候選基因克隆等，功能克隆和位置克隆受限于耳聾基因功能研究、耳聾家系和群體研究等客觀困難，采用較多的方法是候選基因克隆和位置候選基因克隆。候選基因克隆在常見綜合征型耳聾中應用較多，非綜合征型耳聾由于表型差異小，大多難以通過表型特征確定候選基因。Hildebrand等[3]曾報道應用 DFNA表型特征數(shù)據(jù)庫通過特定的算法預測常染色體顯性遺傳耳聾致病基因，但適用范圍較小。位置候選基因克隆是過去20年來發(fā)現(xiàn)耳聾新基因最有效的方法，主要應用連鎖分析進行耳聾家系致病基因的染色體定位，在定位區(qū)域內(nèi)根據(jù)基因功能、表達信息等選擇合適的基因進行克隆和突變檢測。特別是近10年來人類基因組計劃的完成和高通量全基因組SNP分型技術(shù)的應用，加速了耳聾新基因的發(fā)現(xiàn)進程。但是目前的研究策略仍有很多不足[4]，隨著基因組學研究和新一代測序技術(shù)的進步，耳聾基因研究和基因診斷正步入一個新的高速發(fā)展階段。

絕大多數(shù)的遺傳性耳聾由單基因突變導致，在先天性耳聾中遺傳因素占主導地位，其中主要是單個基因雙等位基因突變導致[5]。臨床分子診斷可以提供準確的表型預測，特別是對新生兒基因型篩查可以對聽力狀況進行及早診斷以便早期干預[6]。根據(jù)群體分子流行病調(diào)查數(shù)據(jù)，國際上很多實驗室建立了常見耳聾基因的篩查方法，Sanger測序是臨床分子診斷的金標準，但是檢測效率低、成本高，傳統(tǒng)的酶切、雜交、TaqMan探針等方法針對突變熱點進行檢測，在檢測通量上仍然沒有大幅度提高。近幾年微陣列芯片的技術(shù)進步極大提高了診斷效率，降低了檢測成本。通過CFDA認證的博奧耳聾基因檢測芯片在特殊群體和新生兒耳聾基因篩查和臨床耳聾基因診斷中發(fā)揮了一定的作用。國外報道的APEX、Invader等芯片檢測技術(shù)，可以同時針對數(shù)百個突變位點進行高通量檢測，但檢測周期最長可達8周，而且檢測成本相對較高，對除點突變之外的其他突變類型的檢出能力有限(表1)[7～17]。

表1 國內(nèi)外耳聾基因檢測芯片

2 新一代測序技術(shù)在遺傳性疾病基因研究中的發(fā)展歷程

利用 NGS技術(shù)鑒定單基因遺傳病的致病基因已逐步發(fā)展形成了一整套行之有效的研究方法體系，即第一步，收集家系樣本；第二步，選擇部分樣本進行基因組掃描(全基因組重測序、全外顯子組測序、疾病相關(guān)基因大規(guī)模平行測序、目標區(qū)域測序等)；第三步，利用生物信息學分析篩選候選基因；第四步，在大規(guī)模病例和對照樣本中驗證突變；第五步，在分子、細胞、模式動物水平上進行基因功能驗證及致病機制研究。

全外顯子測序技術(shù)是一種新型的基因組分析技術(shù)，與傳統(tǒng)技術(shù)相比，具有簡便、經(jīng)濟、準確、高效的優(yōu)點，為單基因病的研究帶來了重大突破，現(xiàn)已成為單基因病研究最有效的方法。針對較大的遺傳家系，選擇幾個樣本進行全外顯子組測序及生物信息學分析，通常可以得到幾十個候選基因突變，在整個家系進行分離分析后即可找出致病基因。對于大量散發(fā)病例的研究，可以借用家系樣本的研究思路，擴大樣本量進行全外顯子組測序分析，通過分析患病個體同正常個體的差異，可以找出在人群中遺傳負荷較高的致病基因。在人體中，DNA、RNA、蛋白質(zhì)組成了一個復雜的網(wǎng)絡(luò)，在進行疾病研究時，有必要結(jié)合各種技術(shù)，多個層面分析疾病的致病機理，系統(tǒng)地闡釋疾病發(fā)生的原因。因此，在通過外顯子測序技術(shù)對疾病進行研究的同時，還需要考慮從轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學進行聯(lián)合分析，從而系統(tǒng)地描繪出疾病的致病機理和遺傳特點。

通常與某種遺傳性疾病相關(guān)的致病基因有幾個到幾百個不等，疾病相關(guān)基因大規(guī)模平行測序是指將幾個或幾百個與某種遺傳性疾病相關(guān)的致病基因的全部外顯子序列進行捕獲，然后富集捕獲到的序列進行高通量測序。很多人類疾病都與特定的基因相關(guān)，所以對這些基因集進行測序，找出基因變異，分析致病的機理，在理解人類的疾病進程中尤為重要。與外顯子測序相比，疾病相關(guān)基因大規(guī)模平行測序加入了特定的非編碼區(qū)域測序，非編碼區(qū)由于其對基因表達具有調(diào)控作用，越來越受到研究者的重視。由于疾病相關(guān)基因大規(guī)模平行測序的高效性以及尋找特定基因集變異的全面性，近年來也成為鑒定致病基因的主流技術(shù)。

通過連鎖分析，研究人員通?？梢园押蜻x致病基因定位在染色體的某個區(qū)段，對該候選區(qū)域進行富集，然后將這些富集的目標區(qū)域進行測序。常見的目標區(qū)域富集的方法有芯片雜交捕獲(On-array hybrid capture)和液相捕獲(In-solution hybrid cap-ture)、PCR、分子倒位探針(Molecular inversion probes，MIP)等。由于測序的目標區(qū)域只占全基因組的一小部分，目標區(qū)域測序能夠達到很高的測序深度。目前常用商業(yè)化目標區(qū)域測序，其目標區(qū)域大小可從2 Mb到60 Mb不等，大多數(shù)目標區(qū)域在小于10 Mb的情況下利用生物編碼(Barcode)技術(shù)將多個樣品混合后測序，一次測序可以獲得多個樣品足夠測序深度的數(shù)據(jù)。目標區(qū)域測序主要包括目標區(qū)域的捕獲富集、DNA短片段測序、生物信息學分析3個主要步驟。目標區(qū)域捕獲技術(shù)主要包括以NimbleGen為代表的固相靶向序列捕獲系統(tǒng)和以 SureSelect為代表的液相靶向序列捕獲系統(tǒng)[18,19]，兩種方法具有高準確性、高特異性、高覆蓋度和卓越的可重復性，而且可以按需設(shè)計、定制方便，在NGS應用中取得了廣泛的應用[20]。NimbleGen技術(shù)的大致流程是將打斷的基因組DNA片段與定制的芯片雜交，洗去未雜交的DNA片段，將捕獲的目標片段洗脫擴增，再進行高通量測序；SureSelect則是基于寡核苷酸合成技術(shù)，將打斷后的基因組DNA片段與RNA誘餌共同孵育，通過含有鏈酶親和素標記的磁珠釣出與誘餌結(jié)合的DNA片段，洗脫磁珠并降解誘餌，富集目的片段后進行高通量測序。目前常用的新一代測序的原理是邊合成邊測序，即將打斷的基因組DNA片段兩側(cè)連接接頭序列，用不同的方法產(chǎn)生數(shù)百萬個空間固定的單克隆簇，所有單克隆同時獨立進行引物結(jié)合和酶延伸，實時拍攝每個延伸摻入的熒光信號獲取測序數(shù)據(jù)，目前廣泛使用的Solexa測序儀和SOLiD測序儀均基于這樣的合成測序原理；Ion Torrent測序儀應用半導體測序原理，通過專有的大規(guī)模并行芯片感應器檢測密布于半導體芯片上的微反應孔內(nèi)的pH值變化，孔內(nèi)微珠上的基因組DNA片段能夠與互補的堿基結(jié)合釋放氫離子，通過電信號的檢測可以判斷堿基的類型從而獲得序列信息；SMRT是更新一代的測序儀，不需要擴增建立DNA庫，通過合成互補鏈對單個DNA分子片段直接進行測序。

3 新一代測序技術(shù)在耳聾基因研究和診斷中的應用

2010年3月，Rehman等[21]報道了第一個應用NGS技術(shù)鑒定的耳聾新基因，該研究利用NimbleGen芯片捕獲技術(shù)結(jié)合454測序平臺，對應用連鎖分析方法定位于DFNB79位點2.9 Mb區(qū)域的家系DNA樣品進行目標區(qū)域測序，發(fā)現(xiàn)TPRN基因純合無義突變，Sanger測序驗證確定在家系內(nèi)共分離，在其他3個DFNB79家系中進行TPRN基因測序，發(fā)現(xiàn)了3個移碼突變?yōu)槠渲虏≡颉妙愃频倪B鎖分析結(jié)合目標區(qū)域測序策略，Sirmaci等[22]在1個土耳其綜合征型耳聾家系中鑒定了 MASP1基因致病突變在家系中與表型共分離，并在另一個患有相同綜合征的家系中應用Sanger測序鑒定了MASP1基因另一個致病突變。Huebner等[23]報道了對2個DFNX4家系的連鎖分析定位區(qū)域進行目標區(qū)域測序，發(fā)現(xiàn)了一個新的 X-連鎖非綜合征型耳聾(DFNX)基因SMPX。傳統(tǒng)連鎖分析定位策略對參與研究家系的患者數(shù)量有較高的要求，隨著 NGS成本的快速下降，全外顯子組測序逐漸成為目前鑒定耳聾新基因的主要策略，特別是對于罕見的綜合征型耳聾，可以通過數(shù)量有限的患者鑒定出致病基因(表2)[21～43]。

NGS技術(shù)巨大的優(yōu)越性使其被迅速應用到臨床實踐中，2010年 Shearer等[44]在 PNAS上首先報道了針對 54個已知非綜合征型耳聾基因進行大規(guī)模平行測序的可行性。他們在目標區(qū)域捕獲中使用了NimbleGen芯片捕獲和SureSelect液相捕獲技術(shù)，測序系統(tǒng)分別選擇了454和Illumina測序儀。生物信息學分析利用自建的分析流程和參數(shù)設(shè)置，整合了致病性預測軟件 SIFT、BLOSUM、Polyphen2、Align-GVGD等。在6例先天性耳聾患者中鑒定出了其中 5例致病基因突變。他們認為目標區(qū)域測序技術(shù)對于耳聾的分子遺傳學診斷具有足夠的敏感性、特異性和可重復性。

2011年Brownstein等[45]報道了利用寡核苷酸探針捕獲85個人類耳聾基因和161個小鼠耳聾基因，患者基因組DNA經(jīng)過生物編碼混合后應用Illumina測序平臺進行配對末端測序。所有樣品目標區(qū)域測序深度中位數(shù)在757～2080之間，95%的目標區(qū)域測序深度>10×。在參與研究的 11個中東地區(qū)家系中鑒定了其中6個家系在CDH23、MYO15A、TECTA、TMC1和WFS1基因上的致病突變。

2012年Tang等[46]報道了應用成本更低的cDNA探針捕獲84個已知耳聾基因，46個患者基因組DNA經(jīng)過生物編碼混合后應用 Illumina測序平臺進行測序，平均測序深度263，其中86.4%的目標區(qū)域測序深度>100×。

表2 應用新一代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)的耳聾新基因

在群體遺傳背景較為相似的東亞人群中，2012年Baek等[47]首先報道了在8個韓國家系中以80個已知耳聾基因為目標區(qū)域的大規(guī)模平行測序研究，在5個耳聾家系中分別鑒定了5個不同的致病基因；2012年Mutai等[48]報道針對15個日本家系的58個耳聾患者，應用84個已知耳聾基因的大規(guī)模平行測序技術(shù)，鑒定了其中7個家系的致病基因；2012年Yang等[49]在190例耳聾患者中通過中國人群常見耳聾基因Sanger測序篩查，確診了其中65例患者的致病突變，其余患者進行了79個已知耳聾基因大規(guī)模平行測序研究，確診了另外 33例患者的基因缺陷，他們認為對散發(fā)病例在大規(guī)模平行測序之前進行常見耳聾基因突變篩查對發(fā)現(xiàn)新的耳聾基因會更有效率。

4 基于 NGS技術(shù)的耳聾基因研究和基因診斷技術(shù)發(fā)展方向

傳統(tǒng)的通過連鎖分析定位克隆耳聾基因的研究策略不適于大量的耳聾散發(fā)病例和小家系的研究，特別是對一些罕見的綜合征型耳聾。通過對遺傳性耳聾的研究，特別是孟德爾遺傳方式耳聾的致病基因鑒定，可以為我們揭示復雜性耳科疾病提供線索。老年性聾和噪聲性聾的家族聚集性一直因其患者數(shù)量的限制無法進行連鎖分析定位，新一代測序技術(shù)則可以通過有限的病例進行致病基因的鑒定；高通量低成本的大規(guī)模平行測序可以在大量的散發(fā)老年性聾和噪聲性聾病例中對已知耳聾基因進行篩查，篩選群體中的易感基因型。

大規(guī)模平行測序的臨床分子診斷應用已經(jīng)成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學的前沿，遺傳性耳聾的分子診斷、無創(chuàng)產(chǎn)前診斷等也將是大規(guī)模平行測序應用的重要領(lǐng)域。除了測序技術(shù)的進步，臨床分子診斷更依賴于生物信息學分析，特別是基因型與表型的相互關(guān)聯(lián)。大規(guī)模平行測序改變了逐個基因測序的模式，也將提供更全面的遺傳信息，改變遺傳咨詢的方式[50]。例如在非綜合征型耳聾患者中通過大規(guī)模平行測序發(fā)現(xiàn)了 CACNA1D基因突變，則提示需要補充心血管系統(tǒng)檢查，以明確是否是合并了感音神經(jīng)性聾和竇房結(jié)異常的 SANDD 綜合征(OMIM：614896)[51]。Meng等[52]應用目標區(qū)域測序技術(shù)進行了遺傳性耳聾無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的探索，該研究通過臨床分子遺傳學診斷確診先證者為GJB2基因復合雜合突變致聾，對家族中3代成員進行了超過100 Mb的目標區(qū)域高通量測序，獲得了包括 GJB2基因外顯子區(qū)域和超過10萬個tag-SNP的序列信息，根據(jù)測序結(jié)果獲得家族成員目標區(qū)域的單倍型，再通過母體外周靜脈血游離DNA的高通量測序推定胎兒的基因型，預測相關(guān)聯(lián)的聽力學表型，該研究開辟了遺傳性耳聾無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的新發(fā)展方向。

遺傳性耳聾新基因的發(fā)現(xiàn)總是伴隨著聽覺功能研究新的進展，而基因功能的研究同樣為鑒定耳聾基因提供新的線索。隨著越來越多的耳聾基因功能和基因突變病理機制的研究進展，內(nèi)耳毛細胞機械換能機制、鈣離子轉(zhuǎn)運代謝等聽覺生理通路得到充分闡釋，聽神經(jīng)病、低頻聽力下降等特殊表型的分子機制也獲得了初步的揭示。新一代測序技術(shù)和生物信息學的發(fā)展，不僅加速了新基因的發(fā)現(xiàn)，在新基因發(fā)現(xiàn)和基因功能研究之間也建立了新的橋梁。Oellrich等[53]報道了利用人類和小鼠表型數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)的基因功能數(shù)據(jù)庫，以耳聾為例通過表型數(shù)據(jù)的類比，進行候選基因的篩選和功能分析。Accetturo等[54]報道了根據(jù)已知非綜合征型耳聾基因功能利用 Semantic Similarity Measure(SSM)功能評分，篩選候選耳聾基因，并利用人類和小鼠表達數(shù)據(jù)庫、GO數(shù)據(jù)庫等進行候選耳聾基因的功能分析。目前已經(jīng)有幾十種軟件和算法可以進行關(guān)聯(lián)基因的功能分析和候選基因的預測，例如 Endeavour、GeneRECQuest、ACGR、PDG-ACE 等[55～58]，這些新的生物信息學工具，不僅可以在新一代測序數(shù)據(jù)分析中輔助篩選，隨著耳聾基因研究相關(guān)數(shù)據(jù)的增長，也將在耳聾基因功能研究中發(fā)揮重要作用。

高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展使發(fā)現(xiàn)所有耳聾基因變成了可以實現(xiàn)的目標,大規(guī)模耳聾基因平行測序技術(shù)的開發(fā)和應用為臨床耳聾基因診斷帶來了革命性的發(fā)展機遇。大規(guī)模耳聾基因平行測序技術(shù)不僅在檢測成本和檢測周期上優(yōu)于全基因組測序，數(shù)據(jù)分析也能根據(jù)比較完善的基因型與表型關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫迅速發(fā)現(xiàn)具有重要價值的信息。主要以編碼序列為目標區(qū)域的大規(guī)模平行測序技術(shù)也存在一些不足之處：(1)不論哪一種捕獲技術(shù)，在目標區(qū)域捕獲時都存在偏倚，盡管增加測序深度可以一定程度彌補偏倚，但是仍有部分區(qū)域難以捕獲；(2)大規(guī)模平行測序?qū)蚪M結(jié)構(gòu)變異的檢測具有局限性，通過增加測序深度和改進數(shù)據(jù)分析算法已經(jīng)顯著提高了CNV和 indel的檢測能力，但其靈敏度和特異度仍然低于點突變的檢測；(3)大多數(shù)非編碼序列和表觀遺傳學的修飾尚無法應用該技術(shù)檢出，可能因此存在一定的假陰性結(jié)論，但是其變異對疾病的影響仍難以評價；(4)該技術(shù)獲得的檢測結(jié)果仍然需要通過基因分型、Sanger測序等方法進行驗證，這些驗證增加了檢測耗時和成本，因此需要提高數(shù)據(jù)分析的效率；(5)在大量的檢出數(shù)據(jù)中仍有SNV未確定是否與耳聾相關(guān)，即使在已知耳聾基因中，也有部分SNV的致病性尚存爭議，不同人種的遺傳背景差異也使得SNV致病性的判定需要更加大量的數(shù)據(jù)和詳盡的分析。

由于耳聾基因研究和臨床基因診斷所面臨的巨大挑戰(zhàn)，中國的科學家們在過去的幾年中建立了一整套高效率低成本的耳聾基因變異自有檢測技術(shù)，并聯(lián)手成立了“中國遺傳性耳聾基因研究戰(zhàn)略聯(lián)盟”，目前正致力于建立大規(guī)模的中國耳聾人群基因變異數(shù)據(jù)庫，優(yōu)化 NGS數(shù)據(jù)分析策略，提高分析效率，將研究人員從海量NGS數(shù)據(jù)處理的沉重負擔中解放出來，建立適用于中國人群耳聾基因大規(guī)模平行測序診斷流程，通過大樣本的測序發(fā)現(xiàn)和彌補大規(guī)模平行測序的不足，為今后耳聾基因研究和臨床基因診斷的發(fā)展和完善提供可靠的技術(shù)保證?？梢灶A見，未來十年基于NGS技術(shù)的耳聾基因研究和臨床基因診斷技術(shù)的發(fā)展中國將走在世界的前列。

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