韓小燕，劉春雨

由營養(yǎng)性肥胖導(dǎo)致的肝臟病變已經(jīng)受到了越來越多的關(guān)注。大量的研究表明，肝臟的生理和病理過程中都有活性氧的參與，肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)會(huì)嚴(yán)重危害肝功能［1，2］，可能的原因?yàn)樽杂苫x失衡誘發(fā)細(xì)胞凋亡［3］。靈芝俗稱“神仙草”，被視為珍貴的中藥材，主要的生物學(xué)功能有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧自由基、抗衰老、保肝護(hù)肝等。所以本研究采用運(yùn)動(dòng)和營養(yǎng)干預(yù)手段，探討有氧運(yùn)動(dòng)和補(bǔ)充靈芝對(duì)營養(yǎng)性肥胖大鼠肝組織自由基代謝及肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，為防治營養(yǎng)性肥胖導(dǎo)致的肝損傷以及為分析靈芝保護(hù)肝臟的可能機(jī)制提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與肥胖模型的建立

雄性SD大鼠150只，體重(100g～120g)。普通飼料中各營養(yǎng)素供能比例為20%蛋白質(zhì)、70%碳水化合物、10%脂肪;高脂飼料中各營養(yǎng)素供能比例為20%蛋白質(zhì)、40%碳水化合物、40%脂肪。

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)選取20只為對(duì)照組，飼喂普通飼料;剩余130只飼喂高脂飼料，周期八周。每周稱量體重，八周后比較兩組大鼠重量變化，將高脂飼料喂養(yǎng)組中體重大于對(duì)照組平均體重20%的大鼠選出，作為造模成功的大鼠。

靈芝粉為市售“同仁堂靈芝粉”，純度為100%。將靈芝粉用蒸餾水配置成不同濃度的液體，按照0.35g/kg體重的劑量進(jìn)行灌胃。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥和運(yùn)動(dòng)方案 選取正常喂養(yǎng)大鼠10只作為正常對(duì)照組(A)，從造模成功的大鼠中隨機(jī)選取40只肥胖大鼠，將其隨機(jī)分為四組，每組10只，飼喂高脂飼料。飼料配方和飼養(yǎng)環(huán)境同造模期。具體分組如下:肥胖對(duì)照組(B)、肥胖靈芝組(C)、肥胖運(yùn)動(dòng)組(D)、肥胖運(yùn)動(dòng)+靈芝組(E)，每組10只。C和E組每日上午8:00灌服靈芝液0.35g/kg體重;B和D組灌服等量的蒸餾水;D和E組進(jìn)行低強(qiáng)度有氧跑臺(tái)訓(xùn)練，下午2:00開始，負(fù)荷設(shè)定為16m/min，60min/day，每周運(yùn)動(dòng)五天，休息兩天。六周后處死，檢測(cè)各指標(biāo)。

1.2.2 試劑

所有試劑均購自南京建成公司，嚴(yán)格按照說明進(jìn)行操作。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，于最后一天訓(xùn)練后禁食12h，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，解剖腹腔，腹主動(dòng)脈采血10mL;所有血樣在2h內(nèi)，4000rpm離心10 min后，吸取上清液保存于－20℃冰箱，以備測(cè)血清AST、ALT活性。迅速分離肝臟，制備10%肝組織勻漿，將勻漿液以3500rpm低溫離心10min，取上清液－20℃保存，以備測(cè)肝組織SOD和GSH-Px活力，MDA的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示為顯著性差異，P＜0.01表示為極顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合靈芝對(duì)肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的影響

肥胖對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞SOD、GSH-Px活性比正常對(duì)照組高，但是差異不顯著，肝細(xì)胞MDA含量比正常對(duì)照組顯著增加;與肥胖對(duì)照組比較，肥胖靈芝組和肥胖運(yùn)動(dòng)組大鼠肝細(xì)胞SOD、GSH-Px活性顯著升高，MDA含量顯著降低;肥胖+運(yùn)動(dòng)+靈芝組上述變化達(dá)極顯著水平(見表1)。

表1 各組大鼠肝臟SOD、GSH-Px活性，MDA含量比較表

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合靈芝對(duì)肥胖大鼠肝臟的損傷

肥胖對(duì)照組大鼠血清AST、ALT活性比正常對(duì)照組顯著升高;與肥胖對(duì)照組比較，肥胖靈芝組和肥胖運(yùn)動(dòng)組大鼠血清AST、ALT活性顯著降低;肥胖+運(yùn)動(dòng)+靈芝組達(dá)極顯著水平見表2。

表2 各組大鼠血清AST、ALT活性比較

3 分析與討論

3.1 有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合靈芝對(duì)肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的影響

脂質(zhì)過氧化是多不飽和脂肪酸的自由基反應(yīng)產(chǎn)物，能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。肝臟作為機(jī)體的生化代謝中心，是脂質(zhì)過氧化最敏感的器官之一。Angulo認(rèn)為肝臟線粒體產(chǎn)生的過量ROS會(huì)直接或通過氧化脂質(zhì)引起肝臟脂肪病變，而肝臟的脂肪病變會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致 ROS的大量生成，形成惡性循環(huán)［4］。SOD(超氧化物歧化酶)、GSH-Px等是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的主要組分，MDA(丙二醛)是多不飽和脂肪酸過氧化物的降解產(chǎn)物，是評(píng)價(jià)機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的主要指標(biāo)。高脂膳食可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)［5］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肥胖對(duì)照組大鼠肝臟細(xì)胞MDA含量升高，SOD和GSH-Px的活性均顯著高于對(duì)照組。這一結(jié)果與馬國棟［6］及羅艷蕊［7］的研究結(jié)果一致。原因是高水平的ROS可能作為信號(hào)分子誘導(dǎo)抗氧化酶活性的增加，但是這種增加并沒有完全滿足清除過量ROS的需要。

以往的研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)可以有效提高機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)的能力［8］。鄧玉強(qiáng)和金其貫的研究表明，長期有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后肝組織抗氧化酶SOD活力比高脂飲食組顯著提高，MDA含量顯著降低［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述發(fā)現(xiàn)基本一致。有氧運(yùn)動(dòng)使肥胖大鼠的肝臟細(xì)胞MDA含量明顯降低，SOD和GSH-Px的活性明顯升高。有氧運(yùn)動(dòng)使機(jī)體自由基代謝能力增強(qiáng)，一方面是由于運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練增強(qiáng)了氧運(yùn)輸系統(tǒng)的能力，提高了組織器官的血供調(diào)節(jié)能力，組織相對(duì)缺氧程度較小，自由基生成較未訓(xùn)練者少［10］;另一方面，抗氧化系統(tǒng)得以增強(qiáng)，能更加有效地?cái)z取和清除產(chǎn)生的自由基［11］。

近年來通過補(bǔ)充外源性抗氧化物質(zhì)以提高機(jī)體抗氧化能力的方式被廣泛認(rèn)可。眾多研究均證實(shí)靈芝具有抗氧化作用［12］。本研究觀察到補(bǔ)充靈芝使肥胖大鼠肝臟細(xì)胞SOD和GSH-Px的活性提高，MDA含量降低。表明靈芝對(duì)高脂膳食誘導(dǎo)的營養(yǎng)性肥胖大鼠肝臟脂質(zhì)氧化損傷具有明顯的抑制作用，而且靈芝聯(lián)合有氧運(yùn)動(dòng)能起到更加有效的作用。主要原因在于靈芝的組分之一的靈芝多糖有抑制氧化損傷及抑制iNOS表達(dá)的作用［13］。另外靈芝中含有豐富的微量元素和多種維生素及氨基酸。其中硒是GSH-Px的組成部分，使GSH-Px含量及活性逐漸增加;Zn是SOD的激活因子，可以使SOD活性提高;維生素E、維生素C、β-胡蘿卜素和谷胱甘肽等物質(zhì)構(gòu)成非酶性抗氧化-還原系統(tǒng)，清除活性氧的化合物。

3.2 有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合靈芝對(duì)肥胖大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用

丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)主要存在于肝細(xì)胞質(zhì)中，由于整個(gè)肝內(nèi)酶活性比血清中約高100倍，故只要有1%的肝細(xì)胞損傷，即可使血清中酶活性增高一倍，因而為WHO推薦的最敏感的肝功能檢測(cè)指標(biāo)之一。任何原因引起的肝細(xì)胞損傷均可導(dǎo)致ALT增高。而天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)在肝組織細(xì)胞壞死時(shí)，血清中AST也會(huì)明顯升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肥胖對(duì)照組大鼠血清ALT、AST活性與正常對(duì)照組相比均明顯升高。提示六周高脂膳食誘導(dǎo)的營養(yǎng)性肥胖大鼠的肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷。肝損傷是多因素參與的復(fù)雜過程，自由基損傷和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)在肝疾病中起著十分重要的作用。分析原因可能為高脂飲食導(dǎo)致肝組織脂肪浸潤，加重了肝臟脂質(zhì)氧化損傷的程度，導(dǎo)致肝細(xì)胞受到損傷。

本研究結(jié)果顯示，肥胖運(yùn)動(dòng)組與肥胖對(duì)照組相比，血清ALT、AST活性明顯降低，提示有氧運(yùn)動(dòng)可以改善營養(yǎng)性肥胖大鼠肝臟的損傷狀況。同時(shí)長期有氧運(yùn)動(dòng)顯著提高了肝組織SOD活性、降低MDA含量，提示有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)肝損傷的保護(hù)作用是通過提高大鼠肝組織的抗氧化能力、抑制脂質(zhì)過氧化實(shí)現(xiàn)的。

靈芝能促進(jìn)肝臟核酸、蛋白質(zhì)的合成和增加肝細(xì)胞色素P-450含量，有一定的保肝護(hù)肝的功效，在臨床上用于治療多種肝炎。多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)靈芝能明顯降低由注射四氯化碳所引起的小鼠血清ALT升高，及降低肝臟甘油三脂的蓄積，并能減輕乙硫氨酸引起的脂肪肝，促進(jìn)肝細(xì)胞再生［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肥胖靈芝組大鼠的血清ALT、AST活性明顯低于肥胖對(duì)照組。提示靈芝對(duì)營養(yǎng)性肥胖導(dǎo)致的肝臟損害有保護(hù)作用。此外，靈芝可以提高肝臟組織中抗氧化酶活性，減輕自由基對(duì)肝臟組織造成的脂質(zhì)過氧化損傷，能有效改善肝組織自由基代謝，保護(hù)肝細(xì)胞膜的完整。

4 結(jié)論

(1)六周高脂膳食使大鼠血清AST、ALT活性上升，這與高脂飲食導(dǎo)致自由基代謝加強(qiáng)、損傷肝細(xì)胞、引起血清酶活性增高有關(guān)。

(2)有氧運(yùn)動(dòng)或補(bǔ)充靈芝能顯著的降低營養(yǎng)性肥胖大鼠血清AST、ALT活性，提高肝組織抗氧化酶活性。有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合靈芝效果更明顯。

［1］Janardan K Reddy，M Sambasiva Rao.Lipid Metabolism and Liver Inflammation.II.Fatty liver disease and fatty acid oxidation［J］.Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol，2006(290):852～858.

［2］Yoosoo Chang，Seungho Ryu，Eunju Sung，et al.Higher Concentrations of Alanine Aminotransferase within the Reference Interval Predict.Nonalco-holic Fatty Liver Disease［J］.Clinical Chemistry，2007(53):686 ～692.

［3］n LL，Xie LP，Li LH，et al.Reactive oxygen speciesproduction and Bax/Bc-l 2 regulation in honokio-l inducedapoptosis in human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells［J］.Environ Toxicol Pharmacol，2009，28(1):97 ～103.

［4］Angulo P.Nonalcoholic fatty liver disease［J］.N Engl J Med，2002，346(16):1221 ～1231.

［5］羅艷蕊，王建設(shè)，崔迪.茶多酚對(duì)營養(yǎng)性肥胖大鼠肝臟自由基代謝的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志.2012，28(3):196～198.

［6］馬國棟，劉艷環(huán).耐力運(yùn)動(dòng)對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠肝臟NO水平、NOS活性及表達(dá)的影響［J］.天津體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，23(6):518～520.

［7］羅艷蕊，王建設(shè)，李新，季瀏.有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合茶多酚對(duì)高脂膳食大鼠肝臟抗氧化能力的影響［J］.北京體育大學(xué)學(xué)報(bào).2011，34(11):62 ～65.

［8］李亮，楊波，張鈞.有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)蛋氨酸誘導(dǎo)高半胱氨酸血癥大鼠抗氧化應(yīng)激能力的影響［J］.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2006，25(3):282～285.

［9］鄧玉強(qiáng)，金其貫.有氧運(yùn)動(dòng)和大豆多肽對(duì)高脂飲食大鼠肝臟自由基代謝及組織形態(tài)的影響［J］.北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32(2):70 ～73.

［10］彭峰林，喬秀芳.運(yùn)動(dòng)與自由基［J］.徐州師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，18(4):76 ～78.

［11］唐量，熊正英.蘆薈對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練小鼠肝組織自由基代謝及超微結(jié)構(gòu)影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2002，21(6):607～609.

［12］史亞麗，劉運(yùn)祥，韓立明.靈芝多糖對(duì)力竭小鼠抗脂質(zhì)過氧化作用研究.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，33(6):889～890.

［13］王昕，章國良，林志彬.靈芝多糖對(duì)BCG免疫性肝損傷所致肝臟氧化應(yīng)激的影響及機(jī)制研究［C］.2011國際靈芝研究學(xué)術(shù)會(huì)議，73～74.

［14］海林，吳佩穎，王建新.靈芝的研究及應(yīng)用進(jìn)展［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2005，16(2):141 ～143.