劉 暉，劉 凱，招展奇

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院普外科，上海 200065;2.上海市全康醫(yī)療中心口腔科，上海 200040;3.德國阿爾伯特·路德維希大學(xué)附屬醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)實驗室，德國弗萊堡 79106)

機(jī)械通氣是治療呼吸衰竭的關(guān)鍵措施，應(yīng)用不當(dāng)可能會引起嚴(yán)重的并發(fā)癥。如過多的能量傳送至肺，可導(dǎo)致呼吸機(jī)性肺損傷(ventilator induced lung injury，VILI)。VILI與急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)患者死亡率高有密切的關(guān)系。VILI的主要發(fā)病機(jī)制之一是不張傷(atelectrauma)，即由于肺泡復(fù)張/失復(fù)張時產(chǎn)生的應(yīng)切力損傷肺泡上皮［1］。肺泡復(fù)張是指在正壓通氣過程中通過升高肺泡內(nèi)壓使原來塌陷的肺泡重新開放的過 程［2］。呼 氣 末 正 壓 (positive end-expiratory pressure，PEEP)的應(yīng)用可防止肺泡失復(fù)張，即防止已開放的肺泡塌陷［3］。PEEP能維持肺容積，保持肺表面活性物質(zhì)的功能，減少因肺泡或細(xì)支氣管反復(fù)復(fù)張/失復(fù)張而產(chǎn)生的應(yīng)切力。因此，PEEP能減少呼吸機(jī)性肺損傷的發(fā)生。

1990年之前，高潮氣量(volume ventilation，VT)通氣被廣泛應(yīng)用于ARDS的治療，那時普遍的觀點認(rèn)為，機(jī)械通氣的首要目標(biāo)是使動脈血氧分壓(PaO2)維持在正常水平。但是，采用高潮氣量通氣可能導(dǎo)致肺的具有氧合功能的正常區(qū)域發(fā)生過度膨脹。目前已知過量的呼氣末肺容積是呼吸機(jī)性肺損傷的關(guān)鍵誘發(fā)因素［4-5］。1993年，美國胸內(nèi)科醫(yī)師全國會議建議對ARDS患者應(yīng)采用低潮氣量的機(jī)械通氣［6］。1998年，Amato首先采用 VT ＜6 ml/kg的保護(hù)性機(jī)械通氣模式治療ARDS患者，相對于常規(guī)的通氣策略，低潮氣量的機(jī)械通氣明顯降低患者的死亡率(38%vs.71%)［7］。

以上結(jié)果源自間接測量所得，如壓力-容積曲線，計算機(jī)斷層掃描及電子束成像術(shù)等。2007年，Halter等［8］采用活體顯微成像技術(shù)分析了不同的VT-PEEP組合對肺泡的影響。第一次觀察到低VT-高PEEP對穩(wěn)定肺泡具有協(xié)同作用。而且增加PEEP比減少VT更能有效地穩(wěn)定肺泡。然而，他們忽略了肺泡顯微鏡物鏡鏡頭與臟胸膜表面接觸所產(chǎn)生的局部壓力，這種壓力可能對顯微視野下臟胸膜肺泡有較大的影響，由此可能引發(fā)對實驗結(jié)果的錯誤解釋。

本研究開發(fā)了一種新的肺泡顯微鏡，它可以直接測量和控制顯微視野下的局部壓力，甚至能減少直至消除顯微視野下的局部壓力。本研究采用這個獨特的肺泡顯微鏡檢測離體無灌注損傷鼠肺及正常鼠肺的肺泡動力學(xué)，研究不同的PEEP-VT組合的機(jī)械通氣模式對無灌注損傷鼠肺及正常鼠肺的肺泡動力學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 肺泡顯微技術(shù)

肺泡顯微鏡(圖1)是物鏡為視野10度、觀察角度0度、直徑2.3 mm的硬質(zhì)透鏡。外接冷光源，光線通過光導(dǎo)纖維傳導(dǎo)。內(nèi)窺鏡置于雙套管系統(tǒng)中(Schoelly fiberoptic GmbH公司，德國)。這套雙套管系統(tǒng)由外徑為6.5 mm的外套管和外徑為3.3 mm的內(nèi)套管組成。雙套管系統(tǒng)的頭部固定內(nèi)窺鏡，其末端平面正好位于內(nèi)窺鏡物鏡的焦點上，焦點距物鏡2 mm。應(yīng)用肺泡顯微鏡時，物鏡鏡頭和聚焦平面之間有一空間，該空間充滿平衡鹽溶液后，能在目鏡上得到清晰的圖像。平衡鹽溶液從雙套管系統(tǒng)的注水孔注入，將該空間內(nèi)的殘留空氣排空，直至得到滿意的顯微圖像為止。

圖1 肺泡顯微鏡Fig.1 Microscopic endoscope

數(shù)碼相機(jī)的最大變焦距離f為50 mm。圖像分辨率為 725×756像素，對應(yīng)的臟胸膜面積為0.96 mm ×1.09 mm，數(shù)碼相片采用 bitmap 文件格式保存(Ulead Video Studio 8，臺灣ULEAD公司)。通過改變儲水器中水平面與肺泡顯微鏡末端聚焦平面的相對位置，可以調(diào)節(jié)局部胸膜壓。負(fù)壓吸引的區(qū)域位于內(nèi)外套管之間的環(huán)狀管腔，它的作用是固定離體鼠肺和顯微鏡物鏡之間的位置，保證顯微視野在實驗中不發(fā)生偏移。通過改變負(fù)壓吸引器的控制閥可以控制負(fù)壓吸引的大小。

1.2 離體無灌注肺的準(zhǔn)備

12只280～350 g雌性Wistar大鼠被分為兩組，損傷組8只，其他4只作為對照組。異氟烷氣體吸入麻醉后，切開右頸動脈放血處死大鼠。開胸后，游離肺，仔細(xì)將肺與周圍血管神經(jīng)離斷后移出體外。漏氣肺被棄用。Tween-20能使肺泡表面活性物質(zhì)失活，造成即刻肺損傷。5%Tween-20生理鹽水溶液(4.5 ml/kg)被注入氣管，氣管插管與小動物呼吸機(jī)(Flexi Vent，加拿大SCIREQ公司)相連，采用PEEP 20 cmH2O-VT 6 ml/kg組合，機(jī)械通氣10次，使離體肺膨脹，以提高肺泡表面物質(zhì)失活劑Tween-20分布。隨后，通過氣管插管吸出殘留的Tween-20生理鹽水溶液。然后將肺懸掛固定于暗盒內(nèi)(圖2)，暗盒與霧化器相連，霧化器產(chǎn)生霧化水蒸汽，防止離體肺干燥。

圖2 離體肺在圓柱體暗盒內(nèi)Fig.2 Schematic view of the exercised normal lung in chamber

正常對照組肺的處理方法同前，但不采用Tween-20生理鹽水溶液灌注。Tween-20灌注引起了異質(zhì)性損傷，肺表面不同區(qū)域損傷程度不同。在顯微鏡貼附于臟胸膜表面后，吸附孔與負(fù)壓吸引器相連，采用－5 cmH2O吸附壓以保證實驗中被觀察部位保持不變。隨后，內(nèi)套管和壓力測量口注滿了平衡液。吸附壓測量孔和沖洗壓測量孔與壓力傳感器(Medex MX960)連接。氣道壓力測定采用壓電電阻壓力傳感器(德國SI-Special Instruments GmbH公司)。所有信號均經(jīng)數(shù)字化處理(NI PCI-6289，美國National Instruments公司)。每次實驗之前，所有傳感器預(yù)先校準(zhǔn)。

1.3 實驗設(shè)計

研究采用三種不同水平的 PEEP:5、10、20 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，三種水平的 VT 分別為6、10、15 ml/kg，共有 9 組不同的 PEEP-VT 組合，實驗過程中，吸附壓保持－5 cmH2O不變，局部胸膜壓固定于0 cmH2O。

取得離體肺后，肺泡顯微鏡放置于肺表面，數(shù)碼攝像儀記錄機(jī)械通氣過程中每個PEEP-VT組合肺泡變化的情況。每次實驗時，先固定VT，由高向低逐步降低 PEEP水平，即從20 cmH2O降至5 cmH2O。當(dāng)完成PEEP為5 cmH2O水平的機(jī)械通氣后，由低至高逐步調(diào)高潮氣量，即從6 ml/kg至15 ml/kg，在每個不同的VT水平，如前所述由高向低逐步降低PEEP水平。為了規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)通氣量，每次更改潮氣量設(shè)置前，預(yù)先采用PEEP 20 cmH2OVT 6 ml/kg組合進(jìn)行機(jī)械通氣，使塌陷的離體肺重新復(fù)張。每種PEEP-VT組合機(jī)械通氣開始3 min后記錄肺泡的視頻影像。

1.4 呼吸機(jī)設(shè)置

機(jī)械通氣采用容量控制模式，呼吸頻率20次/min，吸氣時間 1.2 s，呼氣時間 1.8 s，吸氣時間∶呼氣時間 =1∶1.5。

1.5 圖像分析

攝像儀連續(xù)記錄5個通氣周期。應(yīng)用Virtual-Dub 軟件(VitualDub 1.7.6，Avery Lee)，從這些影像學(xué)資料中截取吸氣末和呼氣末的靜止圖像，分析可辨認(rèn)肺泡結(jié)構(gòu)的數(shù)量及大小。通過計算機(jī)輔助分析系統(tǒng)勾勒出肺泡的境界，然后采用Metlab R2006a計算其面積。為排除由于聚焦平面的變化對肺泡數(shù)量及大小的影響，實驗中始終保持聚焦點的一致，避免重新聚焦。肺泡穩(wěn)定性的評價采用(吸氣末肺泡面積-呼氣末肺泡面積)/吸氣末肺泡面積 ×100%［9］，用 I-E%表示。

本研究中所有實驗均嚴(yán)格遵守德國國立衛(wèi)生研究院有關(guān)實驗動物使用的準(zhǔn)則。議定書由德國Albert-Ludwigs大學(xué)附屬醫(yī)院人道使用動物委員會核準(zhǔn)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 12.0軟件包進(jìn)行單因變量方差分析。所有實驗數(shù)據(jù)采用x±s表示，一旦F值有顯著性差異，采用LSD法確定組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 對照組

當(dāng)PEEP為5 cmH2O時，無論VT大小，在潮氣通氣過程中，肺泡的大小、形態(tài)無顯著改變，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。當(dāng)VT為6 ml/kg時，I-E%為0.6% ±6.4%;當(dāng) VT 為10 ml/kg 時，IE%為0.3% ±7.2%;VT 為 15 ml/kg時，I-E%為－6.3% ±13.3%。隨VT的升高，正常離體肺肺泡吸氣和呼氣末的影像見圖3。表明正常肺泡的動力學(xué)很穩(wěn)定，無論機(jī)械通氣采用何種PEEP-VT組合，I-E%變化很小，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 損傷組

Tween-20灌注后，當(dāng) PEEP為 5cmH2O或10 cmH2O時，無論機(jī)械通氣采用的潮氣量大小，肺泡均不穩(wěn)定，與通氣參數(shù)設(shè)置相同的正常肺比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。并且當(dāng) PEEP為5 cmH2O時，無論機(jī)械通氣采用的潮氣量大小，肺泡的穩(wěn)定性最小(I-E%為100%)。只有當(dāng)PEEP為20 cmH2O時，損傷肺肺泡穩(wěn)定，不論VT的設(shè)置，與正常肺相同的設(shè)置比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，肺泡都很穩(wěn)定，I-E%為 0.2% ±9.3%。當(dāng)VT 6 ml/kg時，隨PEEP的降低，損傷肺吸氣和呼氣末的影像見圖4。

顯微視野下，正常肺肺泡數(shù)目在機(jī)械通氣過程中沒有顯著變化(P＞0.05)。由于損傷肺在機(jī)械通氣過程中，顯微視野下有一部分肺泡輪廓模糊，因此本研究沒有計算損傷肺顯微視野下肺泡的數(shù)目。當(dāng)PEEP為20 cmH2O時，損傷肺肺泡數(shù)目在機(jī)械通氣過程中幾乎沒有變化，而 PEEP為5或10 cmH2O時，肺泡數(shù)目在機(jī)械通氣過程中變化很大，尤其當(dāng)PEEP為5 cmH2O時，呼氣末胸膜肺泡完全塌陷。

圖3 正常離體肺吸氣和呼氣末的顯微圖像Fig.3 Photomicrographs of the same microscopic field at peak inspiration and end-expiration in normal Lung

圖4 損傷肺吸氣末與呼氣末肺泡顯微照片F(xiàn)ig.4 Photomicrographs of the same microscopic field at the end of expiration and end of inspiration in injured lung

表1 正常肺及損傷肺的肺泡穩(wěn)定性Tab.1 The quantity of the alveolar stability ofnormal lung and injured lung (±s，%)

表1 正常肺及損傷肺的肺泡穩(wěn)定性Tab.1 The quantity of the alveolar stability ofnormal lung and injured lung (±s，%)

與正常肺相比，(1)P＜0.01;與相同設(shè)置的損傷肺PEEP為20 cmH2O時相比，(2)P＜0.01

VT/(ml·kg －1)PEEP 5 cmH2正常肺PEEP損傷肺O 10 cmH2O 20 cmH2O 5 cmH2O 10 cmH2O 20 cmH2O 0.6 ±6.4 －3.3 ±9.9 0.7 ±11.4 100.0 ±0.0(1)(2) 23.5 ±17.5(1)(2) 0.04 ±6.6 10 0.3 ±7.2 －5.3 ±20.2 －2.6 ±10.5 100.0 ±0.0(1)(2) 30.2 ±18.0(1)(2) －0.40 ±10.1 15 －6.3 ±13.3 －7.0 ±10.7 －4.6 ±9.2 100.0 ±0.0(1)(2) 38.4 ±14.8(1)(2) 0.60 ±11.2 6

3 討 論

比較機(jī)械通氣時采用不同的PEEP-VT組合對正常肺及損傷肺的影響，結(jié)果顯示二者的肺泡動力學(xué)差異很大。正常肺肺泡動力學(xué)穩(wěn)定，不同的PEEP-VT組合之間，肺泡動力學(xué)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。通過肺泡顯微鏡直接觀察機(jī)械通氣過程中正常肺的肺泡，未發(fā)現(xiàn)肺泡的大小和形態(tài)有顯著變化，這和眾多研究［10-11］的結(jié)果是一致的。機(jī)械通氣過程中肺泡的大小無顯著變化的原因可能如下。(1)連續(xù)的肺泡復(fù)張/失復(fù)張:在機(jī)械通氣過程中，肺泡數(shù)目發(fā)生顯著變化，即吸氣末肺泡數(shù)目增多，呼氣末肺泡數(shù)目減少，但復(fù)張肺泡的大小不變;(2)肺泡發(fā)生皺褶和去皺褶改變;(3)機(jī)械通氣過程中，肺泡管隨呼吸周期膨脹和收縮，肺泡開口和肺泡管的大小發(fā)生改變，但肺泡本身大小不變［12-13］。

在本實驗中沒有觀察到機(jī)械通氣過程中正常肺胸膜下肺泡大小和數(shù)目發(fā)生顯著變化。因此，本研究不能肯定在機(jī)械通氣過程中正常肺肺泡發(fā)生復(fù)張/失復(fù)張。

本實驗特別注意保證肺泡顯微鏡和肺的相對位置固定不變，跟蹤研究同一顯微視野下肺泡在不同實驗條件下的動態(tài)變化。當(dāng)肺擴(kuò)張壓降至臨界值時，首先出現(xiàn)肺泡的融合，隨后，隨著擴(kuò)張壓的下降，合并的肺泡結(jié)構(gòu)塌陷。發(fā)生肺泡融合時，單個肺泡樣結(jié)構(gòu)的大小明顯增大。在同一實驗組或不同實驗組間，觀察到塌陷的肺泡復(fù)張時不是以簡單的爆發(fā)式的方式突然出現(xiàn)，而趨于從融合的肺泡結(jié)構(gòu)中以“出芽”的方式出現(xiàn)。Direceo等［10］在研究損傷豬肺的肺泡動力學(xué)時也注意到了類似的現(xiàn)象。他認(rèn)為是塌陷的肺泡以肺泡管為中心，圍繞肺泡管形成團(tuán)簇狀結(jié)構(gòu)。雖然依據(jù)二維圖像很難從形態(tài)學(xué)上辨別單個肺泡或肺泡管，本研究的觀察結(jié)果依然支持如下假設(shè):融合肺泡可能塌陷形成細(xì)支氣管。臟胸膜出現(xiàn)融合的肺泡狀結(jié)構(gòu)的大小不能反映單個肺泡的實際大小。為避免對實驗結(jié)果嚴(yán)重影響，在對顯微圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時，本研究排除了融合的肺泡狀結(jié)構(gòu)。

本研究認(rèn)為，對于損傷肺，PEEP是獨立于VT的肺泡穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。肺泡穩(wěn)定與高PEEP相關(guān)。當(dāng)VT為6 ml/kg，肺泡的穩(wěn)定性隨著PEEP從5 mmHg到20 mmHg的升高而逐漸升高，而當(dāng)PEEP分別為5、10 mmHg時，減小VT肺泡的穩(wěn)定性并沒有發(fā)生變化。這可能意味著升高PEEP所帶來的好處比減小VT所帶來的好處大。

Hickling等［14］發(fā)現(xiàn)采用低 VT機(jī)械通氣的益處，第一次證實在機(jī)械通氣中通過減小VT來降低吸氣峰壓，能顯著降低ARDS患者的死亡率(16%vs39.6%)［14］。Amato 等［7］研究高 PEEP-低 VT(6 ml/kg)和低PEEP-高VT(12 ml/kg)兩種不同的機(jī)械通氣設(shè)置對ARDS患者的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同的PEEP-VT組合之間ARDS患者死亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用高PEEP-低VT(6 ml/kg)組，患者第28天死亡率為38%，而另一組(VT 12 ml/kg)的死亡率為71%。2000年，美國國立衛(wèi)生中心(NIH)進(jìn)行了歷史上最大規(guī)模的臨床研究，通過多中心協(xié)作，他們分析了861例ARDS患者采用6 ml/kg和12 ml/kg兩種不同潮氣量對死亡率的影響，結(jié)果顯示，采用VT 6 ml/kg組的死亡率較另一組下降了9%［15］，這為在臨床中采用低潮氣量機(jī)械通氣模式提供了強(qiáng)有力的依據(jù)。

本實驗采用高PEEP，不同的VT設(shè)置對肺泡動力學(xué)改變差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但高VT使肺泡過度擴(kuò)張，升高吸氣末峰壓，這將導(dǎo)致機(jī)械牽拉力增高，導(dǎo)致呼吸機(jī)性肺損傷。而低VT能降低平臺壓，減少肺泡周期性的膨脹/塌陷，減少呼吸機(jī)性肺損傷的發(fā)生。

本研究表明對于損傷肺，采用20 cmH2O PEEP與6 ml/kg VT組合時，肺泡穩(wěn)定性最高，20 cmH2O PEEP與不同的VT組合之間無顯著性差異。當(dāng)PEEP為5 cmH2O時，不論潮氣量的大小，肺泡均不穩(wěn)定，與Halter等［8］的研究結(jié)果一致。有趣的是，這兩種實驗條件有很大的差異。(1)采用的動物模型不同。本實驗采用的是離體無灌注鼠肺，而Halter采用的是活體豬;(2)研究部位不同。本實驗選擇損傷程度相近的部位，而他們的研究部位是固定的，位于右胸第二肋間隙;(3)本實驗肺泡顯微鏡能控制顯微視野下的局部胸膜壓，消除局部胸膜壓對實驗結(jié)果的影響，而在他們的實驗中不能消除肺泡顯微鏡物鏡和臟胸膜接觸所產(chǎn)生的局部壓力。

本研究中有關(guān)肺泡穩(wěn)定性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)誤很高，原因可能如下。(1)盡管本研究盡量選取損傷程度相近的觀察的部位，但這些部位的選擇僅依賴肉眼判斷;(2)由Tween-20引發(fā)的肺損傷為非同質(zhì)性;(3)相同顯微視野下，不同的肺泡的肺泡動力學(xué)也不盡相同，通過對正常肺和損傷肺的影像觀察發(fā)現(xiàn)，即使是高PEEP-低VT組合，在吸氣末，有些肺泡的面積輕微增大，而有些肺泡的面積會略減小;(4)使肺和肺泡顯微鏡保持固定的負(fù)壓可能會對肺泡穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，盡管在實驗中應(yīng)用的負(fù)壓為－5 cmH2O，這是目前已知能保持視野固定的最小負(fù)壓，可以想象，呈圓環(huán)狀分布的吸附固定負(fù)壓，可能增加被吸附固定在顯微視野下的臟胸膜的跨肺壓;(5)在進(jìn)行面積測量時，選取圖像清晰、邊界清楚的肺泡，因此，肺泡的選取具有非隨機(jī)性。盡管標(biāo)準(zhǔn)誤很大，但我們不但從統(tǒng)計學(xué)，而且通過肺泡顯微鏡直觀地證明了從正常肺到損傷肺肺泡穩(wěn)定性劇烈的變化。

在本實驗中采用的動物模型為離體無灌注鼠肺。采用這種動物模型原因，其一是因為使選擇損傷程度相近的部位作為肺泡顯微鏡的研究部位成為可能;其二，在實驗中可以選擇高 PEEP-高 VT組合，不存在活體實驗時血流動力學(xué)受影響的問題。本研究有以下不足:肺泡顯微只能研究臨近臟胸膜的肺泡，即胸膜下肺泡。胸膜下肺泡的結(jié)構(gòu)與肺實質(zhì)內(nèi)部肺泡有所不同。內(nèi)部肺泡的四周被相鄰肺泡所包繞，而胸膜下肺泡的其中一部分與臟胸膜相鄰。因此，胸膜下肺泡的這種結(jié)構(gòu)可能會減少肺泡的支持力，導(dǎo)致胸膜下肺泡較肺實質(zhì)內(nèi)肺泡更易于塌陷［16］。肺泡顯微鏡技術(shù)不能分析肺泡的三維結(jié)構(gòu)，只能在聚焦平面上測量肺泡的二維面積。盡管在實驗過程中避免重聚焦，但當(dāng)臟胸膜肺泡塌陷后，深部肺泡結(jié)構(gòu)會突向臟胸膜，進(jìn)入聚焦平面，使肺和肺泡顯微鏡保持固定的負(fù)壓可能會對肺泡穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。但眾多研究表明，吸附壓對肺泡的影響很小，可以忽略不計［17-18］。本研究采用的動物模型為離體無灌注鼠肺而不是活體動物。采用Tween-20灌注使肺泡表面活性物質(zhì)失活引起快速肺損傷制作損傷肺的模型，盡管Dirocco等［10］的研究顯示Tween-20灌注肺損傷和呼吸機(jī)性肺損傷的始動因素是一樣的，即首先使使肺泡表面活性物質(zhì)失活［10］，但它是否能真實模擬呼吸機(jī)性肺損傷尚未確定。

本研究采用新的肺泡顯微鏡研究機(jī)械通氣過程中離體非灌注大鼠肺的肺泡肺泡動力學(xué)。正常肺泡穩(wěn)定性是獨立于PEEP-VT設(shè)置。在損傷肺中，機(jī)械通氣采用PEEP 20 cmH2O，肺泡穩(wěn)定，而PEEP降低，無論采用的VT大小，肺泡均不穩(wěn)定。

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