路迎冬，張 旭，馬 婧，張連峰，馬元武

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

精子特異性Sleeping Beauty轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立

路迎冬，張 旭，馬 婧，張連峰，馬元武

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

目的 建立精子特異性表達(dá)Sleeping Beauty（SB）轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為研究SB轉(zhuǎn)座子在小鼠中的應(yīng)用提供工具。方法 克隆精子特異性啟動(dòng)子用以驅(qū)動(dòng)SB轉(zhuǎn)座酶基因的表達(dá)，建立精子特異性表達(dá)SB轉(zhuǎn)座酶的載體，利用顯微注射方法建立以C57BL/6J為背景的精子特異性表達(dá)SB轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR鑒定首建鼠的基因型，western blot（WB）和免疫組織化學(xué)（IHC）檢測(cè)SB轉(zhuǎn)座酶基因在小鼠生殖腺睪丸中的表達(dá)情況，篩選睪丸中高表達(dá)SB轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)果 顯微注射方式獲得了5只首建小鼠，其中3只能穩(wěn)定傳代，利用WB和IHC成功的篩選出一株在精子中高表達(dá)SB轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)論 成功建立了精子特異性高表達(dá)SB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為將SB轉(zhuǎn)座子作為一種基因工程工具應(yīng)用于小鼠基因修飾模型的建立提供非常重要的工具資源。

DNA轉(zhuǎn)座子；Sleeping Beauty；轉(zhuǎn)座酶

自1950年轉(zhuǎn)座子發(fā)現(xiàn)以來(lái)，轉(zhuǎn)座子作為一種重要的基因工程功能分析工具，在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）［1］、線蟲（Caenorhabditis elegans）［2］、家蠶（Silkworm）［3］等低等生物中發(fā)揮著重要的作用。隨著多個(gè)物種基因組序列圖譜的完成，在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了大量轉(zhuǎn)座子相關(guān)序列，其中人類基因組中40％的序列與轉(zhuǎn)座子序列相關(guān)，可見(jiàn)轉(zhuǎn)座子在人類進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用［4］。1997年，Zoltan Ivics等［5］對(duì)鮭魚來(lái)源的Tc1樣轉(zhuǎn)座子序列類比分析，并利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行重構(gòu)，建立了一種能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)座的DNA轉(zhuǎn)座子，命名為“睡美人”（Sleeping Beauty，SB）。SB轉(zhuǎn)座子屬于Tc1/mariner家族成員［6］，作為一種DNA轉(zhuǎn)座子，采用“剪切-黏貼”（cut and paste）的轉(zhuǎn)座模式。轉(zhuǎn)座反應(yīng)的發(fā)生需要轉(zhuǎn)座序列（能夠被轉(zhuǎn)座酶所識(shí)別的一段反向末端重復(fù)序列（IR））和轉(zhuǎn)座酶同時(shí)存在［7］。隨后的研究發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)座系統(tǒng)在斑馬魚、大小鼠等體內(nèi)也都表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)座活性［6，9］。轉(zhuǎn)座子序列在轉(zhuǎn)座酶存在情況下，能夠發(fā)生轉(zhuǎn)座，去除轉(zhuǎn)座酶時(shí)，轉(zhuǎn)座子序列穩(wěn)定存在［8］，利用這一特性，將轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座子序列分離，建立包含轉(zhuǎn)座子載體和轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體的二元轉(zhuǎn)座系統(tǒng)［10］，二者分離提高了轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的安全性，利用轉(zhuǎn)座子序列可以攜帶一段外源DNA序列進(jìn)入宿主基因組，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、基因突變和基因治療等方面［12-15］。為將SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)應(yīng)用于小鼠體內(nèi)篩選突變基因，建立基因修飾小鼠模型，并使得突變基因能夠在種系中穩(wěn)定遺傳，本研究通過(guò)克隆小鼠精子特異性的Prm1啟動(dòng)子，構(gòu)建能夠在精子中特異性表達(dá)SB轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座載體，利用顯微注射的方式建立精子特異性表達(dá)SB轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因小鼠。該研究將為SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)應(yīng)用于小鼠的基因工程功能分析提供重要的工具小鼠資源。

1 材料和方法

1.1 Prm1啟動(dòng)子的克隆

利 用 引 物：Prm1-S：5’-TACGCGTGTGA GGTCCCACTCC-3’和Prm1-AS：5’-TGCTAGCT

GGCTTGGCCGGGAG-3’（上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，中國(guó)），以小鼠基因組DNA為模板，擴(kuò)增片段大小為801 bp的精子特異性啟動(dòng)子，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行 TA克隆，測(cè)序正確后，用 Mlu I （Takara公司）和Nhe I（Takara公司）酶切目的片段，并連接到經(jīng)這兩個(gè)酶切的pCDNA3.1（+）的載體上完成對(duì) CMV啟動(dòng)子的替換，即完成 Prm1-expression載體構(gòu)建。

1.2 SB轉(zhuǎn)座酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因小鼠制作

利用Nhe I和Xho I從質(zhì)粒pCDNA3.1（+）-SBase［10］中回收SB轉(zhuǎn)座酶基因片段（1022 bp），將目的基因連入含有 Prm1啟動(dòng)子的載體（Prm1-expression）中完成Prm1-SBase表達(dá)載體的構(gòu)建。利用Mlu I/Nhe I，Mlu I/Xho I分別對(duì)構(gòu)建的 Prm1-SBase質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。然后將酶切驗(yàn)證正確的Prm1-SBase載體經(jīng)Pvu I（Takara公司）線性化，Sephedex G50柱純化，調(diào)整濃度至5 ng/μL，用于顯微注射。將純化好的 DNA片段注射到 SPF級(jí)C57BL/6J小鼠的受精卵中（小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK（京）2012-001】），用ICR小鼠作為假孕受體小鼠（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK（京）2012-001】），制備轉(zhuǎn)基因小鼠（TE2000U纖維注射儀）。實(shí)驗(yàn)在本研究所衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成【SYXK （京）2013-002】，實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物操作程序已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物使用與管理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為ILAS-GC-2012-001。

1.3 SB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型鑒定

首建鼠在出生7～14 d時(shí)，用剪腳趾標(biāo)記法標(biāo)記，收集剪下的組織，堿裂解法提取基因組DNA［11］，PCR法對(duì)首建鼠進(jìn)行篩選。PCR上游引物為SB-S1：5’-TCCCAGAACAACAGCAAAG-3’，下游引物為 SB-AS1：5’-CATCAGACCAGAGGAC ATTTC-3’（上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，中國(guó)）。PCR反應(yīng)體系20μL（PCR反應(yīng)相關(guān)試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司，中國(guó)）。反應(yīng)條件：95℃5 min；（95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min；4℃保溫。擴(kuò)增片段大小為224 bp。

1.4 western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)座酶在小鼠睪丸中的表達(dá)

頸椎脫臼法犧牲小鼠，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠的F1代和非轉(zhuǎn)基因 （non-transgenic，NTG）對(duì)照小鼠睪丸的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取20μg蛋白經(jīng)高溫變性后，進(jìn)行12％的SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至 NC膜上（Millipore，美國(guó)），用含有5％脫脂奶粉的 TBST（20 mmol/L Tris，0.05％ Tween，pH 7.6）封閉NC膜，選擇一抗為抗SBase的單克隆抗體（1：1000稀釋，MAB2798，R＆D，美國(guó)），二抗為HRP-偶聯(lián)的羊抗鼠抗體（1∶10000稀釋，ZB-2305，康成生物，中國(guó)）；內(nèi)參選用HRP-偶聯(lián)的βactin單克隆抗體（1∶10000稀釋，KC-5A08，中杉金橋，中國(guó)），通過(guò)HRP在暗室進(jìn)行顯色。用Image J分析軟件分析western blot條帶灰度，確定蛋白的表達(dá)量。

1.5 轉(zhuǎn)座酶在睪丸中的組織染色觀察

取2月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩陰性小鼠的睪丸，固定液中固定23 h后，經(jīng)過(guò)脫水、石蠟包埋、組織切片。其中一組用于HE染色［12］。另一組進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，經(jīng)過(guò)異丙醇以及梯度乙醇脫水，枸櫞酸納抗原熱修復(fù)，冷卻至室溫后用3％ H2O2去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清封閉，滴加一抗（1：100稀釋，MAB2798，R＆D，美國(guó)），濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜；PBS洗3次，每次5 min，加入羊抗鼠二抗（具體用法詳見(jiàn)二步法免疫組化試劑盒，PV-9002），PBS洗3次，每次5 min，然后進(jìn)行DAB顯色，終止反應(yīng)，梯度乙醇脫水、異丙醇透明、封片，掃描病理切片。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)SB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及基因型鑒定

利用引物Prm1-S和Prm1-AS擴(kuò)增的Prm1啟動(dòng)子片段大小為 801 bp，將構(gòu)建完成的 Prm1-expression與從質(zhì)粒pCDNA3.1（+）-SBase中回收的SBase片段，大小為1022 bp連接，完成 Prm1-SBase的載體構(gòu)建，利用Mlu I/Nhe I，Mlu I/Xho I分別對(duì)構(gòu)建的Prm1-SBase質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖1a）。Prm1-SBase結(jié)構(gòu)示意圖（圖1b）。

將線性化的 Prm1-SBase（6498 bp）片段（圖1c），顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵雄性核中，提取出生小鼠的基因組DNA，PCR檢測(cè)SB轉(zhuǎn)座酶基因，大小為224 bp片段，獲得含有目的基因的首建鼠，共獲得5只陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠，其中#1、#4、#9能夠穩(wěn)定傳代，#5、#12不傳代。基因型鑒定結(jié)果（圖1d）。

2.2 SB轉(zhuǎn)座酶在小鼠睪丸中顯著高表達(dá)

圖1 SB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因小鼠的制備Note：M：DNA molecular weightmarker DL15000；a，Lane 1：Prm1 promoter sequence was coloned from mouse genomic DNA using primer Prm1-S and Prm1-AS（801 bp）；Lane 2：DNA fragment recovered from pCDNA 3.1（+）which digested with restriction endonuclease Mlu I and Xho I （4671 bp）；Lane 3：SBase gene fragment recovered from pCDNA3.1（+）-SBase using Nhe Iand Xho I（1022 bp）；Lane 4：Prm1-SBase plasmid was digested using Mlu Iand Xho I（4671 bp，985 bp，842 bp）；Lane 5：Prm1-SBase plasmid was digested with M lu Iand Nhe I.b，Schematic of Prm1-SBase plasmid.c，The linearized SBase expression plasmid；Prm1-SBase plasmid was linearized using Pvu Iand prepared formicroinjection.d，Transgenic mice produced from pronucleimicroinjection.Lane 4，7，8，12，15 are transgenic positivemouse representing the#1，#4，#5，#9，# 12；Lane 5，6，9，10，11，13，14，16，17，18 are negative.Fig.1 Themanufacture of SBase transgenic mouse

圖2 SB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因小鼠的睪丸中WB分析

提取傳代的3個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠的F1代雄性睪丸總蛋白，WB分析表達(dá)量，結(jié)果表明3個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠品有2只小鼠有明顯的高表達(dá)，其中首建鼠 #1 （F1）的SB轉(zhuǎn)座酶表達(dá)量最高（圖2a）。WB的灰度掃描結(jié)果（圖2b）。

2.3 SB轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸組織學(xué)觀察（彩插6）

基于前面的WB結(jié)果，發(fā)現(xiàn)F1和F4轉(zhuǎn)基因小鼠SBase表達(dá)量相對(duì)較高，為進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)座酶在小鼠睪丸組織中具體表達(dá)細(xì)胞類型，對(duì)其進(jìn)行組織學(xué)觀察，圖3中的a，c，e為HE染色，b，d，f為免疫組織化學(xué)染色，圖3a和3b是野生對(duì)照小鼠，圖3c和3d是F1轉(zhuǎn)基因鼠，圖3e和3f是F4轉(zhuǎn)基因鼠。與對(duì)野生對(duì)照組a比較，轉(zhuǎn)基因小鼠睪丸組織中細(xì)胞在排列的層次上有所減少，其中F1表現(xiàn)最為顯著，這可能與轉(zhuǎn)座酶表達(dá)有一定關(guān)系。圖3d和3f顯示，SB轉(zhuǎn)座酶在精子形成的各個(gè)時(shí)期都有表達(dá)，但在成熟的精子細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量最高。同時(shí)兩個(gè)首建轉(zhuǎn)基因小鼠比較，F(xiàn)1的表達(dá)更加集中于成熟期的精子細(xì)胞，且表達(dá)量較高。

3 討論

用于基因修飾動(dòng)物模型的制備手段，既包括傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因、基因敲除、基因敲入，也包含近年來(lái)出現(xiàn)的基因修飾手段，如辛酯核酶基因敲除、TALEN技術(shù)以及CRISPR/Cas系統(tǒng)［13］，使得基因打靶可以不經(jīng)過(guò)ES細(xì)胞的篩選階段，直接通過(guò)原核注射的方式獲得基因修飾動(dòng)物模型。但這些技術(shù)也存在一些缺陷，只能針對(duì)特定的已知基因進(jìn)行操作，并且在進(jìn)行大規(guī)模操作時(shí)只能一個(gè)一個(gè)基因單獨(dú)設(shè)計(jì)，難以實(shí)現(xiàn)高通量制作基因工程動(dòng)物模型。而轉(zhuǎn)座子是一種隨機(jī)插入的方式，能夠大規(guī)模、高效率的建立基因修飾動(dòng)物模型并能篩選獲得一些未知基因，進(jìn)行基因功能研究。轉(zhuǎn)座子技術(shù)對(duì)于基因功能研究仍然具有非常重要意義。

Zoltan Ivics等［5］通過(guò)對(duì)鮭魚來(lái)源的轉(zhuǎn)座子家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)了一種新的Tc1樣轉(zhuǎn)座子功能結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域在1～1.5千萬(wàn)年前活躍過(guò)（表現(xiàn)出轉(zhuǎn)座活性），利用分子生物學(xué)手段對(duì)SB原始轉(zhuǎn)座子序列進(jìn)行點(diǎn)突變篩選，獲得了有活性的轉(zhuǎn)座子。這次的轉(zhuǎn)座活性是在沉睡后的又一次蘇醒，有失而復(fù)得之意，遂隨命名為“Sleeping Beauty（睡美人）”，簡(jiǎn)稱SB。SB是一種Tc1/mariner樣轉(zhuǎn)座子，來(lái)源于鮭魚（salmanoid）基因組，能夠在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)座。相對(duì)于其他轉(zhuǎn)座子，SB具有明顯的鄰近位點(diǎn)轉(zhuǎn)座偏好性。近年來(lái)隨著對(duì)SB轉(zhuǎn)座酶的不斷優(yōu)化，使得SB轉(zhuǎn)座系統(tǒng)得到不斷優(yōu)化，如SB100×［14］。此外，SB在基因組中的轉(zhuǎn)座反應(yīng)表現(xiàn)出更大的隨機(jī)性，不像PB轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活動(dòng)多集中在轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)部和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域［15-16］；而且相對(duì)于PB轉(zhuǎn)座子，SB轉(zhuǎn)座子末端重復(fù)序列的增強(qiáng)子或啟動(dòng)子活性基本可以忽略［17-18］；另外，在哺乳動(dòng)物基因組內(nèi)不存在SB轉(zhuǎn)座子相關(guān)序列，從而排除潛在的交叉轉(zhuǎn)座現(xiàn)象，這一現(xiàn)象在PB中明顯存在［19］。利用SB轉(zhuǎn)座酶的這些優(yōu)勢(shì)可以獲得多種基因工程小鼠，從而達(dá)到研究目的。

雖然SB轉(zhuǎn)座子在小鼠基因功能分析研究中應(yīng)用前景廣闊，但是由于目前國(guó)內(nèi)缺少有效的表達(dá)SB轉(zhuǎn)座酶的小鼠資源，嚴(yán)重限制了SB轉(zhuǎn)座子在小鼠基因功能研究中的應(yīng)用。通過(guò)運(yùn)用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和WB、免疫組化表型分析，本研究成功建立了一種在睪丸組織中高表達(dá)SB轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，由于本研究運(yùn)用了精子特異性的Prm1啟動(dòng)子，因此集中研究了睪丸組織中SB轉(zhuǎn)座酶的表達(dá)狀況，結(jié)果為SB在小鼠中的應(yīng)用提供轉(zhuǎn)座酶工具小鼠資源，為將其應(yīng)用于大規(guī)模基因修飾動(dòng)物模型的建立提供新方法。建立的轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)基因小鼠，不僅需要在小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)座，捕獲內(nèi)源基因，更重要的是能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)座位點(diǎn)的穩(wěn)定遺傳，這有待后續(xù)的繼續(xù)研究。

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Establishment of sperm specific Sleeping Beauty transposase-expressing transgenic mouse

LU Ying-dong，ZHANG Xu，MA Jing，ZHANG Lian-feng，MA Yuan-wu
（Key Labortaory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health；Institute of Laboratory Animal Science；
Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China）

Objective To establish the sperm specific Sleeping Beauty（SB）transposase-expression transgenic mouse for the study of the genetic modification mediated by transposon system in mouse.M ethods Prm1 promoter was cloned from mouse genomic DNA to drive the expression of SB transposase.The transgenic mice were generated by microinjection.The gene type of transgenic line was identified by PCR.The expressing level in testis was determined by western blot and immunohistochemistry（IHC）staining.Results Five lines of transposase transgenicmice were obtained bymicroinjection and three can be germline.Onemouse line with higher expression level of transposase in the testis was obtained.Conclusion One transgenic mouse model with Sleeping Beauty transposase-expression was successfully established.Thismodel will greatly contribute to the research of genetic modificationmediated by transposon inmouse

DNA transposon；Sleeping Beauty；Transposase

馬元武。E-mail：mayuanwu@gmail.com。

R332

A

1671-7856（2014）03-0034-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.008

協(xié)和青年基金（2012J25）；國(guó)家重大科技項(xiàng)目（2012BA139B02）。

路迎冬（1988-），女，碩士生，研究方向：比較醫(yī)學(xué)。E-mail：luyd@cnilas.org。

2013-10-08

研究報(bào)告