俞浩，張孝林，毛斌斌，路方方

（安徽科技學(xué)院 食品藥品學(xué)院，安徽 蚌埠233100）

牯嶺勾兒茶（Berchemia kulingensis Schneid）為鼠李科勾兒茶屬植物，分布于安徽、江蘇、浙江等省，生于山谷灌叢、林緣或林中。自古以來，安徽滁州一帶百姓采其葉芽炒制加工為茶，習(xí)稱“藤茶”，長期飲用具有保肝養(yǎng)顏、降壓降脂等功效。我國勾兒茶屬植物有18種，6變種，主要集中于西南、華南、中南及華東地區(qū)，本屬大部分植物的根、莖或葉均可藥用，具有祛風(fēng)利濕、活血止痛、止咳祛痰功效，主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、氣管炎、肺結(jié)核、黃疸、癰腫瘡毒、跌打損傷等癥?；瘜W(xué)成分及藥理作用研究表明，勾兒茶屬植物中含有黃酮類、木脂素類、苷類、黃酮和多糖等成分，從該屬植物中分離得到二聚體化合物具有保肝、抑菌、止咳平喘、抗組胺、抑酶等多種生物活性[1]。植物多糖具有抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖血脂、抗病毒等多種藥理活性，且毒副作用低，因此，有關(guān)植物多糖的研究和開發(fā)應(yīng)用較為廣泛[2]。但當(dāng)前有關(guān)牯嶺勾兒茶及其成分生物活性的研究尚未見文獻(xiàn)報道。本研究以自然衰老小鼠為研究對象，觀察牯嶺勾兒茶多糖對其免疫功能及抗氧化能力的影響，以期為牯嶺勾兒茶資源的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種小鼠（體質(zhì)量 42±2g） 雌雄各半，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號為：SCXK(皖)2007-001，實驗室飼養(yǎng)至19月齡供試驗用；牯嶺勾兒茶多糖 安徽科技學(xué)院中藥及藥物制劑實驗室制備（水提醇沉法制備，sevage法脫蛋白，硫酸-苯酚顯色法測定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 78.32%），將多糖水解、乙?；螅瑲赓|(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果顯示，牯嶺勾兒茶多糖主要含D-半乳糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖組成，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為36.4%、16.3%、25.6%、14.7%；玉屏風(fēng)顆粒 廣東環(huán)球制藥有限公司，批號130316；中華墨水 上海精細(xì)文化用品有限公司，批號：120301，臨用時用生理鹽水稀釋 5倍；IgG、IgM、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽還原酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒 均購自南京建成生物工程研究所。

FA2104B電子分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TG16-WS臺式高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀 賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠炭粒廓清功能及免疫器官指數(shù)的影響 取小鼠50 只，雌雄各半，隨機(jī)分為牯嶺勾兒茶多糖高、中、低劑量組（劑量分別為 40、20、10mg/kg，給藥時用生理鹽水配制至所需濃度），玉屏風(fēng)顆粒組（劑量為5.0g/kg）和正常對照組。灌胃給藥，給藥容積為0.2mL/10g體重，每日1次，連續(xù)7d，正常對照組給等容積的生理鹽水。末次給藥后30min，小鼠稱重，然后經(jīng)尾靜脈注射中華墨水0.1mL/10g體重，分別于注射后2、10min小鼠眼眶后靜脈叢采血20μL，立即加入2mL 0.1% Na2CO3溶液中，采用分光光度計在680nm 處測定OD值。另取未注射墨汁正常小鼠血20μL加入2mL 0.1% Na2CO3溶液作空白對照。處死動物，摘取肝臟、脾臟和胸腺，稱重。計算廓清指數(shù)K 值和吞噬指數(shù)α，K=(logA1-logA2)/(t2-t1)，其中A1、A2分別代表采血樣測得的吸光度，t2、t1分別代表兩次采血的時間間隔；α= K1/3×體重/(肝重+脾重)。計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。胸腺指數(shù)（mg/g）=胸腺重量/小鼠體重，脾臟指數(shù)（mg/g）=脾臟重量/小鼠體重[3-4]。

1.2.2 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清免疫球蛋白水平的影響 分組及給藥同“1.2.1”。末次給藥后 30min，小鼠稱重，摘眼球取血，離心分離血清，備用[5]。取血清，按試劑盒說明書操作方法，ELISA法測定血清中IgG、IgM含量。

1.2.3 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清及肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

分組及給藥同“1.2.1”。末次給藥后30min，摘眼球取血，3600r/min離心分離血清，冰箱保存?zhèn)溆?。頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟，生理鹽水洗凈，濾紙吸盡水分，剪取部分肝臟，電子天平稱重后置玻璃勻漿器中，按質(zhì)量體積比 1:9 加生理鹽水勻漿，勻漿液 3600r/min 離心 15min，取上清，待測[6-8]。按試劑盒說明書操作方法測定小鼠血清和肝臟中SOD、GSH-Px活性及MDA含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠炭粒廓清功能的影響

碳粒廓清指數(shù)是反映機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)，隨著年齡的增加，巨噬細(xì)胞的吞噬功能降低，碳粒廓清功能下降。本實驗結(jié)果表明，牯嶺勾兒茶多糖高劑量組小鼠碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)顯著提高，與正常對照組比較具有極顯著差異（p＜0.01），說明牯嶺勾兒茶多糖能夠提高老齡小鼠的非特異性免疫功能。結(jié)果見表1。

表1 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠炭粒廓清功能的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on carbon clearance function in aged mice(±s，n=10)

表1 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠炭粒廓清功能的影響(±s，n=10)Table 1 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on carbon clearance function in aged mice(±s，n=10)

注：與正常對照組比較*p＜0.05，**p＜0.01。表2-表5同。

組別 劑量（g/kg） 廓清指數(shù)（K）×102 吞噬指數(shù)（α）正常對照組 — 2.97±0.52 6.17±0.37玉屏風(fēng)顆粒組 5.0 3.77±0.63** 6.69±0.36**牯嶺勾兒茶多糖高劑量組 0.04 3.85±0.58** 6.74±0.34**牯嶺勾兒茶多糖中劑量組 0.02 3.50±0.82 6.51±0.49牯嶺勾兒茶多糖低劑量組 0.01 3.34±0.71 6.41±0.47

2.2 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠免疫器官指數(shù)的影響

隨著年齡的增長，免疫器官老化、萎縮，機(jī)體的免疫功能逐漸減弱。與正常對照組比較，牯嶺勾兒茶多糖高、中劑量組小鼠脾臟指數(shù)顯著增加，差異具有顯著性意義（p＜0.05或p＜0.01）；與正常對照組比較，牯嶺勾兒茶多糖高、中、低劑量組小鼠胸腺指數(shù)亦顯著增加，差異具有顯著性意義（p＜0.05或p＜0.01）。結(jié)果表明牯嶺勾兒茶多糖能抑制衰老引起的脾臟和胸腺的萎縮，且其作用呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果見表2。

表2 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠免疫器官指數(shù)的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on immune organ index in aged mice(±s，n=10)

表2 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠免疫器官指數(shù)的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on immune organ index in aged mice(±s，n=10)

組別 劑量/（g/kg） 脾臟指數(shù)（mg/g體重） 胸腺指數(shù)（mg/g體重）正常對照組 — 5.09±0.84 3.26±0.70玉屏風(fēng)顆粒組 5.0 6.53±0.98** 4.67±1.26**牯嶺勾兒茶多糖高劑量組 0.04 6.34±0.94** 4.52±1.10**牯嶺勾兒茶多糖中劑量組 0.02 6.19±1.14* 4.70±0.88**牯嶺勾兒茶多糖低劑量組 0.01 5.13±1.09 4.19±0.93*

2.3 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清免疫球蛋白水平的影響

衰老小鼠血清中免疫球蛋白水平下降。與正常對照組比較，牯嶺勾兒茶多糖高劑量組小鼠血清 IgG、IgM水平顯著升高，差異具有顯著性意義（p＜0.01），說明牯嶺勾兒茶多糖能提高老齡小鼠血清免疫球蛋白水平。牯嶺勾兒茶多糖中、低劑量組小鼠血清 IgG、IgM 水平有升高趨勢，但與正常對照組比較無顯著性差異（p＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清免疫球蛋白水平的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on serum immune globulin in aged mice(±s，n=10)

表3 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清免疫球蛋白水平的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on serum immune globulin in aged mice(±s，n=10)

組別 劑量（g/kg） IgG（mg/L） IgM（mg/L）正常對照組 — 249.61±22.16 78.6±24.83

玉屏風(fēng)顆粒組 5.0 298.31±32.24** 121.11±38.61牯嶺勾兒茶多糖高劑量組 0.04 286.46±29.74** 113.27±21.69**牯嶺勾兒茶多糖中劑量組 0.02 270.26±42.59 94.27±33.48牯嶺勾兒茶多糖低劑量組 0.01 266.37±23.34 89.63±31.27

2.4 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

隨著機(jī)體的衰老，體內(nèi)抗氧化酶活性下降，過氧化產(chǎn)物生成增多，自由基生成和消除失衡，氧自由基的大量積聚，造成組織細(xì)胞的過氧化損傷。牯嶺勾兒茶多糖高劑量組小鼠血清SOD活性顯著升高，與正常對照組比較具有顯著性差異（p＜0.05）；牯嶺勾兒茶多糖高、中劑量組小鼠血清GSH-Px活性顯著升高，與正常對照組比較具有顯著性差異（p＜0.05 或p＜0.01）；牯嶺勾兒茶多糖高、中劑量組小鼠血清MDA含量顯著下降，與正常對照組比較具有極顯著性差異（p＜0.01）。說明牯嶺勾兒茶多糖具有抗過氧化損傷作用。結(jié)果見表4。

表4 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in serum in aged mice(±s，n=10)

表4 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in serum in aged mice(±s，n=10)

組別 劑量/（g/kg） SOD/（nU/mL） GSH-Px/（nU/mL） MDA/（nmol/mL）正常對照組 — 194.71±27.82 26.09±5.07 10.17±2.11玉屏風(fēng)顆粒組 5.0 247.50±35.77** 36.00±5.42** 7.26±2.99**牯嶺勾兒茶多糖高劑量組 0.04 239.65±41.90* 35.38±5.31** 6.34±1.73**牯嶺勾兒茶多糖中劑量組 0.02 227.60±42.98 31.43±4.06* 7.26±1.44**牯嶺勾兒茶多糖低劑量組 0.01 207.15±46.85 29.68±6.92 8.33±2.30

2.5 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

與正常對照組比較，牯嶺勾兒茶多糖高、中劑量組小鼠肝臟SOD活性顯著升高，差異具有顯著性意義（p＜0.01或p＜0.05）；牯嶺勾兒茶多糖高劑量組小鼠肝臟GSH-Px活性顯著升高，與正常對照組比較具有顯著性差異（p＜0.05）；牯嶺勾兒茶多糖高劑量組小鼠血清MDA含量顯著下降，與正常對照組比較具有顯著性差異（p＜0.05）。說明牯嶺勾兒茶多糖具有抗肝臟脂質(zhì)過氧化損傷作用。結(jié)果見表5。

表5 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響( ±s，n=10)Table 5 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in liver in aged mice(±s，n=10)

表5 牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響( ±s，n=10)Table 5 Effect of Berchemia kulingensis polysaccharide on activities of SOD,GSH-Px and content of MDA in liver in aged mice(±s，n=10)

組別 劑量/（g/kg） SOD（nu /mg pro） GSH-Px（U /mg pro） MDA（nmol /mg pro）正常對照組 — 108.91±26.03 31.20±8.67 21.82±4.68玉屏風(fēng)顆粒組 5.0 141.81±20.97** 39.75±6.30** 17.27±2.61*牯嶺勾兒茶多糖高劑量組 0.04 138.82±16.84** 38.58±4.69* 17.36±2.88*牯嶺勾兒茶多糖中劑量組 0.02 131.89±14.78* 34.86±5.58 18.85±3.78

牯嶺勾兒茶多糖低劑量組 0.01 118.41±31.07 33.13±4.50 19.89±5.53

3 結(jié)論

衰老機(jī)制復(fù)雜，其中免疫學(xué)理論和自由基理論在眾多理論中占有重要地位[9-10]。本研究從免疫學(xué)和自由基的角度探討牯嶺勾兒茶多糖對老齡小鼠的免疫功能和抗氧化作用的影響。

玉屏風(fēng)散為中醫(yī)臨床常用方劑，可斂汗固表，被稱為中藥免疫調(diào)節(jié)劑。研究表明，玉屏風(fēng)散能顯著提高正常小鼠的胸腺和脾臟指數(shù), 促進(jìn)溶血素生成和溶血空斑的形成, 促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，升高小鼠血清和肝組織中SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，具有顯著免疫促進(jìn)和抗氧化作用[11-12]。本實驗結(jié)果亦證實，玉屏風(fēng)散具有顯著的提高免疫功能和抗氧化作用。因此，本研究選用玉屏風(fēng)散作為陽性對照藥物。

衰老的免疫學(xué)理論認(rèn)為，免疫系統(tǒng)參與衰老過程，隨著年齡的增長，免疫器官老化、萎縮，免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子發(fā)生變化，機(jī)體的免疫功能逐漸減弱。胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是衡量機(jī)體非特異性功能的重要指標(biāo)。胸腺為中樞免疫器官，其能誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞分化成熟為功能不同的T細(xì)胞亞群，是T細(xì)胞發(fā)育、分化和成熟的場所，成熟的T細(xì)胞經(jīng)血液或淋巴液轉(zhuǎn)移至外周免疫器官，接受抗原刺激，產(chǎn)生免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫效應(yīng)；同時胸腺還能誘導(dǎo)胸腺細(xì)胞對自身抗原形成免疫耐受[13]。脾臟為外周免疫器官，是人體最大的免疫器官，是具有免疫活性的T、B 細(xì)胞移居和接受抗原刺激后產(chǎn)生免疫應(yīng)答的重要場所[14]。IgG主要由脾臟、淋巴結(jié)和骨髓中的漿細(xì)胞合成，是再次體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的全身性體液免疫反應(yīng)的效應(yīng)因子，在血液中含量最高，在機(jī)體防御中主要發(fā)揮發(fā)揮抗菌、抗病毒和中和毒素等作用，其含量在一定程度上反映了對機(jī)體體液免疫的調(diào)節(jié)功能。IgM是最早出現(xiàn)的免疫球蛋白，也是一級免疫應(yīng)答中所產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，也產(chǎn)生于二級免疫應(yīng)答，其生成數(shù)量較少，但在激活補(bǔ)體、調(diào)理作用、中和病毒和凝集作用等方面比IgG更有效[15]。本實驗研究結(jié)果表明，牯嶺勾兒茶多糖能明顯提高老齡小鼠碳粒廓清指數(shù)和吞噬指數(shù)，增加胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，提高血清中IgG和IgM水平，說明牯嶺勾兒茶多糖能夠增強(qiáng)老齡小鼠的免疫功能。

衰老的自由基理論認(rèn)為，隨著年齡的增加，機(jī)體的抗氧化酶活性下降，過氧化產(chǎn)物增多，自由基生成和消除失衡，氧自由基的大量積聚使細(xì)胞膜上的脂肪酸生成過氧化物，進(jìn)一步生成脂褐素，造成核酸、蛋白質(zhì)損傷，產(chǎn)生過氧化損傷。SOD和GSH-Px是機(jī)體的主要抗氧化酶，其中SOD能催化氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O2，GSH-Px能迅速清除H2O2，兩者共同發(fā)揮作用使組織細(xì)胞免受過氧化損傷。MDA為生物膜不飽和脂肪酸-花生四烯酸的過氧化產(chǎn)物，是衡量體內(nèi)自由基代謝情況的重要指標(biāo)，能夠客觀反映體內(nèi)的自由基的水平[16]。本實驗研究結(jié)果顯示，牯嶺勾兒茶多糖能升高血清和肝臟中SOD、GSH-Px活性，降低血清和肝臟中MDA含量，說明牯嶺勾兒茶多糖能提高機(jī)體抗氧化能力和清除自由基能力，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)而延緩衰老的進(jìn)程。

[1]陳立,董俊興.勾兒茶屬植物化學(xué)成分及其生物活性研究進(jìn)展[J].中草藥, 2006,37(4):627-630.

[2]安曉娟,馮琳,宋紅平,等.植物多糖的結(jié)構(gòu)分析及藥理活性研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志,2012,47(6):1271-1275.

[3]俞浩,周金星,馬世堂,等.滁菊總黃酮對糖尿病大鼠血液流變學(xué)的影響[J].食品工業(yè)科技,2013,34(15):351-354.

[4]王思蘆,汪開毓,趙玲,等.雞樅菌多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響[J].中國藥理學(xué)通報.2013,29(1):59-63.

[5]熊奇凌,何勝旭,林軍,等.抗癆膠囊對免疫功能低下小鼠影響的實驗研究[J].中國中藥雜志,2013,38(5):740-742.

[6]孫偉,苗珍花,王亞玲,等.寧夏枸杞葉對自然衰老小鼠的抗疲勞作用[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2011,33(3):204-205.

[7]申佳佳,苑隆國,李電東,等.紅景天苷對自然衰老小鼠模型的抗衰老作用研究[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù),2012,7.(6):412-417.

[8]吳聰, 施用暉, 樂國偉.奧曲肽對高脂飼養(yǎng)小鼠血糖、血脂及抗氧化能力的影響[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2012,37(7):745-751.

[9]Tomoko Kaburagi,Toshihiko Yamano,Yoichi Fukushima,et al.Effect of Lactobacillus johnsonii La1 on immune function and serum albumin in aged and malnourished aged mice[J]. Nutrition, 2007,23(4): 342-350.

[10]Brink TC,Regenbrecht C,Demetrius L,et al. Activation of the immune response is a key feature of aging in mice[J].Biogerontology,2009,10(6):721-34.

[11]王妍，石學(xué)魁.玉屏風(fēng)散增強(qiáng)小鼠免疫功能的研究[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,31(3):46-47.

[12]王玉閣,周麗,王麗萍,等.玉屏風(fēng)散生物轉(zhuǎn)化液對正常小鼠抗氧化功能及免疫抑制小鼠T細(xì)胞亞群、IL-4 和IFN-γ的影響[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,30(5):513-515.

[13]Yan-Mei Tian,Gui-You Zhang,Yao-Ren Dai.Melatonin rejuvenates degenerated thymus and redresses peripheral immune functions in aged mice[J].Immunology Letters, 2003,88 (2 ):101-104.

[14]鐘振國,羅雪菲,黃金蘭,等.余甘子葉提取物對小鼠免疫功能的影響研究[J].中藥材,2013,36(3):441-444.

[15]胡錫琴,李婭琳,林飛,等.何首烏、制何首烏對大鼠免疫球蛋白影響的實驗研究[J].天津中醫(yī)藥,2009,26(2):139-141

[16]Bokov A,Chaudhuri A,Richardson A.The role of oxidative damage and stress in aging[J].Mech Aging Dev，2004,125( 10-11): 811-26.