李艷平

（吉林農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院,吉林四平 136000）

我國(guó)是世界上水產(chǎn)品產(chǎn)量最大的國(guó)家之一，淡水魚資源豐富，黑魚作為淡水魚，具有營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高等特點(diǎn)。但黑魚肉較粗，不是太好吃，將黑魚蛋白水解是解決黑魚肉粗，口感差的一種新的途徑。將黑魚蛋白酶解制備黑魚多肽，既提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，也有一定的功能特性。生物活性肽已被證實(shí)具有降膽固醇[1]、降血壓[2]、抑菌[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、促進(jìn)有益微量元素及營(yíng)養(yǎng)素吸收[7]等功效。本試驗(yàn)以黑魚肉蛋白為原料，進(jìn)行黑魚肉酶解工藝參數(shù)的最佳條件研究，一般認(rèn)為影響酶解效果的因素有7個(gè)：底物濃度、pH、溫度、時(shí)間、酶用量、抑制劑、激活劑。抑制劑、激活劑既影響酶解速度又會(huì)引入不確定的因素，出于成本及食品安全性的考慮，不對(duì)這兩個(gè)影響因素進(jìn)行討論。目前利用淡水魚酶解制備多肽研究的不少，但利用淡水魚中的黑魚為原料進(jìn)行酶解制備功能性食品的研究基本沒有，因此最佳的酶解工藝能促進(jìn)黑魚深加工的發(fā)展，提高經(jīng)濟(jì)效益。本課題主要研究黑魚蛋白酶解最佳工藝參數(shù)，為黑魚蛋白肽抗氧化特性驗(yàn)證提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑魚 四平地直市場(chǎng)鮮活黑魚；硫酸鋰、鎢酸鈉、鉬酸鈉、三氯乙酸 分析純；酪氨酸、酪蛋白 生化試劑；硫酸鋰AR、鎢酸鈉AR、鉬酸鈉AR、酪蛋白、酪氨酸、三氯乙酸AR、中性蛋白酶(ASI.398)、復(fù)合蛋白酶(Protamex)諾維信天津公司；木瓜蛋白酶(Papain)、堿性蛋白酶(Alcalase)北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；各酶水解參數(shù)見表1。

電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；722型可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；PHS-3C型數(shù)字酸度pH計(jì) 上海楚定分析儀器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器 武漢萊莫檢測(cè)設(shè)備有限公司；溫度計(jì) 天津市天馬儀器廠；恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市江南儀器廠；TDL一80一ZB型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

表1 各酶水解參數(shù)Table1 The hydrolysis parameter of several protease

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑魚前處理

將新鮮的黑魚洗凈，去頭、尾、內(nèi)臟后，分別取皮、背部、腹部、兩側(cè)紅肉和白肉，用搗碎機(jī)將其搗碎成均勻的糜狀，然后分別用保鮮袋包裝，放到冰箱冰凍備用[8]。

1.2.2 黑魚蛋白酶解工藝

參照Quaglia,G.B.等人[4]對(duì)沙丁魚的酶解方法并做部分修改。具體酶解過程如下：取冷凍的黑魚精肉切塊前解凍，然后破碎進(jìn)行脫脂處理，將魚肉與異丙醇1：1（V：V）在46℃循環(huán)浸提 1h，浸提后將樣品置于通風(fēng)處除去并揮發(fā)剩余的異丙醇，加水勻漿形成魚糜液，再按[E]/[S]=1%魚糜液的用量加入蛋白酶,蛋白酶在pH8，溫度50℃下攪拌水解至一定時(shí)間，將酶解液放到沸水浴中加熱使酶失去活性，冷卻，然后以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min。上清液即為黑魚酶解液。

1.2.3 酸溶性多肽含量的測(cè)定

采用TCA-SN 指數(shù)法，其定義為：在特定條件下三氯乙酸(TCA)水溶液中可溶性氮的物質(zhì)的量的分?jǐn)?shù)；常采用的是10%的三氯乙酸。TCA-SN指數(shù)反映了水解產(chǎn)物的溶解性能；同時(shí)，也表明了水解產(chǎn)物物質(zhì)的量的分布；在一定程度上是蛋白質(zhì)水解程度的一種表征。

式中，C：上清液中蛋白質(zhì)的濃度，mg/mL；

V：10%TCA的總體積，mL；

W：蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 由酸溶性多肽含量確定最佳用酶和最適酶解時(shí)間

不同蛋白酶有不同特異酶切位點(diǎn)，因而蛋白酶選擇是制備生物活性肽過程中一個(gè)重要環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)研究的目的是黑魚蛋白通過限制性酶解后，盡可能獲得肽類產(chǎn)物，而不是氨基酸，因此，肽提取率的高低成了評(píng)定水解效果的最主要標(biāo)準(zhǔn)。在以酸溶性多肽確定所選最佳酶試驗(yàn)中，所選用各種蛋白酶，都在各酶的理論的最適條件下反應(yīng)，酶解的溫度為各種酶的最適溫度，酶解的pH值為最適pH值，為保證各種酶對(duì)黑魚蛋白水解能力的可比性，加酶量均為[E]/[S]=1%，酶解時(shí)間5h，主要研究黑魚蛋白水解過程中，不同的蛋白酶水解液的肽提取率隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)。

1.2.5 堿性蛋白酶最佳作用條件研究方法

1.2.5.1 單因素對(duì)黑魚蛋白水解的影響

不同pH值對(duì)水解效果的影響：取黑魚魚糜3份，每份重40克，加水調(diào)料液使底物濃度[S]為1%(w/v)，調(diào)pH值為8、9、10時(shí)，按照[E]/[S]為1%的加酶量分別加堿性蛋白酶，混勻，在其最適溫度下水解4h，沸水浴滅酶活。測(cè)多肽含量。

反應(yīng)溫度對(duì)水解效果的影響：取黑魚魚糜3份，每份重40克，加水調(diào)料液使底物濃度[S]為1%(w/v)，pH自然，按照[E]/[S]為1%的加酶量分別加堿性蛋白酶，混勻，在溫度分別為45、50、55℃下水解4h，沸水浴滅酶活。測(cè)多肽含量。

加酶量對(duì)水解效果的影響：取黑魚魚糜3份，每份重40克，加水調(diào)料液使底物濃度[S]為1%(w/v)，調(diào)pH9。分別加入1.5%、1.0%、2.0%的蛋白酶，最適溫度下水解4h后，測(cè)多肽含量。

底物濃度對(duì)堿性蛋白酶酶解的影響：取黑魚魚糜3份，每份重40克，加水調(diào)料液使底物濃度[S]分別為1.0%、1.5%、2.0%，調(diào)pH9。按照[E]/[S]為1%的加酶量分別加堿性蛋白酶，混勻，其最適溫度下水解4h。測(cè)多肽含量。

1.2.5.2 采用正交試驗(yàn)研究了水解溫度、加酶量、料液比、起始pH對(duì)多肽含量的影響

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，最適水解時(shí)間為4h，以反應(yīng)溫度、加酶量、底物濃度與起始pH為試驗(yàn)因子，以多肽含量指標(biāo)，進(jìn)行了L9( 34)正交試驗(yàn)，因素水平如表2。

表2 正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)表Table 2 L9 ( 34 )Factor and Level

2 結(jié)果與討論

2.1 由酸溶性多肽含量確定的最佳用酶和最適水解時(shí)間

在各酶的最適宜條件下測(cè)得的多肽含量如圖1所示.

圖1 不同蛋白酶水解黑魚的多肽含量曲線Fig.1 Curve of TCA-SN in process of different proteinase hydrolysis Snakehead Protein

由圖1可知，堿性蛋白酶酶解的多肽含量最高，5h時(shí)的含量為28.56%；中性酶酶解多肽含量最低，從圖中可看出，前4h的多肽含量增幅較快，4h后變化緩慢。為了節(jié)約時(shí)間，所以水解最佳酶解時(shí)間確定為 4h。多肽含量除了與蛋白酶種類不同外，它也受酶解的溫度和底物濃度等的影響。

2.2 單因素試驗(yàn)對(duì)堿性蛋白酶酶解影響

2.2.1 不同pH對(duì)堿性蛋白酶酶解反應(yīng)的影響

堿性蛋白酶有其最適的pH，pH過大或過小，底物和酶分子的帶電狀態(tài)就會(huì)改變，就會(huì)導(dǎo)致酶的活力降低[9]，不同pH在水解4h后對(duì)多肽含量的影響如圖2所示。

圖2 不同pH對(duì)酶解產(chǎn)物多肽含量的影響Fig. 2 Effect of different pH on DH in process of alkaline protease hydrolysis

由圖2可知，隨著起始pH的增加，多肽含量呈現(xiàn)由最初的增幅快到慢的趨勢(shì)。由于酶分子是一種特殊的蛋白質(zhì)分子，活性部位較多，酶的活性部位由結(jié)合點(diǎn)和催化位點(diǎn)組成，結(jié)合部位和催化部位對(duì)反應(yīng)體系的pH值變化敏感，解離狀態(tài)也隨pH值變化而變化，pH過高過低對(duì)酶解都有不利的影響。因此確定pH9時(shí)多肽含量最高為堿性蛋白酶最適pH。

2.2.2 不同溫度對(duì)酶解產(chǎn)物多肽含量的影響

每種蛋白酶有其各自的水解的最適水解溫度，但最適溫度也是隨著水解蛋白底物的性質(zhì)的改變而變化，并不是對(duì)于所有的蛋白底物其最適水解溫度都一樣。不同溫度對(duì)酶解產(chǎn)物多肽含量的影響如圖3所示。

圖3 不同溫度對(duì)多肽含量的影響Fig.3 Effect of different temperature on DH in process of alkaline protease hydrolysis

從圖3可看出，用堿性蛋白酶酶解黑魚時(shí)，酶解產(chǎn)物多肽含量開始也是隨著溫度的升高而增大，當(dāng)水解時(shí)間為4h時(shí)，水解溫度為50℃時(shí)的多肽含量最高，而水解溫度為55℃時(shí)，2h后多肽含量增大緩慢，溫度過高，酶解位點(diǎn)被隱藏，也影響酶的作用效果，溫度過高還會(huì)使底物蛋白發(fā)生變性。確定堿性蛋白酶水解的最適溫度為50℃。

2.2.3 不同加酶量對(duì)酶解產(chǎn)物多肽含量的影響

堿性蛋白酶在使用過程中依據(jù)應(yīng)用說明書有一個(gè)基本推薦用量，但是各種蛋白酶的合適量跟最適水解溫度一樣，也是隨著水解蛋白底物的性質(zhì)的改變而變化，一般情況下酶用量增加會(huì)提高酶解效率，而且酶用量稍微大些對(duì)于水解反應(yīng)本身是沒有不良效果，但是酶用量一旦大于最適濃度，效果不會(huì)太明顯，可能還會(huì)引起酶自溶增強(qiáng)[10]，酶用得多使用成本就高，因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)底物的情況來確定其合適的用量，即酶用量也存在一個(gè)所謂的“經(jīng)濟(jì)濃度”。因此，本試驗(yàn)的目的是研究堿性蛋白酶以黑魚蛋白為作用底物時(shí)的合適用量。試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同加酶量對(duì)多肽含量的影響Fig.4 Effect of different enzyme loading on the TCA-SN

由圖4可看出，多肽含量是隨著酶添加量的增加而增大，但當(dāng)酶添加量超過1.5%時(shí)，多肽含量上升緩慢，酶添加量為1.5%的多肽含量與酶添加量2%的多肽含量相差不多，由于酶價(jià)格高，因此從經(jīng)濟(jì)成本出發(fā)，選酶用量為1.5%的最合適。

2.2.4 不同底物濃度對(duì)酶解多肽含量的影響

不同蛋白酶其活性也受底物濃度的影響，堿性蛋白酶酶解體系也有其最合適的底物黑魚蛋白初始濃度，本試驗(yàn)就是測(cè)定在取得最高多肽利率的情況下，底物濃度的最適值。試驗(yàn)結(jié)果如圖5。

圖5 不同底物濃度對(duì)多肽含量的影響Fig. 5 Different effects of substrate on the impact of TCA-SN

由圖5可知，底物濃度為1.5%的多肽含量隨水解時(shí)間延長(zhǎng)增加速度快，底物濃度高于1.5%的當(dāng)達(dá)到一個(gè)最大值后增長(zhǎng)緩慢，原因是酶催化能力達(dá)到極限，魚溶液中不存在有活性游離的酶，所有活性酶都與底物結(jié)合，過高的底物濃度抑制水解反應(yīng)的順利進(jìn)行，也會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的處理過程中將浪費(fèi)更多的資源。濃度太低導(dǎo)致蛋白酶和作用底物兩者的碰撞機(jī)率太少，因此依據(jù)圖5，選擇底物濃度1.5%最為合適。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由于本試驗(yàn)的主要考核指標(biāo)是多肽含量，所以以多肽含量為指標(biāo)做正交試驗(yàn)。表3以多肽含量TCA-SN(%)為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果。

表3 最佳水解條件的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment

由表3可知，在水解時(shí)間為4h的前提下，以多肽含量為考核指標(biāo)，影響試驗(yàn)結(jié)果的主次因素為D→B→A→C，最優(yōu)組合為A1B2C3D2。即水解溫度50℃，加酶量1.5%，底物濃度2%，起始pH9。在此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明多肽含量為29.5%,高于正交試驗(yàn)所列出的任何一組，所以選用這個(gè)組合條件為最佳條件。

3 結(jié)論

本文主要研究了黑魚肉酶解的單因素試驗(yàn)，單因素試驗(yàn)表明用堿性蛋白酶酶解黑魚，酶解的條件是水解溫度50℃，加酶量1.5%，底物濃度1.5%，起始pH9，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)，對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果表明：堿性蛋白酶酶解黑魚最佳條件是底物濃度1.5%，起始pH9，溫度50℃，加酶量1.5%，在此條件下驗(yàn)證試驗(yàn)中用堿性蛋白酶酶解黑魚蛋白，酶解后的多肽含量為29.5%。

[1]Nagoya S, Futamura Y, Miwa K, et al. Identification of novel hypercholesterolemia peptidesderived from bovine milk betalactoglobulin [J].Biochem BiopHy .Res Com-mun,2001,281:11-17.

[2]Nagai T, Suzuki N, Nagashima T. Antioxidative activities and angiogenesis I-converting enzyme inhibitory activities of enzymatic hydrolysis’s from commercially available Karaoke species[J].Food Sci. Technol,2006,12:335-346.

[3]Hayes, A. Ross, R.P. Fitzgerald, G..F.Hill, et al. Casein-derived antimicrobial peptides generated by Lactobacillus acidophilus DPC6026 [J].Appl. Environ. Microbiology,2006, 72:2260-2264.

[4]Erdmann K. Grosser N. Schipporeit K et al.The ACE inhibitory dipeptide Met-Tyrdiminishes free radical formation in human endothelial cells via induction of hemi oxygenizes-I and ferreting[J].J.Nutr,2006,136:2148-2152.

[5]薛照輝,尉萬(wàn)聰,吳謀成.菜籽肽抑制腫瘤作用和對(duì)免疫功能的影響 [J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2007, 22(1): 73-75.

[6]Fiat A M, Migliore-Samour D, Jollès P, et al. Biologically active peptides from milk proteins with emphasis on two examples concerning antithrombotic and immunomodulating activities [J].Dairy Science, 1993, 76(1)： 301-310.

[7]Walker G. Cai F. Shen P. et al. Increased demineralization of tooth enamel by milk containing added casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate [J].J. Dairy Res.2006,73:74-78.

[8]林奕封，曾慶孝，朱志偉，等.利用內(nèi)源蛋白酶對(duì)蝦頭水解的研究[J].廣州食品工業(yè)科技.2003,02：5-7.

[9]Aktas N, Kilic B. Effect of microbial transglutaminase on thermal and electrophoretic properties of ground beef. Food Sci Technol,2005,38(8):815-819.

[10]Findlay C J,Parkin K L,Stanley D W.Differential scanning calorimetry can determine kinetics of thermal denaturation of beef muscle proteins.J Food Biochem,1986,10:1-4.