張智，于震，王振宇,2*，鄧心蕊，劉冉，張巧俏

（1 東北林業(yè)大學林學院， 哈爾濱150040；）

（2 哈爾濱工業(yè)大學食品科學與工程學院， 哈爾濱150090）

植物多酚具有多元酚結(jié)構(gòu)，又稱植物單寧，在蔬菜、水果谷物豆類等植物中廣泛分布，是植物體內(nèi)重要的次級代謝產(chǎn)物[1]。多酚具有多種生理功能，可以起到抗氧化、抗腫瘤、防治冠心病與中風等作用，且有明顯的護肝益腎功效[2]。落葉松為松科落葉松屬的落葉喬木，廣泛分布于我國東北、內(nèi)蒙古地區(qū)，資源豐富。研究表明，松科植物體內(nèi)含有天然活性較高的大量多酚物質(zhì)，其含量是蘋果的13倍以上[3]。松多酚具有較強的抗氧化性，在食品領域中可以作為天然的防腐劑與抗氧化劑，與人工合成的添加劑相比有明顯的優(yōu)勢[4]。因此，為最大限度發(fā)揮多酚物質(zhì)的特點，有必要對落葉松的多酚類物質(zhì)進行優(yōu)化。大孔樹脂吸附法工藝流程比較簡單，操作容易，安全高效，是較理想的純化方法[5]。本文采用大孔樹脂層析法純化落葉松多酚，并用響應面法優(yōu)化純化工藝，為落葉松多酚的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

落葉松樹皮 選自長白山地區(qū)，光照曬干后粉碎過40目篩，待用；大孔樹脂 AB-8、X-5、D101、NKA-9、D4020、S-8 天津海光試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

中草藥粉碎機 天津市泰斯特有限責任公司；722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司制造；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；Agilent 1260高效液相分析儀 美國安捷倫科技有限公司；層析柱（20mm×700mm）。

1.2 多酚溶液的制備

取一定質(zhì)量的落葉松樹皮粉末，按1:20的料液比加入濃度為50%的乙醇，于水溫為50℃的恒溫水浴鍋中靜置2.5h。浸提2次，抽濾，合并濾液，旋蒸濾液以除去多余的乙醇溶劑，用蒸餾水定容至100mL，根據(jù)GB/T 8313-2008測定溶液的多酚含量[6]。用蒸餾水稀釋至所需濃度，置于冰箱中，待用。

1.3 大孔樹脂的預處理

用95%乙醇浸泡樹脂24h，充分溶脹樹脂。換用蒸餾水清洗樹脂，直至加適量水于上清液中無渾濁為止。再用質(zhì)量分數(shù)為5%的稀鹽酸溶液浸泡12h，用蒸餾水洗至中性。最后用質(zhì)量分數(shù)為5%的氫氧化鈉溶液浸泡12h，用蒸餾水洗至中性，置于陰涼避光處，備用。

1.4 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解析

將2.0g用濾紙擦干的樹脂置于100mL錐形瓶中，加入2.5mg/mL的落葉松多酚粗提液50mL，置于搖床上震蕩10h，按下式計算吸附量。

其中，Q為吸附量（mg/g）；A為吸附率（%）；C0為起始濃度（mg/mL）；C1為平衡濃度（mg/mL）；V為多酚溶液的體積（mL）；M為樹脂質(zhì)量（g）。

靜態(tài)吸附結(jié)束后，抽濾，取1.5g充分吸收多酚的樹脂，用蒸餾水沖洗至表面無殘留溶液。再用濾紙擦干，置于100mL錐形瓶中，加入50%乙醇40mL，置于搖床上震蕩10h，按下式計算解析量與解析率。

式中，D為解析量（mg/g）；E為解析率（%）；C2為平衡濃度（mg/mL）；V’為解析液體積（mL）；M為樹脂質(zhì)量（g）。

1.5 大孔樹脂的動態(tài)吸附與解析

采用濕法裝柱方法，先在層析柱的底端預先加進一部分蒸餾水，然后在層析柱口沿玻璃棒緩慢注入樹脂至所需徑長比。排出層析柱內(nèi)的水至與樹脂高度相齊，緩慢加入一定濃度多酚提取液。吸附6h，用2倍柱體積的蒸餾水清洗柱子，去除可溶性雜質(zhì)。加入2倍柱體積的相應濃度乙醇洗柱，用500mL錐形瓶回收全部洗液，旋蒸，測定多酚濃度，計算回收率。參考李波等實驗方法[7]，于45℃烘干后復溶，再次測定多酚濃度，計算純度。

式中，R為回收率（%）；P為純度（%）；C’1為回收液的濃度（mg/mL）；V’1為回收液的體積（mL）；C’0為進樣液濃度（mg/mL）；V’0為進樣液體積（mL）；C’2為復溶后多酚溶液的濃度（mg/mL）；V’2為復溶后溶液的體積（mL）；M’為烘干后粗多酚的質(zhì)量（g）。

1.6 響應面優(yōu)化落葉松多酚的純化工藝

依據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選取上樣濃度、上樣體積與洗脫濃度 3個因素通過Design-expert8.05軟件利用Box-Benhnken中心組合方法設計三因素三水平的響應面優(yōu)化實驗，并據(jù)此建立數(shù)學回歸模型，做響應面分析。響應面優(yōu)化因素水平設計表如表1所示。

表1 相應面試驗因素與水平Table1 Factors and the levels of experiment of Response Surface

1.7 多酚純化液的高效液相分析

以優(yōu)化了的落葉松多酚純化條件為依據(jù)，富集樣液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至濃度為15.5mg/mL左右，在0.45μ m有機濾膜中過濾溶液2～3次，收集濾液備用。

高效液相色譜儀型號為Agilent 1260，選大連產(chǎn)型號為“依利特SinoChrom DS-BP”作為色譜柱。選擇歐陽樂等優(yōu)化的色譜條件[8]：流動相為甲醇-水（0.05%TFA），流速為1.0mL/min，波長為280nm，柱溫為30℃，進樣量為5μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂篩選結(jié)果

多酚的吸附與解析效果因樹脂型號的不同而不同，表2顯示了6種樹脂對落葉松樹皮多酚的吸附量、吸附率與解析率情況。

表2 6種樹脂對多酚的靜態(tài)吸附與解析性能Table2 Absorption and desorption capabilities of 6 kinds of macroretieular resins to polyphenols

由表2可知，X-5的吸附率是六種樹脂中最高的，D101的解析率最高。D101的解析率比X-5略高，而吸附率與X-5相差很大。本實驗以吸附率為主要考察因素，綜合考慮，故選X-5作為多酚純化的樹脂。

2.2 純化工藝單因素試驗

2.2.1 徑長比對多酚純化的影響

圖1反映了徑長比對多酚純化的影響情況。隨著徑長比的增加，落葉松多酚的回收率和純度都在不斷增加并趨于平衡。由此可知，徑長比的增加有利于多酚的純化效果，考慮到節(jié)省原料的因素，選1:25為落葉松多酚純化過程中的最佳徑長比。

圖1 徑長比對多酚純化的影響Fig.1 Effect of fineness ratio on purity of polyphenols

2.2.2 洗脫濃度對多酚純化的影響 如圖2所示，隨著乙醇濃度的增大，落葉松多酚的回收率以先快后慢的速度逐漸增大，乙醇濃度在 60%以后逐漸趨于平衡；多酚純度呈現(xiàn)出先緩慢增加后下降的趨勢，乙醇濃度為 50%時多酚純度達到最大值。這可能是由于高濃度的乙醇可以溶解多種有機物，使多酚的雜質(zhì)含量增加而導致純度下降。以多酚純度為主要考察因素，選擇50%的乙醇作為最佳洗脫濃度。

圖2 乙醇濃度對多酚純化的影響Fig.2 Effect of elution concentration on purity of polyphenols

2.2.3 進樣濃度對多酚純化的影響 一般來說，上樣濃度越低越有利于吸附[9]。然而，過低的濃度會減少溶質(zhì)與樹脂的接觸機會，吸附效果不好。如圖3所示，當進樣濃度為2.5mg/mL時，回收率和純度都達到最大值，分別為85.53%與75.88%。當進樣濃度超過2.5mg/mL后，回收率和純度開始下降。因此，選擇2.5mg/mL作為最佳進樣濃度。

圖3 進樣濃度對多酚純化的影響Fig.3 Effect of sample concentration on purity of polyphenols

2.2.4 洗脫流速對多酚純化的影響 過快的洗脫流速會延長解析帶，使拖尾現(xiàn)象嚴重，而過低的流速會延長生產(chǎn)周期[10]。由圖 4可知，多酚的回收率隨著洗脫流速的增加而不斷下降，多酚的純度先上升后下降，在流速為5mL/min時達到最大值，最大值為76.68%。4mL/min與5mL/min對純度影響不大，故將5mL/min作為最佳洗脫濃度。

圖4 洗脫流速對多酚純化的影響Fig.4 Effect of eluting speed on purity of polyphenols

2.2.5 進樣體積對多酚純化的影響 由圖5可知，落葉松多酚的回收率隨著進樣體積的增加而不斷下降，這可能是因為進樣體積的不斷增加打破了樹脂對多酚的吸附平衡，使多余的多酚提取液漏出的緣故。多酚的純度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在進樣體積為40mL時達到最大值，最大值為75.79%。選擇40mL為最佳上樣體積。

圖5 進樣體積對多酚純化的影響Fig.5 Effect of sample volume on purity of polyphenols

2.2.6 pH對多酚純化的影響 pH對落葉松多酚的純化效果影響如圖6所示。落葉松多酚的回收率與純度隨pH的變化情況基本一致，均是先緩慢上升然后急速下降。堿性越強則回收率與純化效果越差，這是因為多酚類物質(zhì)含有多個苯羥基，在溶液中呈弱酸性，堿性溶液破壞了多酚苯羥基結(jié)構(gòu)的因素所致。由圖6可知，未經(jīng)pH調(diào)節(jié)的多酚提取液純化效果最好，所以沒有必要調(diào)節(jié)粗提物。

圖6 pH對多酚純化效果的影響Fig.6 Effect of pH on purity of polyphenols

2.3 純化工藝響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應面試驗方案與結(jié)果 依據(jù)單因素實驗結(jié)果利用Box-Benhnken中心組合方法設計響應面實驗方案，以多酚純度為響應值，實驗設計如表3所示。使用Minitab16回歸擬合所得實驗數(shù)據(jù)，得到回歸方程：Y=75.27－2.33A－0.37B＋0.67C＋0.15AB＋0.2AC＋0.22BC－3.9A2－2.68B2－1.96C2。

表3 響應面試驗方案與結(jié)果Table3 Experiment design and estimated values of response surface

2.3.4 響應面試驗各因素的方差分析 對上述模型方程進行方差分析，各因素的方差分析結(jié)果如表 4所示。由該表數(shù)據(jù)可知，此模型是顯著的（p<0.05）。失擬性值其 Frob>F值為0.0608(p>0.05)，說明該模型的擬合度較好。

乙醇濃度對落葉松多酚純化工藝的影響最大，其Frob>F值為0.0067（<0.01），達到了極顯著水平。各因素對結(jié)果的影響按大小排序依次為A（乙醇濃度）、C（進樣體積）、和B（上樣濃度），其Prob>F值分別為0.0067、0.2595和0.5150。

由表 4可知，各因素之間的交互作用對多酚純化工藝影響不大。乙醇濃度的二次形式對純化工藝影響很大，其Prob>F值為0.0039，達到了極顯著水平。上樣濃度的二次形式影響較大，Prob>F值為0.0177，達到了顯著水平。圖7～圖9直觀地反映了各因素之間的交互作用及其對響應值的影響。

圖7至圖9是響應值多酚純度對各因素構(gòu)成的三維空間曲面圖，曲面圖下面的等高線圖可直觀地反映各因素之間的交互作用。圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著[11]，由此可知本實驗的兩因素交互作用不顯著，這與通過軟件得出的回歸模型系數(shù)顯著性檢驗得出的結(jié)果一致。

表4 響應面各因素的方差分析Table4 Variance analysis of factors of response surface

圖7 洗脫濃度與進樣濃度對多酚純化工藝影響的響應面圖Fig.7 Response surface graph of elution concentration and sample concentration to purification process of polyphenols

圖8 洗脫濃度與上樣體積對多酚純化工藝影響的響應面圖Fig.8 Response surface graph of elution concentration and sample volume to purification process of polyphenols

圖9 進樣濃度與上樣體積對多酚純化工藝影響的響應面圖Fig.9 Response surface graph of sample concentration and sample volume to purification process of polyphenols

解多酚純度的二次多項數(shù)學模型的逆矩陣，可知多酚純度最大可達 75.68%。此時，洗脫濃度為47.03%，上樣濃度為 2.46mg/mL，進樣體積為 41.51mL。為簡化實際操作，確定落葉松多酚純化的最佳條件是：乙醇濃度 47%、進樣濃度 2.5mg/mL、上樣體積 42mL。在此簡化條件下用軟件求解方程可得到多酚純度的預測值 75.66%。為了驗證該結(jié)果，做一組該條件下多酚純度的平行實驗，取三個平行實驗結(jié)果的平均值，得到的結(jié)果為 75.52%，該值接近預測值，證明可以用此模型純化落葉松多酚。

2.4 多酚純化液的高效液相分析

圖10顯示了在給定條件下落葉松樹皮多酚的分離情況與7種多酚標準品的出峰時間。其中，沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸與蘆丁的出峰時間分別為9.125、23.414、27.686、29.07、52.451min。

圖10 多酚混合標準樣品的高效液相色譜圖及落葉松樹皮多酚樣品圖Fig10 Chromatogram of polyphenols standard sample and Larch Pine Bark

由圖可知，此條件下多酚的分離效果較好。采用《計算機輔助相似性評價系統(tǒng)》與標準樣品圖譜進行比對，計算圖譜間的相似度，共確定了5個標準樣品，分別是沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸與蘆丁。由于條件有限，還有許多物質(zhì)需要進一步測定。

3 結(jié)論

本實驗以吸附率為主要指標，確定了 X-5為多酚純化工藝使用的樹脂。通過單因素試驗確定了影響多酚純化效果各個因素的最佳值。在此基礎上，選取洗脫濃度、上樣濃度、進樣體積3個指標設計響應面優(yōu)化試驗，由Design-expert8.05軟件處理數(shù)據(jù)得到純化的最佳工藝條件為：徑長比1:25，洗脫濃度47.03%，上樣濃度2.46mg/mL，洗脫流速5mL/min，進樣體積為41.52mL，pH6.85。考慮到實際操作需要，確定最終的工藝條件為：徑長比1:25、洗脫流速5mL/min、乙醇濃度47%、進樣濃度2.5mg/mL、上樣體積42mL，在此條件下進行驗證實驗得到的純化結(jié)果為75.52%，接近預測值75.66%。

分析多酚純化液可知，落葉松樹皮含有5種多酚，分別是沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡館與蘆丁。此結(jié)果可以給以后落葉松多酚純化方面的研究提供一定的依據(jù)。

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