劉 靜，李湘利，張 艷，胡彥營，朱九濱

(濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東曲阜273155)

膳食纖維是一類不被人體消化的多糖類碳水化合物和木質(zhì)素的總稱，能有效預(yù)防和減少結(jié)腸癌、糖尿病、冠心病、肥胖癥、心肌梗塞等疾病的發(fā)生，被譽(yù)為人體的“第七大類營養(yǎng)素”［1－2］。膳食纖維的生理功能多與其抗氧化活性有關(guān)，不同來源的膳食纖維，抗氧化活性差異較大［3］。

香椿(Toona Sinensis(A.Juss.)Roem)是我國的一種綠色保健菜［4］，具有清除體內(nèi)自由基、抗氧化衰老、維持毛細(xì)血管脆性和調(diào)節(jié)人體微循環(huán)等功效［5］;它還有清熱解毒、健胃理氣、殺蟲和固精等作用［6］?，F(xiàn)有研究表明，香椿葉提取物具有抗氧化活性［7－8］和抑菌作用［9］。目前，關(guān)于香椿葉的研究多集中于黃酮類［10］、多酚物質(zhì)［11］等方面，而關(guān)于總膳食纖維(Total dietary fiber，TDF)提取及其抗氧化活性尚缺乏系統(tǒng)研究。本實驗通過單因素實驗和響應(yīng)面分析方法，以香椿葉TDF得率為指標(biāo)，優(yōu)化了中性蛋白酶提取TDF的工藝參數(shù)，并對其抗氧化活性進(jìn)行探討，旨在為開發(fā)天然抗氧化劑資源及香椿葉綜合利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香椿葉 2012年9月采自本校教工生活區(qū);耐高溫α－淀粉酶 北京東華強(qiáng)盛生物科技有限公司，2000U/g;中性蛋白酶 南寧龐博生物工程公司，40萬U/g;纖維素酶 湖州米純生物科技有限公司，10萬U/g;無水乙醇、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚、1，1－二苯基苦基苯肼(DPPH)等，分析純。

FCD2000鼓風(fēng)干燥箱 上?，槴\實驗設(shè)備有限公司;2H－25C多功能食品加工機(jī) 澳柯瑪小家電有限公司;pHS－3C酸度計 上海宇隆儀器有限公司;RE201B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 南京金正教學(xué)儀器有限公司;HH－S24S數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;TD6低速離心機(jī) 長沙英泰儀器有限公司;723PC分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香椿葉TDF提取工藝 香椿葉→烘干→粉碎→過篩→香椿葉粉→脫脂→干燥→復(fù)合酶酶解→滅酶→冷卻→中性蛋白酶酶解→滅酶→冷卻→乙醇沉淀→離心→洗滌→沉淀→干燥→產(chǎn)品TDF

1.2.2 操作要點 將香椿葉于60℃烘干至恒重，粉碎，過40目篩，用石油醚脫除脂肪，蒸餾水洗凈;干燥后按料液比1∶20(g/mL)加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH6.0，添加0.2%復(fù)合酶(纖維素酶∶淀粉酶=1∶1)于60℃酶解2h［12］，煮沸滅酶;冷卻后加一定量的中性蛋白酶在一定的pH、溫度、時間下進(jìn)行酶解，然后煮沸滅酶;冷卻后加4倍體積95%乙醇沉淀1h，4000r/min離心10min，沉淀分別用15mL的78%乙醇、95%乙醇和丙酮各沖洗2次，105℃烘干即得香椿葉TDF。

1.2.3 TDF提取條件的優(yōu)化 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以酶解pH(X1)、酶解溫度(X2)、酶解時間(X3)、酶添加量(X4)為自變量，TDF得率(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的二次回歸方程擬合自變量和TDF得率之間的函數(shù)關(guān)系，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝條件，各實驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

TDF得率的計算公式為:

1.2.4 化學(xué)成分的測定 水分，直接干燥法(GB5009.3－2010);灰分，直接灰化法(GB5009.4－2010);蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)染色法［13］;淀粉，酸水解法(GB/T5009.9－2008);脂肪，索氏抽提法(GB/T5009.6－2003);產(chǎn)品膳食纖維，酶重量法(AOAC991.43)。

1.2.5 香椿葉TDF抗氧化能力實驗

1.2.5.1 對DPPH·的清除作用 采用比色法測定［14］。用無水乙醇將10mg/mL TDF溶液分別稀釋成質(zhì)量濃度為 2、4、6、8、10mg/mL 的溶液。在試管中加入1.0mL TDF溶液，4.0mL 1.0×10－4mol/L DPPH溶液(95%乙醇配制)25℃水浴反應(yīng)30min，測定517nm處吸光度(用蒸餾水作參比)。另用去離子水配制與TDF溶液等濃度的VC溶液，做陽性對照實驗，重復(fù)3次(下同)。

式中:Ax為4.0mL DPPH溶液+1.0mL樣品溶液;Ax0為4.0mL 95%乙醇+1.0mL樣品溶液;A0為4.0mL DPPH溶液+1.0mL蒸餾水。

1.2.5.2 對O－2·的清除作用 采用鄰苯三酚自氧化法測定［15］。在試管中加入 4.5mL 0.05mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH8.2)、1.0mL TDF溶液、0.4mL 45mmol/L的鄰苯三酚溶液(0.01mmol/L HCl配制)搖勻，25℃反應(yīng)5min后加入0.1mL 8mmol/L HCl溶液終止反應(yīng)，測定325nm處吸光度(用蒸餾水作參比)。

式中:Ax為4.5mL緩沖液+1.0mL樣品溶液+0.4mL鄰苯三酚溶液;Ax0為4.5mL緩沖液+1.0mL樣品溶液+0.4mL 0.01mol/L HCl溶液;A0為4.5mL緩沖液+1.0mL蒸餾水+0.4mL鄰苯三酚溶液。

1.2.5.3 對·OH的清除作用采用Fenton反應(yīng)體系模型測定［12］。在試管中加入1.0mL 9mmol/L水楊酸－乙醇溶液、1.0mL TDF溶液、1.0mL 9mmol/L FeSO4溶液，最后加入1.0mL 8.8mmol/L H2O2溶液啟動反應(yīng)，于37℃保溫30min后，測定510nm處吸光度(用蒸餾水作參比)。

式中:Ax為1.0mL水楊酸－乙醇溶液+1.0mL樣品溶液+1.0mL FeSO4溶液+1.0mL H2O2溶液;Ax0為1.0mL水楊酸－乙醇溶液+1.0mL樣品溶液+1.0mL FeSO4溶液+1.0mL蒸餾水;A0為1.0mL水楊酸－乙醇溶液+1.0mL蒸餾水+1.0mL FeSO4溶液+1.0mL H2O2溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 中性蛋白酶提取香椿葉TDF的單因素實驗結(jié)果

2.1.1 酶解pH對香椿葉TDF得率的影響 由圖1可知，脫脂干燥后的香椿葉粉添加0.2%的中性蛋白酶，在60℃下酶解60min，香椿葉TDF得率隨pH升高而增加，pH6.0時，TDF得率最高可達(dá)71.69%;pH高于6.0時，TDF得率下降。這是因為pH過高，酶活性中心的構(gòu)象甚至整個酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，酶蛋白變性、失活，從而導(dǎo)致原料水解不完全［16］。故酶解pH為6.0較合適。

圖1 pH對香椿葉TDF得率的影響Fig.1 Effect of pH on the yield of TDF from Toona Sinensis leaves

2.1.2 酶解溫度對香椿葉TDF得率的影響 由圖2可知，脫脂干燥后的香椿葉粉添加0.2%的中性蛋白酶，在pH6.0酶解60min，香椿葉TDF得率隨酶解溫度升高，呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。尤以60℃時TDF得率最高，可達(dá)71.75%;70℃時，TDF得率降為60.59%。這主要是由于溫度過低不利于酶與底物接觸，溫度過高易引起酶失活所致。故酶解溫度以60℃為宜。

圖2 酶解溫度對香椿葉TDF得率的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on the yield of TDF from Toona Sinensis leaves

2.1.3 酶解時間對香椿葉TDF得率的影響 由圖3可知，脫脂干燥后的香椿葉粉添加0.2%的中性蛋白酶，在pH6.0、60℃下酶解，香椿葉TDF得率隨酶解時間的延長呈現(xiàn)鐘形變化曲線。以酶解60min時，TDF得率最高可達(dá)71.60%。由于隨酶解時間的增加，部分可溶性膳食纖維溶解損失，降低了 TDF得率［17］。故酶解60min為宜。

圖3 酶解時間對香椿葉TDF得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the yield of TDF from Toona Sinensis leaves

2.1.4 酶添加量對香椿葉TDF得率的影響 由圖4可知，脫脂干燥后的香椿葉粉添加中性蛋白酶在pH6.0、60℃下酶解60min，香椿葉TDF得率在酶添加量0.2%時，最高可達(dá)71.57%;隨加酶量的繼續(xù)增加，TDF得率反而下降。因為樣品中殘留的蛋白質(zhì)隨著蛋白酶用量的增加而降解;也可能是膳食纖維中的碳氮鍵被過量的蛋白酶降解，加之部分水溶性膳食纖維流失，造成TDF得率降低［18］。故中性蛋白酶添加量宜選擇0.2%。

圖4 酶添加量對香椿葉TDF得率的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on the yield of TDF from Toona Sinensis leaves

2.2 香椿葉TDF提取工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 模型的建立 利用Design Expert8.0.7.1軟件的中心組合設(shè)計(Box－Behnken)選項，可獲得香椿葉TDF提取的四因素三水平實驗設(shè)計，實驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface experiments

利用Design Expert軟件對表2的實驗結(jié)果進(jìn)行分析，得到各因素與TDF得率之間的回歸方程:

對回歸模型進(jìn)行方差分析的結(jié)果(表3)表明:回歸模型極顯著(p＜0.01)，而失擬項差異不顯著(p＞0.05)，說明回歸模型與實測值能較好地擬合;一次項(X1、X2、X3)與二次項(X12、X2

2、X32、X42)對TDF得率影響極顯著(p＜0.01)，交互項(X1X2)影響顯著(p＜0.05)，其他項影響不顯著(p＞0.05)。由F值的大小可以推斷，在所選實驗范圍內(nèi)，各因素對香椿葉TDF得率的影響順次為:酶解pH＞酶解時間＞酶解溫度＞酶添加量。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the built regression model

2.2.2 響應(yīng)面分析 利用Design Expert軟件得到二次回歸方程的響應(yīng)面，酶解pH和酶解溫度對TDF得率的影響見圖5。由圖5可知，酶解時間和酶添加量保持不變時，隨著酶解pH和酶解溫度的延長，TDF得率呈先增加后降低的趨勢;等高線呈橢圓形說明酶解pH與酶解溫度的交互作用顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖5 酶解pH和酶解溫度對TDF得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of enzymolysis pH and temperature on the yield of TDF

2.2.3 最佳提取條件的確定與驗證 應(yīng)用Design Expert軟件，得到香椿葉 TDF最佳提取工藝為pH5.82、酶解溫度60.72℃、酶解時間50.2min、酶量添加0.2%。結(jié)合實際可操作性，選取最優(yōu)提取條件為pH5.8、酶解溫度61℃、酶解時間 50min、酶添加量0.2%，并在此條件下進(jìn)行驗證，TDF得率為72.45%，這與模型預(yù)測值(72.47%)非常接近，這表明該模型可用于中性蛋白酶提取香椿葉TDF的得率預(yù)測。

2.3 組成成分分析

由表4可知，所得產(chǎn)品中TDF含量為72.69%，高于樣品中的含量;除灰分外，各種雜質(zhì)成分含量較低，說明除雜效果較好。

表4 樣品及產(chǎn)品主要成分(%)Table 4 The main composition of sample and product(%)

2.4 香椿葉TDF對DPPH·的清除作用

由圖6可知，香椿葉TDF對DPPH·具有清除作用。TDF濃度在2～10mg/mL時，對DPPH·清除作用隨濃度增大而加強(qiáng)，且清除率與TDF濃度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。利用Microsoft Excel 2003的CORREL函數(shù)［19］，對TDF濃度與 DPPH·清除率進(jìn)行相關(guān)性分析，得二者相關(guān)系數(shù)為0.9906;應(yīng)用FORECAST函數(shù)［20］計算清除 50%DPPH·所需 TDF濃度 IC50=3.26mg/mL。以VC作標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑，在相同濃度下對DPPH·清除率均大于98%，這說明香椿葉TDF對DPPH·清除能力弱于VC。

2.5 香椿葉TDF對·的清除作用

圖6 香椿葉TDF對DPPH·的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of TDF from Toona Sinensis against DPPH·

圖7 香椿葉TDF對O2－·的清除能力Fig.7 Scavenging capacity of TDF from Toona Sinensis against O2－·

2.6 香椿葉TDF對·OH的清除作用

由圖8可知，香椿葉TDF對·OH具有清除作用。TDF濃度在2～6mg/mL時，對·OH的清除率隨濃度的增加而增強(qiáng);TDF濃度高于6mg/mL時，對·OH清除率增加緩慢，10mg/mL時，清除率為27.38%。相同濃度下，VC對·OH清除率在95%～97%之間，這說明香椿葉TDF對·OH清除能力弱于VC。

圖8 香椿葉TDF對·OH的清除能力Fig.8 Scavenging capacity of TDF from Toona Sinensis against·OH

3 結(jié)論

在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用Box－Behnken中心組合設(shè)計以中性蛋白酶酶解pH、酶解溫度、酶解時間、酶添加量為自變量，以香椿葉TDF得率為響應(yīng)值，得到四元二次數(shù)學(xué)回歸模型。應(yīng)用Design expert軟件對所得模型進(jìn)行分析，得到中性蛋白酶提取TDF的最佳工藝條件為酶解pH5.8、酶解溫度61℃、酶解時間50min、酶添加量0.2%，香椿葉TDF得率可達(dá)72.45%。

香椿葉TDF具有一定的抗氧化活性。香椿葉TDF濃度在2～10mg/mL時，對DPPH·具有較強(qiáng)的清除能力，IC50為3.26mg/mL;對·、·OH 最高清除率分別為35.13%和27.38%，但其清除三種自由基的能力均弱于VC。

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