劉冬，黃玉軍，顧瑞霞*，蘇萬業(yè)

（江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室；揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127）

衰老及很多惡性疾病如癌癥、白內(nèi)障、肝硬化、動脈粥樣硬化等的發(fā)生都與體內(nèi)自由基過度產(chǎn)生有關[1-2]。通過膳食中補充抗氧化物質(zhì)可以增強機體的抗氧化能力，清除體內(nèi)過多產(chǎn)生的自由基，但許多化學合成的抗氧化劑存在安全問題[3]。因此，開發(fā)具有高抗氧化活性且安全的健康膳食補充劑成為一個很有意義的研究課題。

近些年不少體內(nèi)外研究已證明一些乳酸菌(Lactic Acid Bacteria，LAB)具有優(yōu)良的抗氧化活性，如Kullisaar等[4]利用人體實驗報道了發(fā)酵乳桿菌ME-3具有抗氧化活性；徐寅等[5]的研究表明嗜熱鏈球菌grx90發(fā)酵豆乳體內(nèi)外抗氧化活性顯著高于普通豆乳，且證實了發(fā)酵豆乳抗氧化活性的增強主要是基于嗜熱鏈球菌grx90活菌體及其代謝產(chǎn)物。而且乳酸菌作為腸道常駐菌群，在腸道定植后還能增殖生成更多發(fā)揮抗氧化作用的乳酸菌，從而維持機體氧化損傷的重點部位——腸道處于氧化還原平衡狀態(tài)[6]。此外，大量的研究已充分驗證乳酸菌的安全性[7]。因此乳酸菌的抗氧化作用與傳統(tǒng)的抗氧化劑相比有更多的優(yōu)勢，篩選具有良好抗氧化能力的乳酸菌也已成為當前益生菌的熱門研究課題。

但目前篩選高抗氧化活性乳酸菌的研究所用菌株大多從發(fā)酵食物或動物腸道中分離獲得，對長壽人群腸道的乳酸菌抗氧化活性研究報道則較少。而益生菌的一個重要屬性是最好來源于人體本身[7]。本研究對從江蘇如皋長壽村人群腸道中分離的30株乳酸菌抗氧化性能進行研究，以期獲得能應用于功能性食品的高抗氧化性能乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗室前期從江蘇如皋長壽村人群腸道中分離保存的30株乳酸菌。

1,1- 二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)美國Sigma公司；三氯乙酸(TCA)、過氧化氫（H2O2）、硫酸亞鐵（FeS04）、鐵氰化鉀、三氯化鐵（FeCl3）、鄰-菲羅琳等 均為國產(chǎn)分析純；T-SOD、GSH-Px檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；PCR所用試劑 均購自上海生工生物工程公司。

MRS培養(yǎng)基及改良MRS培養(yǎng)基[8]。

可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；高速冷凍離心機 德國 EPPENDORF公司；全自動滅菌鍋 日本 TOMY公司；電泳儀 北京市六一儀器廠；PCR擴增儀 美國Life Technologies公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的活化與保存 將凍存的乳酸菌樣品用滅菌生理鹽水稀釋，于改良MRS固體培養(yǎng)基劃線，37℃培養(yǎng)48h，挑取純的菌落進行鏡檢，并接種到MRS液體培養(yǎng)基中。取菌液與60%甘油按3:1(V:V)混勻，-20℃保存。

1.2.2 樣品制備 乳酸菌在MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h，傳2代后，6000r/min，4℃離心10min，收集上清液，即為發(fā)酵上清液。

收集的菌體一部分用發(fā)酵上清液調(diào)整菌體濃度為1.0×109cfu/mL，即為發(fā)酵液。

其余菌體加PBS 緩沖液(0.02mol/L，pH7.4)于6000r /min 離心5min，洗滌3次。將菌體重懸于PBS緩沖液，調(diào)整菌體濃度為1.0×109cfu/mL，即為菌體懸液。

將菌體懸液冰浴超聲波破碎細胞10min后，在4℃、10000r/min離心15min，收集上清液，即為胞內(nèi)提取物[9]。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵液抗氧化能力比較

1.3.3.1 乳酸菌羥自由基（·OH）清除能力 參照文獻[10]方法。

1.3.3.2 乳酸菌DPPH 自由基（DPPH·）清除能力 參照文獻[11]方法(略有改進)。取樣品2mL，加入2mLDPPH·無水乙醇溶液（0.2mmol/L），搖勻，避光反應30min，6000r/min 離心10min，取上清液于517nm處測定吸光度值Ai；空白組以等體積無水乙醇代替DPPH·無水乙醇溶液，對照組以等體積空白溶劑代替樣品溶液，并以等體積蒸餾水和乙醇混合液空白調(diào)零。

式中： Ac為對照組吸光值；Ai為樣品組吸光值； Aj為空白組吸光值。

1.3.3.3 乳酸菌還原能力 參照文獻[12]方法。

1.3.4 乳酸菌不同組分抗氧化能力比較 乳酸菌不同組分清除羥自由基、DPPH自由基及還原能力測定方法同上。

乳酸菌T-SOD和GSH-Px活性測定方法按照南京建成生物工程研究所的試劑盒操作說明書。

1.3.5 乳酸菌的鑒定

1.3.5.1 糖發(fā)酵和生理生化實驗 參照文獻[13]方法，對篩選獲得的乳酸菌進行糖發(fā)酵實驗、生理生化實驗。

1.3.5.2 16S rDNA鑒定 乳酸菌DNA提取參照文獻[14]方法。采用引物

T1(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和T2(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)，對其16S rDNA進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物委托上海生工生物工程公司進行測序。將測序結(jié)果提交到BLAST進行在線比對以得出結(jié)果。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)均平行測定3次，采用均值±標準差表示，用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌編號及形態(tài)

30株乳酸菌，編號為L1～L30。30株菌革蘭氏染色均為陽性，細胞形態(tài)和菌落形態(tài)也均符合乳酸菌的特點，其中桿菌17株，球菌13株。除了菌株L5、L23和L25菌落邊緣和表面略粗糙外，其余菌株均是菌落邊緣整齊。

2.2 乳酸菌發(fā)酵液抗氧化能力比較

對30株乳酸菌發(fā)酵液清除自由基能力以及還原能力進行了測定，結(jié)果見表1。

注：同一列字母不同表示數(shù)據(jù)存在顯著差異（p<0.05），字母相同表示差異不顯著（p>0.05）。

由表1可知，30株乳酸菌發(fā)酵液均有一定的抗氧化能力，但各菌株抗氧化能力差異較大。其中，L10發(fā)酵液清除羥自由基能力最強，顯著高于其它菌株（p<0.05）。而L27最弱，僅相當于L10的29.8%。羥自由基清除率超過60%的菌株共有5株，占所有菌株的16.7%；而清除率介于40%～60%的菌株共有20株，占所有菌株的66.7%；由此可見，大多數(shù)菌株發(fā)酵液羥自由基清除率均大于40%。L13發(fā)酵液對DPPH自由基清除能力最強，顯著高于其它菌株（p<0.05）。L25最弱，僅相當于L13的18.1%。DPPH自由基清除率大于70%的菌株有4株，占所有菌株13.3%；清除率介于40%～70%的菌株共有14株，占所有菌株46.7%，表明大多數(shù)菌株發(fā)酵液對DPPH自由基清除率超過40%。L10發(fā)酵液的還原能力最高，而L6則為最低，顯著低于其它菌株（p<0.05），僅相當于L10的22.8%。A700nm大于2.00的菌株共有6株，占所有菌株的20%；介于1.50～2.00的菌株共有11株，占所有菌株的36.7%，表明大多數(shù)菌株A700nm均高于1.50。

由表1也可知，乳酸菌發(fā)酵液清除·OH和DPPH·能力及還原能力三者之間并沒有必然聯(lián)系，這與劉天祎等[2]的研究結(jié)果相似。這也反映出菌株發(fā)揮清除·OH和DPPH·能力及還原能力的物質(zhì)不同，表明乳酸菌抗氧化作用是多種物質(zhì)綜合作用的結(jié)果。

綜合表1數(shù)據(jù)，初步篩選出發(fā)酵液總體抗氧化性能較好的4株菌，分別為L3、L10、L13及L18，進一步測定其不同組分清除自由基能力、還原能力及抗氧化酶活性。

2.3 乳酸菌不同組分抗氧化能力比較

2.3.1 乳酸菌對羥自由基（·OH）清除能力 對4株乳酸菌不同組分清除羥自由基能力進行了測定，結(jié)果見圖1。

圖1 乳酸菌對·OH的清除率Fig.1 Scavenging rates of LAB against hydroxyl radical

由圖1可知，4株菌不同組分對羥自由基均有一定清除能力，但不同組分之間差異較大。發(fā)酵上清液羥自由基清除能力均較高，其中L13發(fā)酵上清液對羥自由基清除能力最強，與其他3株菌有顯著差異（p<0.05）。菌體和胞內(nèi)提取物羥自由基清除能力相對于發(fā)酵上清液要弱。菌體懸液組中，L3的羥自由基清除率最低，僅為其發(fā)酵上清液的11.4%；胞內(nèi)提取物組中，L3清除率仍是最低，僅相當于其發(fā)酵上清液的3.9%。L13的菌體懸液及胞內(nèi)提取物羥自由基清除能力相對較強，分別相當于其發(fā)酵上清液的32.2%、46.1%。

王玉華等[15]對鼠李糖乳桿菌LR12 和LR76不同組分清除羥自由基能力的研究卻發(fā)現(xiàn)活細胞菌體和破碎菌體清除羥自由基能力顯著高于無細胞抽提液（即發(fā)酵上清液），與本實驗結(jié)果相反，表明不同乳酸菌發(fā)揮清除羥自由基能力的物質(zhì)存在較大差異。

2.3.2 乳酸菌對DPPH自由基清除能力 對4株乳酸菌不同組分清除DPPH自由基能力進行了測定，結(jié)果見圖2。

圖2 乳酸菌對DPPH 自由基的清除率Fig.2 Scavenging rates of LAB against DPPH free radical

由圖2可知，4株菌不同組分對DPPH自由基均有一定清除能力。發(fā)酵上清液和菌體懸液DPPH自由基清除能力均較高，且差異較小。其中，L13發(fā)酵上清液對DPPH自由基清除能力最強。而菌體懸液組中，L10對DPPH自由基清除能力最強，且相當于其發(fā)酵上清液的86.7%。胞內(nèi)提取物的DPPH自由基清除能力相對要低很多，L10清除率最高，但也僅相當于其發(fā)酵上清液的23.1%。

2.3.3 乳酸菌還原能力的測定 對4株乳酸菌不同組分還原能力進行了測定，結(jié)果見圖3。

圖3 乳酸菌的還原能力Fig.3 Reducing activity of LAB

由圖3可知，4株菌各組分均具有一定還原能力，但不同組分還原能力差異較大。發(fā)酵上清液還原能力較高，且差異不顯著，其中L13最高。而菌體和胞內(nèi)提取物還原能力與發(fā)酵上清液相比要弱很多，其中L10的菌體懸液和胞內(nèi)提取物還原能力相對較高，但也僅分別相當于其發(fā)酵上清液的4.7%和3.6%，由此表明，這4株乳酸菌發(fā)揮還原活性的物質(zhì)主要集中在發(fā)酵上清液中。

2.3.4 乳酸菌T-SOD活性 乳酸菌抗氧化酶（如SOD和GSH-Px）主要存在于發(fā)酵上清液及胞內(nèi)，因此只對4株乳酸菌發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物T-SOD和GSH-Px活性進行了測定，T-SOD活性測定結(jié)果見圖4。

圖4 乳酸菌T-SOD活性Fig.4 T-SOD activity of LAB

由圖4可知，4株菌發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物均有一定SOD活性，且同一組分SOD活性差異較小。其中，L13發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物SOD活性最高，但胞內(nèi)提取物SOD活性較弱，僅相當于其發(fā)酵上清液的13.2%；而L18發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物SOD活性最低，且顯著低于其他菌株（p<0.05）。2.3.5 乳酸菌GSH-Px活性 對4株乳酸菌發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物GSH-Px活性進行了測定，結(jié)果見圖5。

圖5 乳酸菌GSH-Px活性Fig.5 GSH-Px activity of LAB

由圖5可知，4株菌發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物均有一定GSH-Px活性，但不同菌株及不同組分之間差異較大。L13發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物的GSH-Px活性最高，顯著高于其他菌株（p<0.05），其胞內(nèi)提取物GSH-Px活性相當于其發(fā)酵上清液的53.5%。而L3發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物的GSH-Px活性最低，其胞內(nèi)提取物GSH-Px活性較弱，僅相當于其發(fā)酵上清液23.3%。

由圖1～圖5可知，菌株各組分的抗氧化酶活性與其清除·OH和DPPH·能力及還原能力之間不完全對應，具有一定差異。這表明抗氧化酶影響了菌株的抗氧化能力，但不是唯一的影響因素。王玉華等[16]的研究也映證了這一點。

2.3.6 乳酸菌發(fā)酵液與各組分綜合抗氧化能力比較 將4株乳酸菌不同組分自由基清除率及還原能力平均值加和，并與其發(fā)酵液相比，結(jié)果見表2。

表2 乳酸菌發(fā)酵液與各組分綜合抗氧化能力比較Table 2 Comparison of antioxidant capacity of the fermentation and the broth of each component of LAB

由表2可知，4株乳酸菌發(fā)酵液的抗氧化能力并不等同于其各組分抗氧化能力總和。其中，4株菌各組分對羥自由基和DPPH自由基清除能力總和要高于其發(fā)酵液，且L10和L13各組分之和顯著高于其發(fā)酵液。但還原能力卻反之，4株菌發(fā)酵液的還原能力略高于其各組分總和。且從圖3數(shù)據(jù)可知，4株菌的發(fā)酵上清液對還原能力貢獻最大，菌體及胞內(nèi)提取物的還原能力非常微弱，甚至可以忽略。

綜上數(shù)據(jù)分析表明，各菌株發(fā)酵上清液對綜合抗氧化貢獻較大，顯示出顯著的抗氧化性能。原因可能是乳酸菌大多數(shù)抗氧化物質(zhì)都以胞外分泌的方式存在于發(fā)酵上清液中。而菌體及胞內(nèi)也存在一定的抗氧化物質(zhì)，通過PBS重懸及破碎細胞可釋放出來，使得其各組分清除自由基能力總和要高于發(fā)酵液。但還原能力表現(xiàn)出相反的結(jié)果，可能是發(fā)揮還原活性的物質(zhì)在菌體及胞內(nèi)存在極少，而將乳酸菌各組分分開，可能會導致發(fā)揮還原活性的物質(zhì)損失，亦或可能是乳酸菌發(fā)酵液中發(fā)揮還原活性的物質(zhì)存在協(xié)同作用，使得其發(fā)酵液還原活性略高于各組分總和。此外，發(fā)酵液清除自由基能力也不等于發(fā)酵上清液和菌體懸液的疊加，原因可能是發(fā)酵上清液中抗氧化物質(zhì)較多，影響了發(fā)酵液中菌體清除自由基物質(zhì)的的釋放，而當菌體存在于PBS緩沖液時，清除自由基物質(zhì)則能較好地釋放出來，使得菌體懸液也有較高的清除自由基能力。

目前已有較多研究者對乳酸菌不同組分抗氧化能力進行了比較研究[2，15-17]，但乳酸菌發(fā)酵液抗氧化能力與不同組分抗氧化能力之間的比較研究尚未有報道。本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液抗氧化能力不等于各組分抗氧化能力加和，但其是否有普遍性及其中作用機理還有待于進一步研究和驗證。

2.4 乳酸菌的鑒定

2.4.1 糖發(fā)酵和生理生化實驗 綜合以上試驗結(jié)果，乳酸菌L10和L13發(fā)酵液及其各組分清除自由基能力和還原能力總體較高，且發(fā)酵上清液和胞內(nèi)提取物的抗氧化酶活性總體也較高。利用糖發(fā)酵和生理生化實驗對其進行鑒定，結(jié)果如表3、4所示。

表3 L10和L13糖發(fā)酵實驗結(jié)果Table 3 Carbohydrate fermentation tests of L10 and L13

?

表4 L10和L13生理生化實驗結(jié)果Table 4 Physiological and biochemical tests of L10 and L13

綜合表4、5測定結(jié)果，參考文獻[18]，可初步判斷L10和L13分別為乳桿菌屬發(fā)酵乳桿菌和干酪乳桿菌。

2.4.2 16S rDNA鑒定 采用16S rDNA序列分析法對L10和L13進行了鑒定。

以乳酸菌L10和L13的總DNA為模板，采用通用引物進行PCR擴增，得到一條長度約1500bp的特異性擴增產(chǎn)物（見圖6），并將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序，測序結(jié)果通過BLAST程序提交到NCBI網(wǎng)站基因庫進行同源性搜索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸菌L10的16S rDNA序列與多株發(fā)酵乳桿菌的16S rDNA序列同源性為98%，結(jié)合形態(tài)，糖發(fā)酵和生理生化實驗可鑒定為發(fā)酵乳桿菌；而乳酸菌L13的16S rDNA序列與多株干酪乳桿菌的16S rDNA序列同源性高達99%，結(jié)合形態(tài)，糖發(fā)酵和生理生化實驗可鑒定為干酪乳桿菌。

圖6 L10和L13 16S rDNA序列PCR擴增結(jié)果Fig. 6 PCR amplification results of 16S rDNA sequence for L10 and L13

3 結(jié)論

本研究通過不同方法測定了分離自江蘇如皋長壽村人群腸道的30株乳酸菌的抗氧化能力，并最終獲得2株總體抗氧化性能較好的菌株L10和L13，經(jīng)鑒定分別為發(fā)酵乳桿菌和干酪乳桿菌。

本研究通過對乳酸菌發(fā)酵液和不同組分抗氧化能力測定比較發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的發(fā)酵液抗氧化能力不等同其各組分抗氧化能力總和，其中發(fā)酵上清液對抗氧化作用貢獻最大，顯著高于菌體與胞內(nèi)提取物。

本研究獲得的菌株L10和L13，其發(fā)酵上清液對羥自由基清除率分別為56.4%和64.8%；對DPPH自由基清除率分別為51.8%和53.5%；還原活性A700nm值分別為2.523和2.540；T-SOD活性分別為

32.802 U/mL和33.825U/mL；GSH-Px活性分別為37.273U/mL和45.012U/mL。對比相關研究，如王玉華等[15]獲得的鼠李糖乳桿菌LR76發(fā)酵上清液對羥自由基清除率為32%，張鳳敏等[17]獲得的植物乳桿菌L1001完整細胞和無細胞提取物的DPPH自由基清除率分別為36.2%和37.9%，劉天祎等[2]獲得的菌株L8發(fā)酵上清液T-SOD為21.12U/mL，劉洋等[9]獲得的瑞士乳桿菌發(fā)酵上清液GSH-Px活性為25.636U/mg，可知，本研究所得到的兩株菌具有較高的抗氧化活性。

本研究篩選獲得的2株益生菌綜合抗氧化性能較好，且均來自長壽人群腸道，安全性較高，具有潛在的應用價值，其抗氧化機制及發(fā)揮抗氧化作用的活性物質(zhì)在后續(xù)實驗中有待進一步研究。

[1]張書文, 呂加平, 孟和畢力格, 等. 干酪乳桿菌干酪亞種Lactobacillus casei subsp.casei SY13對衰老模型小鼠的抗氧化作用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學,2010, 43(10): 2141-2146.

[2]劉天祎, 潘道東. 抗氧化活性乳酸菌的篩選[J]. 食品科學, 2011, 32(19): 125-129.

[3]Moktan B, Saha J, Sarkar P K. Antioxidant activities of soybean as affected by Bacillus-fermentation to kinema[J]. Food Res.Int, 2008,41(6): 586-593.

[4]Kullisaar T, Songisepp E, Mikelsaar M, et al. Antioxidative probiotic fermented goats’milk decreases oxidative stress-mediated atherogenicity in human subjects[J]. Br J Nutr,2003,90(2): 449-456.

[5]徐寅, 黃玉軍, 陳霞, 等. 乳酸菌發(fā)酵豆乳體內(nèi)外抗氧化效應研究[J]. 中國乳品工業(yè),2012, 40(8): 16-19.

[6]胡曉麗. 乳酸菌抗氧化性及其對小鼠結(jié)腸氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)的研究[D]. 無錫:江南大學, 2009.

[7]霍貴成. 乳酸菌的研究與應用[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2007: 53-57.

[8]凌代文.乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 1999,36.

[9]劉洋, 郭宇星, 潘道東, 等. 4 種乳酸菌體外抗氧化能力的比較研究[J]. 食品科學, 2012, 33(11): 25-29.

[10]張書文, 呂加平, 孟和畢力格, 等. 兩株乳酸桿菌SY13和LJJ對活性氧的耐受性[J]. 微生物學報, 2009,49(2): 257-261.

[11]Maryam A S, Abubakr Z H, Mohamed M A, et al. Antioxidantactivity of lactic acid bacteria (LAB)fermented skim milk as determined by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)and ferrous chelating activity (FCA)[J].African Journal of Microbiology Research, 2012, 6(34): 6358-6364.

[12]Wu H C, Chen H M, Shiau C Y. Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel (Scomber austriasicus)[J]. Food Research International, 2003, 36(9-10): 949-957.

[13]趙斌, 何紹江. 微生物實驗手冊[M]. 北京: 科學出版社, 2002: 251-255.

[14]張潔, 徐桂花, 尤麗琴. 16S rDNA序列分析法鑒定乳酸菌[J].農(nóng)產(chǎn)品加工：創(chuàng)新版, 2009, 4(1): 47-49, 69.

[15]王玉華, 王立梅, 馮印, 等. 鼠李糖乳桿菌菌株 LR12和 LR76的抗氧化性研究[J]. 食品科學, 2009,30(19): 177-180.

[16]王玉華, 高晶, 陳萍, 等. 鼠李糖乳桿菌不同組分抗氧化活性的研究[J]. 食品科技, 2011, 36(9): 27-31.

[17]張鳳敏, 田豐偉, 陳衛(wèi), 等. 具抗氧化活性乳酸菌的篩選[J]. 中國乳品工業(yè), 2007, 35(2): 4-7.

[18]張剛. 乳酸細菌——基礎、技術和應用[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2007: 45-46.