張曉燕，古麗娜孜，庫米拉，陳衛(wèi)林，王小標(biāo)，楊 靜，王雪薇，韓艷鵬，武 運(yùn)

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052)

生活在低溫環(huán)境下的微生物稱為低溫微生物，主要分為嗜冷菌(psychrophiles)和耐冷菌(psychrotrophs)兩類，前者是指在0℃可生長繁殖，最適溫度不超過15℃，最高溫度不超過20℃的細(xì)菌、真菌和藻類等微生物［1］;后者是指在0～5℃可生長繁殖，最適生長溫度可達(dá)20℃以上的微生物。低溫微生物能夠在低溫條件下產(chǎn)生一些具有較高催化效率的低溫酶，來維持細(xì)胞新陳代謝的正常運(yùn)行［2］。

目前，對(duì)低溫蛋白酶的研究主要集中在從極地、冰川、雪山、深海等長年極冷環(huán)境選育產(chǎn)酶的冷適微生物、通過化學(xué)誘變和物理誘變篩選高產(chǎn)低溫蛋白酶菌株［3］、冷適蛋白酶提純及酶學(xué)特性研究［4］、從分子水平解析適冷機(jī)制并進(jìn)行化學(xué)修飾保護(hù)酶的熱穩(wěn)定性［5］。低溫蛋白酶具有低溫易反應(yīng)，高效活力，熱損失少等優(yōu)點(diǎn)，因此，在食品、環(huán)境修復(fù)、化妝用品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著中溫蛋白酶無法比擬的優(yōu)越性［6－7］。對(duì)于陸地常冷環(huán)境凍土、高海拔地區(qū)產(chǎn)冷適蛋白酶菌株鮮有報(bào)道。本文基于新疆凍土資源充裕，以新疆阿勒泰進(jìn)山口植物根際凍土為材料，旨在應(yīng)用微生物發(fā)酵法篩選產(chǎn)低溫蛋白酶菌株，篩選出一株產(chǎn)冷適蛋白酶的菌株，16S rDNA鑒定為沙雷氏菌(Serratia sp.)，這為冷適蛋白酶的進(jìn)一步提取純化、研究酶學(xué)特性奠定基礎(chǔ)，為開發(fā)新疆特色果蔬加工低溫酶制劑提供理論與技術(shù)支持，為新疆豐富的果蔬加工工業(yè)提供方便、高效、快捷的非熱加工方式，來保持果蔬及果蔬制品特有的風(fēng)味，色澤，營養(yǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

土樣采自新疆阿勒泰進(jìn)山口，采集時(shí)間是2012年3月，采集時(shí)環(huán)境溫度為0～10℃。將土樣置于無菌鋁盒中，做好標(biāo)記，放置保溫箱中當(dāng)天運(yùn)回，－20℃保存?zhèn)溆?ZP301細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒、DL2000 PlusDNAMarker、ZT2012 × TaqPCR MasterMix(含染料)、10mg/mL EB染色液 北京莊盟國際生物基因科技有限公司;primer1:(5'－AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG－3')primer2:(5'－AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA－3')華大基因;革蘭氏染色液［8］、1mol/L pH8.0 Tris－HCl、20mg/L 蛋白酶K 上海百祥生物科技有限公司;10mg/mL溶菌酶北京百泰克生物技術(shù)有限公司;50×TAE(Tris－乙酸)、1%溴酚藍(lán)指示劑 北京索萊寶科技有限公司;0.5μg/mL EB 染色液［9］;液體富集培養(yǎng)基 葡萄糖1.00%，蛋白胨0.50%，酵母浸粉0.50%，MgSO4·7H2O 0.02%，K2HPO40.10%，NaCl 1.00%，Na2CO31.00%，pH 7.2;LB培養(yǎng)基 蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1.0%，(固體加2%的瓊脂)，pH 7.2;選擇培養(yǎng)基 酵母浸粉0.1%，NaCl 1.0%，酪蛋白2.0%，瓊脂2.0%，pH 7.2。培養(yǎng)基均在 121℃滅菌 20min后，待用。

LD2X－30KA立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;HR40－ⅡA2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司;DHP－9162電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;DZKW－D－2電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;XSP－2CA生物顯微鏡 Motic實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;FA2104N分析天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;THZ－98A恒溫振蕩箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;050－810Tgradient48 PCR擴(kuò)增儀 德國Biometra公司;DYY－7B電泳儀 北京六一儀器廠;JY04S凝膠成像儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;MiniSpin離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株馴化 在容積100mL的三角瓶內(nèi)裝50mL生理鹽水，放幾顆玻璃珠，121℃滅菌20min，冷卻后在無菌操作臺(tái)上，將土樣加到無菌生理鹽水中，制成 1%土壤懸浮液，搖勻，待用。(注意:每隔20min震蕩一次，震蕩數(shù)次充分混勻后，在無菌操作臺(tái)上，靜置30min)

在500mL三角燒瓶內(nèi)裝50mL液體富集培養(yǎng)基，在121℃滅菌20min后冷卻，在超凈工作臺(tái)上準(zhǔn)確移取5mL上述1%的土壤懸浮液，加入到三角燒瓶中，在20℃ 200r/min培養(yǎng)1天，待用。

1.2.2 產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的初篩 在無菌操作臺(tái)上，分別取馴化好的菌懸液0.5mL，加入到4.5mL無菌生理鹽水中，用梯度稀釋法得到不同稀釋度的稀釋液，即 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7。每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿，分別移取0.1mL的菌液，移入凝固干燥后的固體初篩培養(yǎng)基平皿中，用涂布棒涂勻，在20℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察有無透明圈出現(xiàn)，將初篩得到的產(chǎn)酶菌株，挑單個(gè)菌落，在選擇培養(yǎng)基上點(diǎn)樣，20℃培養(yǎng)24～48h后，加入10%的TCA終止反應(yīng)，測量菌落直徑以及透明圈直徑。每個(gè)菌株做三個(gè)平皿，平行測量三次，取平均值。在菌落邊緣可看到透明圈的菌株即為要篩選的菌株。

1.2.3 產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的復(fù)篩 蛋白酶活力的測定:按照國標(biāo)GB/T23527－2009規(guī)定的福林酚顯色法(Folin)測酶活進(jìn)行菌株的復(fù)篩，蛋白酶活性定義:在pH7.0和40℃溫度條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸，定義為一個(gè)蛋白酶活力單位。同一個(gè)樣品測三次，取平均值。

1.2.4 產(chǎn)低溫蛋白酶菌株鑒定 用肉眼觀察平板上單個(gè)菌落的顏色、大小、形狀等特征，記錄;再用革蘭氏染色法觀察菌株的顯微鏡形態(tài)，按照文獻(xiàn)［10］對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。按照文獻(xiàn)［11－12］進(jìn)行菌株生理生化鑒定，通過李遠(yuǎn)［13］等的方法擴(kuò)增菌株的16S rDNA，擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物，送至北京六合華大公司測序，獲得的測序結(jié)果遞交GenBank數(shù)據(jù)庫中Blast，進(jìn)行相似同源性分析，Maximum likelihood法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，BOOTSTRAP分析法，選取重復(fù)1000評(píng)估樹的準(zhǔn)確性。

1.2.5 菌株生長曲線及產(chǎn)酶曲線的繪制 將菌株接入液體培養(yǎng)基中，在22℃的搖床中150r/min進(jìn)行培養(yǎng)，通過連續(xù)測定(每隔2h)液體培養(yǎng)基中細(xì)菌的OD600nm吸光值及酶活力，確定菌株生長狀況及產(chǎn)酶情況，繪制生長曲線和產(chǎn)酶曲線。

1.2.6 菌株A29－2生長特性的初步研究 將活化好的種子液以1%的接種量接入液體培養(yǎng)基中，通過連續(xù)測定液體 OD600nm吸光值，研究菌株在 4、18、20、22、25、28、30、37℃下的生長情況。測定菌株在初始pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 及質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、2.00%、4.00%、8.00%的 NaCl中22℃培養(yǎng)24h后的生長量。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的篩選

通過平板分離初篩及復(fù)篩方法，在20℃培養(yǎng)條件下恒溫孵育48h后加入10%的TCA溶液終止反應(yīng)，從植物根際土壤中篩選出9株產(chǎn)低溫蛋白酶菌株，表1是水解透明圈d1與菌落直徑d2測量結(jié)果。

從圖中可以看出，菌株A29－2和A29－3透明圈與菌落直徑之比d1/d2的值均大于3.00［14］，后續(xù)工作中測得菌株A29－2和A29－3的酶活力依次是31.88U/mL和7.04U/mL，說明透明圈的大小與酶活力的大小成正相關(guān)，故此方法可用于篩選產(chǎn)低溫蛋白酶菌株［15］。菌株A29－2的酶活力較大，作為后續(xù)工作的研究對(duì)象。

表1 菌株篩選的結(jié)果Table 1 Results of strains screening

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定 菌株A29－2在酪蛋白分離培養(yǎng)基上形態(tài)特征如圖1所示:單個(gè)菌落表面圓滑濕潤，凸起，規(guī)則圓形，呈乳白色，邊緣整齊，不透明。顯微鏡下的形態(tài)如圖2所示為單細(xì)胞呈短桿狀，不規(guī)則排列，革蘭氏陰性，無芽孢，有莢膜。

圖1 菌株A29－2的平板特征Fig.1 Plate characteristics of strain A29－2

圖2 菌株A29－2的鏡檢特征Fig.2 Microscopic characteristics of strain A29－2

2.2.2 生理生化鑒定 研究結(jié)果見表2:菌株A29－2可分解葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、L－阿拉伯糖、D－半乳糖、D－棉籽糖、D－木糖、甘露醇、甘露糖、密二糖、海藻糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖、水楊苷產(chǎn)酸。M－R實(shí)驗(yàn)、H2S實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)為陰性;接觸酶實(shí)驗(yàn)、V－P實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)為陽性;石蕊牛乳實(shí)驗(yàn)結(jié)果為牛奶結(jié)塊凝固，不變色或藍(lán)色，即酶凝。說明菌株A29－2具有產(chǎn)低溫蛋白酶的能力。

2.2.3 菌株A29－2的16S rDNA鑒定 由圖3可知，菌株A29－2 PCR擴(kuò)增出的條帶在1500bp左右，說明成功的擴(kuò)增出菌株A29－2的16S rDNA片段;將菌株A29－2的測序結(jié)果，通過NCBI進(jìn)行16S rDNA數(shù)據(jù)庫BLAST，選取序列相似度達(dá)99%的部分菌種，采用軟件DNAman和 Mega5.05，Maximum likelihood法制作系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4，菌株 A29－2與標(biāo)準(zhǔn)菌株NR_042356.1在同一支系，相似率達(dá)到99%，故菌株A29－2鑒定為沙雷氏菌(Serratia ureilytica strain_NiVa 51)。

表2 菌株A29－2生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain A29－2

圖3 菌株A29－2 PCR電泳膠圖Fig.3 PCR electrophoresis gel figure of strain A29－2

2.3 菌株生長特性的初步研究

圖4 菌株A29－2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of strain A29－2

2.3.1 菌株A29－2的生長和產(chǎn)酶曲線 通過連續(xù)測定液體培養(yǎng)基中菌株A29－2的OD600nm吸光值，由圖5可知，菌株A29－2在22℃環(huán)境中能較快生長，4～18h為對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)18h后基本達(dá)到穩(wěn)定期;在最初的8h內(nèi)酶活力幾乎沒有;20h后才漸漸開始產(chǎn)酶，此時(shí)菌株處于穩(wěn)定期;隨著菌株逐漸衰亡，產(chǎn)酶能力也越來越強(qiáng)，說明酶的產(chǎn)生發(fā)生在菌株生長的中后期。

圖5 菌株A29－2的生長和產(chǎn)酶曲線Fig.5 The growth curve and enzyme production curve of strain A29－2

2.3.2 溫度對(duì)菌株A29－2生長的影響 溫度對(duì)菌株A29－2生長的影響如圖6所示，菌株A29－2在4～30℃均能生長，且最適生長溫度為22℃，37℃不生長，表明該菌是低溫菌。在不同溫度下，培養(yǎng)18h后均陸續(xù)進(jìn)入穩(wěn)定期，且18h的生長量最大;隨著溫度的升高，菌株到達(dá)生長高峰的時(shí)間提前，加速了菌株的死亡。

圖6 溫度對(duì)菌株A29－2生長的影響Fig.6 The effect of temperature on the growth of strain A29－2

2.3.3 初始pH對(duì)菌株A29－2生長的影響 初始pH對(duì)菌株A29－2生長的影響如圖7所示，菌株A29－2在初始pH為6.0～8.0生長較快，最適初始pH為7.0。

圖7 初始pH對(duì)菌株A29－2生長的影響Fig.7 The effect of initial pH on the growth of strain A29－2

2.3.4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株A29－2生長的影響NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株A29－2生長的影響如圖8所示，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.00%～1.00%時(shí)，菌株A29－2生長最快，且最適NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%。

圖8 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)菌株A29－2生長的影響Fig.8 The effect of mass fraction of NaCl on the growth of strain A29－2

3 結(jié)論

本研究通過微生物發(fā)酵法分離篩選出9株產(chǎn)低溫蛋白酶菌株，其中菌株A29－2所產(chǎn)低溫蛋白酶活性最高，為31.88U/mL。通過微生物學(xué)鑒定方法對(duì)菌株A29－2進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA鑒定，經(jīng)序列同源性分析，鑒定該菌屬于沙雷氏菌(Serratia sp.)，該研究與遲乃玉等［15］、劉靜等［16］、全桂靜等［17］學(xué)者分離篩選所得的菌種有所不同，本研究得到一株新菌種，并對(duì)新菌種的生長特性進(jìn)行初步探討，菌株A29－2生長最適溫度為22℃，且在4℃可以生長，37℃不生長。根據(jù)耐冷菌能夠在0～5℃左右生長，最適生長溫度約20℃左右的特性，可以確定該菌為耐冷菌。且最適初始pH為7.0，在pH10.0時(shí)生長最緩慢，pH4.0時(shí)生長較緩慢，因此，該菌耐堿性差，但具有一定的耐酸性。該菌最適NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.00%，超過1.00%時(shí)，菌株生長加速死亡，所以，該菌具有一定的耐鹽性。本研究篩選的菌株A29－2為進(jìn)一步提取純化低溫蛋白酶和研究酶學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。

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