李波，包怡紅，高鋒，王振宇,*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研處，哈爾濱 150086；3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150086）

隨著自由基生物學(xué)與自由基醫(yī)學(xué)研究的迅速發(fā)展，現(xiàn)已證明自由基和人類多種疾病均有著密切關(guān)系。因此，從天然植物中尋找新的清除體內(nèi)自由基的抗氧化劑日益成為研究熱點(diǎn)。多酚類物質(zhì)作為植物抗氧化的主要活性成分之一，由于其來源廣泛、抗氧化活性強(qiáng)和安全性高等特點(diǎn)，一直備受關(guān)注。

近年來研究發(fā)現(xiàn)松科植物體內(nèi)含有大量多酚類物質(zhì)，該類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化活性。蘇曉雨等[1]從紅松種皮中提取的多酚對(duì)羥自由基、超氧自由基、DPPH自由基都有很好的清除作用，Liazid等[2]從松樹種子中提取的多酚能阻止脂質(zhì)過氧化，Jeong等[3]從松針中提取的多酚能抑制DNA的氧化損傷。

我國紅松資源豐富，但對(duì)其多酚類物質(zhì)的研究還很少。紅松松球鱗片作為松子的副產(chǎn)物，常常被廢棄，因此有必要綜合開發(fā)利用該資源。本文在利用AB-8大孔樹脂純化紅松松球鱗片多酚的基礎(chǔ)上[4]，選擇Sephadex LH-20對(duì)其進(jìn)一步純化，以期得到高純度多酚類物質(zhì)，并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，為進(jìn)一步揭示紅松松球鱗片多酚生物活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松松球鱗片多酚的初級(jí)純化物：紅松松球鱗片粉末經(jīng)乙醇提取和AB-8樹脂純化后的凍干粉，純度35.07%。Sephadex LH-20購自Pharmacia公司，DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenl)-1-picrylhydrazyl)、ABTS（2,2’-Azino-bis-(3-ethyl benzoth-iazoline-6-sulfonic acid）、BHT（2,6-Di-tert-butyl-4-methylphenol）購自Sigma公司，VC購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司，EDTA-Na2（乙二胺四乙酸二鈉）購自天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，新銅試劑購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

DK-8D型電熱恒溫水槽（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SHB-ⅢG循環(huán)式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；FA2004型電子天平（上海天平儀器廠）；722型可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；FD-1E-50冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BSZ-160F電腦自動(dòng)部份收集器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多酚含量（濃度）的測(cè)定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，配置成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各吸取1 mL試液于25 mL容量瓶中，分別加入福林酚試劑2 mL，充分振蕩后靜置3～4 min，加入10%碳酸鈉溶液10 mL，蒸餾水定容，50 ℃水浴1 h，測(cè)定765 nm處的吸光值[5]。測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=3.7955C+0.02，其中A表示吸光值，C表示沒食子酸濃度（mg/mL）。多酚含量計(jì)算公式如下：

式中，N為稀釋倍數(shù)，A′為1mL稀釋液的吸光值。

1.2.2 多酚純度的測(cè)定

稱取一定質(zhì)量的凍干粉并復(fù)溶，按照公式（1）測(cè)得多酚濃度，其純度計(jì)算公式如下：

式中，V為凍干樣品復(fù)溶后溶液的體積（mL），A″為凍干樣品復(fù)溶后1mL溶液的吸光值，m為凍干樣品的質(zhì)量（mg）。

1.2.3 Sephadex LH-20純化方法

取 20g Sephadex LH-20凝膠經(jīng)溶脹預(yù)處理后，采用逐步沉降法裝柱，最后柱體積為72mL，其中柱長(zhǎng)36cm，柱直徑1.6cm。取3ml濃度為50mg/mL的多酚樣品溶液上樣，待樣品液全部入柱后，用50%乙醇洗脫3倍柱體積，洗脫液流出速度0.8mL/min，每5min收集1管，共收集54管。對(duì)每管收集液進(jìn)行紫外掃描，波長(zhǎng)范圍200-400nm，將具有相同或相似峰型的收集液合并，得到不同的組分，凍干后測(cè)定各組分純度，選取高純度的多酚組分（High purity polyphenols，HPP）進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)。

1.2.4 HPP清除DPPH自由基能力測(cè)定

參考Liu等[6]的方法。量取不同濃度的HPP樣液（10～100μg/mL）1mL于試管中，加入3mL濃度為0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，立即混勻，室溫下避光放置30min，517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)1；無水乙醇代替HPP樣液，測(cè)定吸光值A(chǔ)0；無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測(cè)定吸光值A(chǔ)2。按照式（3）計(jì)算清除率。

1.2.5 HPP清除ABTS自由基能力測(cè)定

參考Marino等[7]的方法。稱取一定量的ABTS和過硫酸鉀，分別配成濃度為7.4mmol/L和2.6mmol/L的溶液，按體積比1:1混合，室溫避光靜置12h，制得ABTS自由基儲(chǔ)備液，于 4℃條件下保存，臨用前稀釋至一定濃度作為工作液，使其在 734nm波長(zhǎng)處的吸光值為0.700±0.020。準(zhǔn)確量取不同濃度的HPP樣液（20～200μg/mL）0.1mL，加入ABTS自由基工作液2.9mL，室溫下避光反應(yīng)6min后，測(cè)定734nm波長(zhǎng)處的吸光值A(chǔ)1；蒸餾水代替HPP樣液，測(cè)定吸光值A(chǔ)0；蒸餾水代替ABTS自由基工作液，測(cè)定吸光值A(chǔ)2。按照式（3）計(jì)算清除率。

1.2.6 HPP清除羥自由基能力測(cè)定

參考李姣等[8]的方法。向離心管中依次加入6mmol/L的硫酸亞鐵溶液1mL和6mmol/L的過氧化氫溶液1mL，混勻后加入不同濃度的HPP樣液（0.1～1mg/mL）1mL，靜置10min后，加入6mmol/L的水楊酸溶液1mL，振蕩均勻后于37℃水浴30min，然后5000r/min離心 10min，取上清液于 510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值 A1；蒸餾水代替 HPP樣液，測(cè)定吸光值A(chǔ)0；蒸餾水代替水楊酸，測(cè)定吸光值A(chǔ)2。按照式（3）計(jì)算清除率。

1.2.7 HPP還原鐵離子能力測(cè)定

采用鐵氰化鉀還原法[9]。量取不同濃度的HPP樣液（30～300μg/mL）0.5mL于離心管中，分別加入pH為6.6的磷酸鹽緩沖液（PBS）1.25mL、1%的鐵氰化鉀溶液1.25mL，混均后于50℃水浴20min，冷卻后加入10%的三氯乙酸溶液 1.25mL，充分振蕩后5000r/min離心 10min。取離心后的上清液 1.25mL，依次加入蒸餾水 1.25mL、0.1%的三氯化鐵溶液0.5mL，混勻后靜置10min，于700nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值A(chǔ)1；蒸餾水代替HPP樣液，測(cè)定吸光值A(chǔ)2。按照式（4）計(jì)算還原力。

1.2.8 HPP還原銅離子能力測(cè)定

參考Gü l? in等[10]的方法。準(zhǔn)確量取不同濃度的HPP樣液（50～500μg/mL）0.5mL，依次加入10mmol/L硫酸銅溶液0.1mL、7.5mmol/L新銅試劑0.1mL，最后加入蒸餾水至總體積3mL，室溫下反應(yīng)30min后于450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，以吸光值（A450nm）表示還原銅離子能力。

1.2.9 HPP螯合亞鐵離子能力測(cè)定

參考張博文等[11]的方法。向離心管中依次加入不同濃度的 HPP樣液（0.3～3mg/mL）1mL和0.05%的硫酸亞鐵溶液2mL，振蕩均勻后于37℃水浴30min，再加入0.1%的鄰菲羅啉0.5mL，混勻后于37℃水浴10min，然后5000r/min離心10min，取上清液于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)1；蒸餾水代替HPP樣液，測(cè)定吸光值A(chǔ)0；蒸餾水代替鄰菲羅啉，測(cè)定吸光值A(chǔ)2。按照式（3）計(jì)算螯合率。

1.2.10 HPP抑制卵黃脂質(zhì)過氧化能力測(cè)定

參考張爾賢等[12]的方法。用0.1mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）配制體積分?jǐn)?shù)4%的卵黃懸液。量取0.2mL卵黃懸液于試管中，加入不同濃度的HPP樣液（0.1-1mg/mL）1mL、25mmol/L硫酸亞鐵溶液0.2mL，用PBS緩沖液補(bǔ)齊至2mL，混勻后37℃水浴振蕩15min，取出后加入1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸，7000r/min離心10min。取上清液2mL并加入1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%硫代巴比妥酸，加塞，沸水浴保持30min，冷卻后于532nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值A(chǔ)1，蒸餾水代替HPP樣液，測(cè)定吸光值A(chǔ)0；蒸餾水代替卵黃懸液，測(cè)定吸光值A(chǔ)2。按照式（3）計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sephadex LH-20純化效果分析

圖1 Sephadex LH-20分離到的組分1和組分2的紫外光譜圖Fig.1 UV spectra of partⅠand partⅡHPP of Sephadex LH-20

對(duì)54管收集液逐一進(jìn)行紫外掃描后發(fā)現(xiàn)，3-20管收集液的光譜峰型基本一致，將其合并得到組分1；21-54管收集液的光譜峰型基本一致，將其合并得到組分2。組分1和組分2的紫外光譜如圖1所示。由圖1可知，組分1和組分2的紫外光譜曲線差異明顯，組分1的吸收峰在240nm和300nm附近，組分2的吸收峰在240nm和280nm附近。組分1和組分2凍干后，按照式（2）計(jì)算純度。結(jié)果表明，組分1的純度30.01%，略低于初級(jí)純化物的純度，但組分 2的純度有了顯著的提高，達(dá)到了 95.86%。故選擇組分 2（High purity polyphenols，HPP）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 HPP對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖2 HPP、VC及BHT的清除DPPH自由基能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of HPP, VC and BHT

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，當(dāng)有供氫能力的抗氧化劑存在時(shí)，其單電子被結(jié)合而使其顏色減褪，顏色減褪的程度與抗氧化劑清除自由基的能力存在定量關(guān)系。圖2所示的是HPP樣液及陽性對(duì)照VC和BHT對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果。由圖2可以看出，BHT對(duì)DPPH自由基的清除作用很弱，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，清除率最高才達(dá)到20.34%；HPP和VC則對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出很強(qiáng)的清除作用，隨著樣液濃度的增加，清除率都明顯提高，當(dāng)HPP和VC濃度分別達(dá)到50μg/mL和30μg/mL后，清除率趨于平緩，不在升高。相比而言，HPP（IC50=20.48μg/mL）的清除效果要低于VC（IC50=12.76μg/mL）。

2.3 HPP對(duì)ABTS自由基的清除作用

圖3 HPP、VC及BHT的清除ABTS自由基能力Fig.3 ABTS radical scavenging activity of HPP, VC and BHT

ABTS法，最早由Miller等人提出，用于測(cè)定生物樣品的抗氧化能力。目前，該法已廣泛應(yīng)用于蔬菜、水果抗氧化活性的評(píng)價(jià)和天然抗氧化物質(zhì)的篩選[13]。無色的 ABTS經(jīng)活性氧氧化后能夠生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基，即ABTS+·，當(dāng)有供氫能力的抗氧化劑作用時(shí)，ABTS+·被還原成無色的ABTS。圖3所示的是HPP、VC和BHT對(duì)ABTS自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明，隨著濃度的增加，HPP、VC和BHT對(duì)ABTS自由基清除作用增強(qiáng)，呈現(xiàn)很好的量效關(guān)系。同等條件下，VC的清除效果最好（IC50=66.79μg/mL），HPP（IC50=86.59μg/mL）次之，BHT（IC50=146.11μg/mL）最弱。

2.4 HPP對(duì)羥自由基的清除作用

圖4 HPP、VC及BHT清除羥自由基能力Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of HPP, VC and BHT

羥自由基是活性氧中化學(xué)性質(zhì)最活潑的自由基，他幾乎能與細(xì)胞中任何生物大分子發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)速度極快，是對(duì)機(jī)體危害最大的自由基[14]。過氧化氫和亞鐵離子的混合體系能夠啟動(dòng) fenton反應(yīng)，產(chǎn)生羥自由基，而水楊酸可以捕獲體系中的羥自由基并生成有顏色的物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm波長(zhǎng)處有最大吸收，當(dāng)反應(yīng)體系中加入具有清除羥自由基作用的樣品時(shí)，該吸光值降低，通過測(cè)定反應(yīng)體系吸光值的變化可以確定樣品的清除作用。圖 4所示的是HPP、VC和BHT對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果。由圖可以看出，在濃度較低時(shí)，HPP對(duì)羥自由基的清除效果略微高于VC，但當(dāng)濃度超過0.3mg/mL后，VC的清除能力明顯優(yōu)于 HPP?？傮w來看，HPP對(duì)羥自由基的清除能力（IC50=0.45mg/mL）不如 VC（IC50=0.31mg/mL），但優(yōu)于BHT（IC50=0.86mg/mL）。

2.5 HPP還原鐵離子能力

圖5 HPP、VC及BHT還原鐵離子能力Fig.5 Fe3+ reducing ability of HPP, VC and BHT

抗氧化劑能將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀再與三價(jià)鐵作用，生成普魯士蘭，通過測(cè)定普魯士蘭的生成量即可確定樣品的還原力。還原力的測(cè)定,實(shí)質(zhì)上是檢驗(yàn)物質(zhì)是否為良好的電子供應(yīng)者的過程。圖5所示的是HPP、VC和BHT還原鐵離子能力的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明，HPP有較好的還原鐵離子能力，吸光值隨著濃度的增加而增大，而且與同濃度下VC的還原能力相近，明顯高于BHT。

2.6 HPP還原銅離子能力

圖6 HPP、VC及BHT還原銅離子能力Fig.6 Cupric ion-reducing ability of HPP, VC and BHT

Cu2+在有抗氧化劑存在時(shí)，被還原成Cu+，后者能與新亞銅試劑生成黃色絡(luò)合物，該絡(luò)合物生成的量越多，說明抗氧化劑的還原能力越強(qiáng)。圖6所示的是HPP、VC和BHT還原銅離子能力的測(cè)定結(jié)果。由圖可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，BHT基本沒有還原銅離子的能力，而HPP卻展現(xiàn)了很好的還原效果，但其還原銅離子的能力還是要弱于VC。

2.7 HPP螯合亞鐵離子能力

圖7 HPP和EDTA-Na2螯合亞鐵離子能力Fig.7 Fe2+ chelating activity of HPP and EDTA-Na2

亞鐵離子能與鄰菲羅啉發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成桔紅色絡(luò)合物，其顏色深淺與反應(yīng)體系中游離的亞鐵離子含量成正相關(guān)。因此，反應(yīng)體系的顏色越淺，說明游離的亞鐵離子越少，即樣品的鰲合能力越強(qiáng)。圖7所示的是HPP樣液及陽性對(duì)照EDTA-Na2螯合亞鐵離子的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明，隨著濃度的增大，HPP螯合亞鐵離子的能力逐漸增強(qiáng)，展現(xiàn)了很好的量效關(guān)系，IC50=2.14mg/mL，但其作用效果不及陽性對(duì)照EDTA-Na2（IC50=0.67mg/mL）。在濃度1.2mg/mL時(shí)，HPP的鰲和率僅為24.75%，而EDTA-Na2的鰲合率已達(dá)到94.80%，隨著樣液濃度的繼續(xù)加大，HPP的鰲合率由32.59%增加到74.15%，而EDTA-Na2的鰲合率一直在99%左右。

2.8 HPP抑制卵黃脂質(zhì)過氧化的能力

圖8 HPP、VC及BHT抑制卵黃脂質(zhì)過氧化能力Fig.8 Inhibiting yelk peroxidation ability of HPP, VC and BHT

卵黃磷脂C-2位上所含極低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）中的不飽和脂肪酸（PUFA）在鐵離子催化下，經(jīng)振蕩，能誘發(fā)過氧化，產(chǎn)生烷氧基（LO·）和烷過氧基（LOO·），再引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，加熱的條件下，過氧化產(chǎn)物可與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成紅色絡(luò)合物[15]。當(dāng)有抗氧化劑存在時(shí)，鏈?zhǔn)椒磻?yīng)被阻斷，紅色絡(luò)合物的生成量減少，通過測(cè)定其減少程度即可表征樣品抑制卵黃脂質(zhì)過氧化的能力。圖8所示的是HPP樣液及陽性對(duì)照VC和BHT抑制卵黃脂質(zhì)過氧化能力的測(cè)定結(jié)果。由圖8可以看出，HPP對(duì)卵黃脂質(zhì)過氧化有很好的抑制作用，其作用效果（IC50=0.33mg/mL）優(yōu)于VC（IC50=0.66mg/mL），但卻明顯不及BHT。BHT在濃度為0.3mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到了92.99%，此時(shí)HPP的抑制率為43.81%。

3 結(jié)論

采用SephadexLH-20分離純化紅松松球鱗片多酚提取物，獲得了純度90%以上的多酚樣品。但 SephadexLH-20只適合實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的應(yīng)用。所以仍需要繼續(xù)探討紅松松球鱗片多酚提取物的純化方法，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

HPP對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基和羥自由基的清除能力都優(yōu)于BHT，但卻弱于VC其IC50分別為VC的1.61倍、1.30倍和1.45倍；HPP還原Fe3+和Cu2+的能力明顯強(qiáng)于BHT，其還原Fe3+能力與VC相似，還原Cu2+能力略低于VC；HPP鰲合Fe2+的能力不及EDTA-Na2，其IC50為EDTA-Na2的3.19倍；HPP抑制卵黃脂質(zhì)過氧化的能力雖然不及BHT，但卻強(qiáng)于VC，其IC50為VC的0.5倍。

體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，HPP有很好的清除自由基能力和還原能力，能有效的抑制卵黃脂質(zhì)過氧化，是一種具有開發(fā)潛力的天然抗氧化劑。

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