高 萌， 王躍生， 魏惠珍， 歐陽(yáng)輝， 何明珍，曾戀情， 申峰云， 郭 強(qiáng)， 饒 毅＊

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330004；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌330006；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700）

麻杏石甘湯最早見(jiàn)于漢代張仲景所著《傷寒論》一書(shū)，由麻黃、苦杏仁、石膏、甘草4味藥材組成。具有辛涼宣泄，清肺平喘功效。其中苦杏仁為常用止咳平喘藥，有小毒，歸肺、大腸經(jīng)［1］。苦杏仁中的有效成分是苦杏仁苷（amygdalin，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）?？嘈尤受諡獒t(yī)藥上常用的祛痰止咳劑、輔助性抗癌藥［2］，苦杏仁含有苦杏仁苷約2.4%，苦杏仁苷受杏仁中的苦杏仁酶及櫻葉酶等水解，依次生成野黑櫻苷（prunasin，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）和扁桃腈，再分解生成苯甲酸和氫氰酸［3］。

近年來(lái)對(duì)于復(fù)雜成分的定性和定量分析，尤其是人或動(dòng)物體液中微量成分的測(cè)定方面，液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用作為一種高效互補(bǔ)的分離鑒定技術(shù)，具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用［4－6］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［7－11］，目前采用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)大鼠體內(nèi)苦杏仁苷的研究存在定量限較高，樣品處理復(fù)雜，且在口服藥物后未能檢測(cè)到苦杏仁苷原型的問(wèn)題，而對(duì)苦杏仁苷代謝產(chǎn)物僅有定性分析。另?yè)?jù)報(bào)道，對(duì)大鼠進(jìn)行苦杏仁生品水煎液灌胃給藥和苦杏仁苷注射給藥，結(jié)果顯示苦杏仁苷注射給藥后在血漿樣品中可檢測(cè)到苦杏仁苷原型，而灌胃給藥后則未檢測(cè)到原型，只能檢測(cè)到其代謝產(chǎn)物野黑櫻苷［12－14］。本研究首先采用液相色譜－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC－QTOF－MS／MS）聯(lián)用技術(shù)，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)測(cè)定及MS／MS分析大鼠灌胃麻杏石甘湯后的血漿樣品，檢測(cè)到了代謝產(chǎn)物野黑櫻苷及苦杏仁苷原型，同時(shí)使用液相色譜－三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC－Q－TRAP－MS）對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量分析，為探討麻杏石甘湯中苦杏仁活性成分的體內(nèi)變化過(guò)程提供科學(xué)參考。

圖1 苦杏仁苷和野黑櫻苷的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of amygdalin and prunasin

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

儀器：島津LC－30A液相色譜－AB Triple TOF 5600四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（數(shù)據(jù)采集Analyst TF 1.6 ABsciex；數(shù)據(jù)分析Peak View software Version 1.2.0.3）；島津 LC－30A 液相色譜－AB QTRAP4500三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（數(shù)據(jù)采集Analyst 1.6.1 ABsciex）；萬(wàn)分之一天平（AB104－N，梅特勒－托利多）；十萬(wàn)分之一天平（島津AUW2200電子分析天平）；超聲波清洗儀（KQ－250DB，昆山市超聲儀器有限公司）；Milli－Q超純水儀（美國(guó) Millipore公司）；臺(tái)式離心機(jī)：TGL－16C（上海安亭科學(xué)儀器廠）；渦旋儀：IKA Vortex Genius 3；低溫保存箱：DW－40L262（青島海爾特種電器有限責(zé)任公司）。

對(duì)照品：苦杏仁苷對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)110820－201004）；野黑櫻苷對(duì)照品購(gòu)自碧伊（上海）化學(xué)科技有限公司（批號(hào)BBP02178）；氯霉素（chloramphenicol，內(nèi)標(biāo)）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)130303－200614）。

試劑：甲酸、甲酸銨（Sigma公司）；乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷（分析純，上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司）；水：娃哈哈純凈水，經(jīng)Millipore超純水儀過(guò)濾；HPLC級(jí)甲醇、乙腈（Fisher公司）。

飲片：生麻黃（北京市雙橋燕京中藥飲片廠，批號(hào)812018）、炙甘草（北京市雙橋燕京中藥飲片廠，批號(hào)1003035）、制苦杏仁（江中（武寧）中藥飲片有限公司，批號(hào)120130）、生石膏（北京市雙橋燕京中藥飲片廠，批號(hào)908089）。

動(dòng)物：清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重為（220±20）g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2011－0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和工作溶液的配制

精密稱取苦杏仁苷、野黑櫻苷和氯霉素對(duì)照品適量置于25 mL容量瓶中，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為84.0、99.6和12.4 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冷藏，備用。

分別吸取不同體積的苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為 4 200、2 100、1 050、525.00、105.00、52.50、10.50、5.25、1.05 和 0.53 ng／mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別吸取不同體積的野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為2 490、1 245、622.50、249.00、124.50、24.90、12.45、6.23、1.25和0.62 ng／mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別吸取苦杏仁苷和野黑櫻苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各10 mL置于20 mL容量瓶中混合，用甲醇逐級(jí)稀釋成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中苦杏仁苷質(zhì)量濃度分別為 4 200、2 100、1 050、525.00、105.00、52.50、10.50、5.25、1.05和0.53 ng／mL；野黑櫻苷質(zhì)量濃度 分 別 為 2 490、1 245、622.50、249.00、124.50、12.45、6.23、1.25和0.62 ng／mL。

1.2.2 麻杏石甘湯藥液的煎煮

按麻杏石甘湯處方比例（麻黃、杏仁、石膏和甘草質(zhì)量比為6∶6∶24∶6）取各味飲片，先稱取麻黃藥材、石膏藥材，加入方藥總質(zhì)量的8倍水，稱重，計(jì)算煎煮前的總重。加熱至沸騰，然后改用小火煎煮30 min，再加入甘草、苦杏仁煎煮40 min，補(bǔ)重，趁熱過(guò)濾，即得麻杏石甘湯湯劑，于80℃旋轉(zhuǎn)濃縮至1 g／mL藥液。密封后－20℃儲(chǔ)存，備用。

1.2.3 給藥與樣品采集

健康SD大鼠，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水，灌胃1.2.2項(xiàng)下制得的麻杏石甘湯藥液，連續(xù)7天，在末次給藥1 h后，大鼠心臟取血至含肝素鈉的EP離心管中，立即離心3 000 r／min×10 min后取上層血漿分裝，置于－40℃冰箱中冰凍待測(cè)。

1.2.4 血漿樣品處理

精密吸取100μL血漿，加入30μL內(nèi)標(biāo)溶液，加入1 mL的乙酸乙酯，渦旋混合提取5 min，離心5 000 r／min×5 min，將有機(jī)層轉(zhuǎn)移至另一離心管中，再加入1 mL的乙酸乙酯與水層渦旋混合提取5 min，離心 5 000 r／min×5 min，合并兩次乙酸乙酯液，合并液用N2在40℃下吹干，殘?jiān)?00μL甲醇溶解，渦旋5 min，離心 15 000 r／min×5 min，取上清液，待測(cè)。

1.3 儀器分析條件

1.3.1 色譜條件

定性色譜條件：Shim－pack XR－ODSⅢ（75 mm×2.0 mm，1.6μm）；柱溫40℃；進(jìn)樣量5μL；流速0.25 mL／min；流動(dòng)相 A 為0.1%（v／v）甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序：0～1.5 min，1%B；1.5～7.0 min，1%B～10%B；7.0～10.0 min，10%B～20%B；10.0～15.0 min，20%B～90%B；15.0～17.0 min，90%B；17.1～20.0 min，1%B。

定量色譜條件：Agilent C18（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；柱 溫 40 ℃；進(jìn) 樣 量 2μL；流 速 0.3 mL／min；流動(dòng)相 A為0.1%（v／v）甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.05 min，1%B；0.05～1.70 min，1%B～63%B；1.70～2.00 min，63%B～90%B；2.00～3.00 min，90%B；3.01～4.00 min，1%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

定性條件：AB Triple TOF 5600四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采用電噴霧離子化（ESI）源，噴霧電壓（IS）：－4 500 V，離子化溫度（TEM）：600℃；霧化氣（GS1）：413 685 Pa；輔助加熱氣（GS2）：482 633 Pa；氣簾氣（CUR）：206 843 Pa；碰撞氣（CAD）：Medium；掃描模式：Negative。一級(jí)質(zhì)譜采集范圍為m／z 100～800，累積時(shí)間200 ms，二級(jí)質(zhì)譜采集范圍為m／z 90～800，累積時(shí)間100 ms，碰撞能量（CE）40 eV；碰撞能量疊加（CES）15。

定量條件：AB Q－TRAP 4500三重四極桿質(zhì)譜儀采用ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式測(cè)定；噴霧電壓（IS）：－4 500 V，離子化溫度（TEM）：600℃；霧化氣（GS1）：413 685 Pa；輔助加熱氣（GS2）：482 633 Pa；氣簾氣（CUR）：206 843 Pa；碰撞氣（CAD）：Medium；優(yōu)化的各離子對(duì)質(zhì)譜參數(shù)值見(jiàn)表1。

表1 MS／MS定量分析參數(shù)Table 1 Parameters for MS／MS quantitative analysis

2 結(jié)果與討論

2.1 定性方法的建立與優(yōu)化

野黑櫻苷（分子式為C14H17NO6）為苦杏仁苷（分子式為C20H27NO11）脫去一分子糖而得，均含有N原子，因此首先對(duì)其選擇正離子掃描進(jìn)行分析。在前期實(shí)驗(yàn)中，采用超高效液相色譜－串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀在正離子模式下對(duì)待測(cè)物分析，未發(fā)現(xiàn)野黑櫻苷［M＋H］＋峰。在m／z 318附近有一未知物，初步推斷可能為野黑櫻苷［M＋Na］＋峰，但進(jìn)一步分析該化合物發(fā)現(xiàn)其二級(jí)質(zhì)譜與野黑櫻苷無(wú)相關(guān)性，可能為一未知干擾物。為驗(yàn)證結(jié)果，使用了超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)未知物和野黑櫻苷及苦杏仁苷進(jìn)行分析，通過(guò)提取精確相對(duì)分子質(zhì)量，擬合元素組成，偏差小于5 ppm，苦杏仁苷一級(jí)質(zhì)譜圖中顯示 m／z為 480.146 7（圖2 a1），推測(cè)為［M＋Na］＋分子離子峰，二級(jí)質(zhì)譜圖中信號(hào)最強(qiáng)的m／z為 347.095 3（圖2 a2），推測(cè)為母離子脫去中性碎片扁桃腈（C8H7NO），野黑櫻苷一級(jí)質(zhì)譜圖（圖2 b1）中顯示m／z為 318.094 0，推測(cè)為［M＋Na］＋分子離子峰，同時(shí)圖中存在一個(gè)與野黑櫻苷母離子精確質(zhì)量數(shù)（m／z 318.094 0）相近的質(zhì)量數(shù)（m／z 318.307 6）。這兩個(gè)精確質(zhì)量數(shù)在四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜中可以分辨，但是在分辨率低的三重四極桿質(zhì)譜中難以區(qū)分，因此對(duì)此未知干擾物進(jìn)行了二級(jí)質(zhì)譜確證，圖2 b2為野黑櫻苷和未知干擾物的二級(jí)質(zhì)譜碎片信息。野黑櫻苷母離子（m／z 318.095 4）和干擾物母離子（m／z 318.301 5）的子離 子 為 m／z 256.263 9、185.042 7、88.076 5。 通過(guò)對(duì)子離子擬合分子式，得知子離子不是野黑櫻苷的子離子，可能為未知物的子離子，并對(duì)野黑櫻苷產(chǎn)生干擾；改變碰撞能量，干擾離子一直存在，對(duì)大鼠灌胃麻杏石甘湯后的血漿樣品處理并進(jìn)行質(zhì)譜分析，同樣存在未知物干擾，且信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)大于待測(cè)物，干擾儀器測(cè)定。通過(guò)對(duì)對(duì)照品及血漿樣品在該模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果均存在未知物干擾，因此在采用三重四極桿質(zhì)譜儀定量分析時(shí)要避免采用未知物的子離子為定量離子對(duì)。

圖2 苦杏仁苷在正離子條件下的（a1）一級(jí)譜圖、（a2）二級(jí)譜圖及野黑櫻苷在正離子條件下的（b1）一級(jí)譜圖、（b2）二級(jí)譜圖Fig.2 （a1）MS spectrum and（a2）MS／MS spectrum of amygdalin and（b1）MS spectrum and（b2）MS／MS spectrum of prunasin in positive ion mode

苦杏仁苷在液相色譜電噴霧電離質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的正負(fù)離子模式下有良好的信號(hào)響應(yīng)［15］。選擇負(fù)離子模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過(guò)母離子掃描獲得一級(jí)質(zhì)譜圖，均找到［M＋HCOO］－分子離子峰，苦杏仁苷和野黑櫻苷的母離子分別是m／z 502.157 1 和m／z 340.104 3。在負(fù)離子條件下，野黑櫻苷響應(yīng)值較高，母離子精確質(zhì)量數(shù)周圍未發(fā)現(xiàn)干擾離子，有利于其檢測(cè)。在選定母離子后，進(jìn)行子離子掃描獲得二級(jí)質(zhì)譜圖，苦杏仁苷的主要特征碎片離子為m／z 323.097 7，野黑櫻苷的主要特征碎片離子為m／z 161.044 4，通過(guò)對(duì)特征碎片離子擬合元素組成，偏差小于5 ppm，分析為母離子脫去C8H8NO－碎片離子產(chǎn)生，結(jié)果見(jiàn)圖3。使用超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀在負(fù)離子模式對(duì)大鼠灌胃麻杏石甘湯后的血漿樣品定性分析，確認(rèn)苦杏仁苷原型和代謝產(chǎn)物野黑櫻苷的存在，并且無(wú)干擾物影響野黑櫻苷的測(cè)定。

圖3 苦杏仁苷在負(fù)離子條件下的（a1）一級(jí)譜圖、（a2）二級(jí)譜圖及野黑櫻苷在負(fù)離子條件下的（b1）一級(jí)譜圖、（b2）二級(jí)譜圖Fig.3 （a1）MS spectrum and（a2）MS／MS spectrum of amygdalin and（b1）MS spectrum and（b2）MS／MS spectrum of prunasin in negative ion mode

2.2 定量方法的建立與優(yōu)化

質(zhì)譜監(jiān)測(cè)采用LC－QTOF－MS／MS定性分析時(shí)負(fù)離子模式下的離子對(duì)。在優(yōu)化色譜條件時(shí)考察了不同流動(dòng)相體系（乙腈－甲酸水溶液和乙腈－水溶液）下待測(cè)物質(zhì)的響應(yīng)，結(jié)果顯示在水相中添加適量甲酸有助于待測(cè)物質(zhì)電離，信號(hào)強(qiáng)度明顯提高。因此，本實(shí)驗(yàn)采用乙腈－0.1%（v／v）甲酸水溶液作為流動(dòng)相，獲得了最佳質(zhì)譜靈敏度。

2.3 樣品前處理方法的選擇與優(yōu)化

血漿樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，用有機(jī)溶劑（甲醇、乙腈）沉淀蛋白法處理樣品，內(nèi)源性物質(zhì)干擾較大，提取回收率低于液－液萃取法。本研究采用液－液萃取法對(duì)樣品進(jìn)行處理。考察了不同萃取溶劑（乙酸乙酯、乙酸乙酯－乙醚、二氯甲烷）、萃取次數(shù)及不同體積萃取溶劑等因素對(duì)回收率的影響。結(jié)果見(jiàn)表2，以乙酸乙酯作為萃取溶劑時(shí)，2 mL萃取溶劑分兩次萃取，可獲得較高的靈敏度和回收率，適用于體內(nèi)微量成分的定量。

表2 采用不同方式、不同溶劑處理大鼠血漿樣品時(shí)苦杏仁苷及野黑櫻苷的回收率Table 2 Recoveries of amygdalin and prunasin in rat plasma with different methods and different solvents

2.4 定量方法的驗(yàn)證

2.4.1 方法專屬性

分別取大鼠空白血漿6份，加入苦杏仁苷和野黑櫻苷的混合對(duì)照品溶液及灌胃麻杏石甘湯后的含藥血漿，按1.2.4項(xiàng)下方法處理，分別進(jìn)樣測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖4，在上述定量色譜及質(zhì)譜條件下，4 min內(nèi)可測(cè)得大鼠血漿中苦杏仁苷及其代謝產(chǎn)物野黑櫻苷，血漿中內(nèi)源性成分不干擾目標(biāo)組分的測(cè)定。本方法分析速度快、專屬性高。

2.4.2 定量限、檢出限和方法的線性范圍

取1.2.1項(xiàng)下用甲醇配制好的10個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液各100μL，分別加入至空白血漿中并按1.2.4項(xiàng)下方法處理，分別進(jìn)樣2μL，以血漿中各成分的質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)，以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值Y 為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（W＝1／X2）最小二乘法進(jìn)行回歸，得各化合物在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)的線性方程、線性相關(guān)系數(shù)（r）、定量限（LOQ，S／N≥10）和檢出限（LOD，S／N＝3），結(jié)果見(jiàn)表3。

圖4 （a）空白大鼠血漿、（b）空白大鼠血漿添加苦杏仁苷、野黑櫻苷、氯霉素和（c）大鼠灌胃麻杏石甘湯后血漿樣品的提取離子色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatograms of amygdalin，prunasin and chloramphenicol in（a）blank rat plasma，（b）blank plasma spiked with amygdalin，prunasin and chloramphenicol，（c）plasma sample obtained60 min after intragastric（ig）administration of Maxing shigan decoction

表3 苦杏仁苷和野黑櫻苷的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和檢出限Table 3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients（r），LOQs，LODs of amygdalin and prunasin

2.4.3 精密度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)

在空白血漿中分別添加高、中、低3個(gè)水平的對(duì)照品溶液，每個(gè)水平5份，按1.2.4項(xiàng)下方法處理，苦杏仁苷和野黑櫻苷的平均回收率為82.33%～95.25%，日內(nèi)RSD和日間RSD分別為3.22%～7.89%和5.73%～9.19%。按1.2.4項(xiàng)下方法處理6種不同來(lái)源空白血漿各100μL，在處理后的空白樣本中加入高、中、低3個(gè)濃度混合對(duì)照品溶液與內(nèi)標(biāo)溶液，進(jìn)樣分析，比較其與同濃度的對(duì)照品溶液響應(yīng)值，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 苦杏仁苷和野黑櫻苷在不同添加濃度下的回收率、精密度和基質(zhì)效應(yīng)Table 4 Recoveries，precisions and effects of matrix of amygdalin and prunasin at different spiked levels

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品并測(cè)定，考察待測(cè)物在各種實(shí)驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性。在空白血漿中分別添加高、中、低3個(gè)水平的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.4項(xiàng)下方法處理，處理后在23℃下2 h內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣；4℃下24 h內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣；標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品經(jīng)－40℃反復(fù)凍融3次后測(cè)定；標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品經(jīng)－40℃條件下貯存30天，考察樣品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表5，含苦杏仁苷、野黑櫻苷的血漿樣品在23℃條件下放置2 h，4℃條件下放置24 h，－40℃反復(fù)凍融3次及－40℃冰凍條件下放置30天條件下各成分的穩(wěn)定性均良好，能滿足測(cè)定要求。

表5 苦杏仁苷和野黑櫻苷在不同添加濃度下的穩(wěn)定性Table 5 Stability of amygdalin and prunasin at different spiked levels

2.5 血漿中苦杏仁苷及野黑櫻苷的含量測(cè)定與分析

研究證實(shí)，麻杏石甘湯具有提高動(dòng)物免疫能力、抗菌、抗過(guò)敏［16，17］等作用，能有效抑制咳嗽的產(chǎn)生?！半S證施量”是中醫(yī)臨床應(yīng)用中主要的診療模式，隨證施量是依據(jù)臨床癥狀，改變藥物用量，以達(dá)到增強(qiáng)療效的作用。麻杏石甘湯在用于治療咳嗽等病癥時(shí)，主要通過(guò)改變苦杏仁用量來(lái)調(diào)整療效。

實(shí)驗(yàn)建立了枸櫞酸所致大鼠咳嗽模型，研究在此模型下麻杏石甘湯治療咳嗽的作用效果，通過(guò)改變麻杏石甘湯中苦杏仁劑量，探索苦杏仁劑量與苦杏仁中活性成分在體內(nèi)血藥濃度的量效關(guān)系。為后期研究苦杏仁劑量與苦杏仁中活性成分在體內(nèi)血藥濃度及治療效應(yīng)間的量效關(guān)系提供數(shù)據(jù)參考。實(shí)驗(yàn)在原方的基礎(chǔ)上，苦杏仁劑量逐漸遞減、逐漸遞增1.5倍7個(gè)劑量組，其他藥材劑量不變，另設(shè)模型組、陽(yáng)性組（可待因組）、空白組（見(jiàn)表6），按1.2.2項(xiàng)下方法煎煮，按文獻(xiàn)［18］換算成相應(yīng)的大鼠灌胃劑量，每組灌胃8只大鼠，按1.2.3項(xiàng)下方法給藥后取血漿，按1.2.4項(xiàng)下方法處理并測(cè)定。血漿中待測(cè)成分的血藥濃度隨麻杏石甘湯中苦杏仁劑量變化趨勢(shì)見(jiàn)圖5，大鼠灌胃麻杏石甘湯，血漿樣品中可同時(shí)測(cè)到苦杏仁苷及其代謝產(chǎn)物野黑櫻苷，隨著給藥劑量逐級(jí)增加，體內(nèi)苦杏仁苷及野黑櫻苷含量呈增加趨勢(shì)，麻杏石甘湯中苦杏仁劑量在1.19～13.50 g的變化范圍內(nèi)，苦杏仁劑量與苦杏仁苷、野黑櫻苷血藥濃度存在正相關(guān)性。

表6 麻杏石甘湯中苦杏仁劑量的改變致大鼠血漿中苦杏仁苷、野黑櫻苷濃度的變化（n＝8）Table 6 Different dosages of almond in Maxing shigan decoction lead to the plasma concentrationchanges of amygdalin and prunasin in rat（n＝8）

圖5 血漿中苦杏仁苷和野黑櫻苷血藥濃度隨麻杏石甘湯中苦杏仁劑量變化趨勢(shì)圖Fig.5 Change trend of plasma concentration of amygdalin and prunasin in rat as dose changes of almond in Maxing shigan decoction

3 結(jié)論

本研究通過(guò)超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀測(cè)定精確相對(duì)分子質(zhì)量，快速準(zhǔn)確定性苦杏仁苷和野黑櫻苷，排除未知物干擾，避免假陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)使用超高效液相色譜－串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀對(duì)待測(cè)物定量分析，儀器靈敏度高，方法前處理簡(jiǎn)單，定量限約為1 ng／mL，分析過(guò)程時(shí)間短，僅需4 min，有利于血漿樣品中待測(cè)成分的測(cè)定，為研究血漿中苦杏仁苷、野黑櫻苷濃度與麻杏石甘湯中苦杏仁劑量的相關(guān)性研究提供技術(shù)支持。結(jié)果顯示在枸櫞酸所致大鼠咳嗽模型中，大鼠灌胃麻杏石甘湯，湯劑中苦杏仁劑量從1.19 g增加到13.50 g時(shí)，血漿樣品中可同時(shí)測(cè)到苦杏仁苷及其代謝產(chǎn)物野黑櫻苷，且隨著給藥劑量逐級(jí)增加，大鼠體內(nèi)苦杏仁苷及野黑櫻苷含量呈增加趨勢(shì)，苦杏仁劑量與苦杏仁苷、野黑櫻苷血藥濃度存在正相關(guān)性，為研究苦杏仁劑量與苦杏仁中活性成分在體內(nèi)血藥濃度及治療效應(yīng)間的量效關(guān)系提供數(shù)據(jù)參考。此外，本方法利用超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀可快速準(zhǔn)確定性待測(cè)成分的離子對(duì)，排除未知物對(duì)待測(cè)成分的干擾，使待測(cè)成分在低分辨率的超高效液相色譜－串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀上能夠準(zhǔn)確測(cè)定，可為生物樣品中其他待測(cè)成分的鑒別和定量提供參考。

［1］ National Pharmacopoeia Committee.Chinese Pharmacopoeia：Part 1.Beijing：China Medical Science Press（國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典：一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社），2010：187

［2］ LüJ Z，Deng J G.Drugs ＆Clinic（呂建珍，鄧家剛.現(xiàn)代藥物與臨床），2012，27（5）：530

［3］ Chen N，Liang R.Academic Journal of Guangdong College of Pharmacy（陳娜，梁仁.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)），2004，20（5）：545

［4］ Xin Y，Pi Z F，Song F R，et al.Chinese Journal of Chromatography（辛楊，皮子鳳，宋鳳瑞，等.色譜），2011，29（5）：389

［5］ Zhang L，Zhang F C，Wang Z H，et al.Chinese Journal of Chromatography（張琳，張福成，王朝虹，等.色譜），2013，31（9）：898

［6］ Zhang P P，Zhang F C，Wang Z H，et al.Chinese Journal of Chromatography（張盼盼，張福成，王朝虹，等.色譜），2013，31（3）：211

［7］ Ge B Y，Chen H X，Han F M，et al.J Chromatogr B，2007，857：281

［8］ Li X B，Liu C H，Zhang R，et al.J Chromatogr Sci，DOI：10.1093／chromsci／bmt063

［9］ Wen X D，Liu E H，Yang J，et al.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2012，67：114

［10］ Ma C H，Qian Y F，F(xiàn)an X S，et al.J Chromatogr Sci，DOI：10.1093／chromsci／bmt026

［11］ Zhu K J，Sun X P，Chang X J，et al.China Journal of Chinese Materia Medica（朱克近，孫曉萍，常秀娟，等.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志），2011，36（8）：1015

［12］ Fu Z L，Zheng X H，F(xiàn)ang M F.Chinese Traditional Patent Medicine（付志玲，鄭曉暉，房敏峰.中成藥），2011，33（7）：1202

［13］ Fang M F，F(xiàn)u Z L，Wang Q L，et al.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae（房敏峰，付志玲，王啟林，等.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志），2011，17（11）：132

［14］ Fang M F，F(xiàn)u Z L，Wang Q L，et al.China Journal of Chinese Materia Medica（房敏峰，付志玲，王啟林，等.中國(guó)中藥雜志），2010，35（20）：2684

［15］ Ma J，Liang Q D，Gao Y，et al.Pharm J Chin PLA（馬靖，梁乾德，高月，等.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)），2011，27（5）：410

［16］ Li L，Lu F G，Xiong X Y，et al.Acta Chinese Medicine and Pharmacology（李玲，盧芳國(guó)，熊興耀，等.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)），2010，38（2）：25

［17］ Huang F，Tong X Y，Zhang R H，et al.Chinese Traditional Patent Medicine（黃豐，童曉云，張榮華，等.中成藥），2008，30（11）：1582

［18］ Chen Q.Train of Thought about Chinese Medicine Research on Pharmacodynamics.2nd ed.Beijing：People’s Medical Publishing House（陳奇.中藥藥效研究思路與方法.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社），2007：17