王 清， 王國民， 郗存顯， 李賢良， 陳冬東，唐柏彬， 張 雷， 趙 華＊

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶400016；2.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶市進出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶400020；3.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京100123）

玉米赤霉醇類化合物（zeranols，ZER）是由多種鐮刀霉菌產(chǎn)生的非甾體同化激素，包括玉米赤霉烯酮（ZON）、α－玉米赤霉醇（α－ZAL）、β－玉米赤霉醇（β－ZAL）、α－玉米赤霉烯醇（α－ZOL）、β－玉米赤霉烯醇（β－ZOL）和玉米赤霉酮（ZAN）等，具有促進蛋白質(zhì)合成的作用，曾被用作家畜促增長劑［1］。氯霉素（CAP）是一種廣譜抗生素，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有良好的抑制作用，曾廣泛應(yīng)用于動物細菌感染的臨床治療。研究表明，ZER具有生殖毒性、免疫毒性和基因毒性等毒副作用［2］，CAP具有抑制骨髓造血、灰嬰綜合征、神經(jīng)毒性等毒副作用［3，4］。在動物源性食品中殘留的ZER和CAP可通過食物鏈對人類的健康構(gòu)成潛在危害。我國農(nóng)業(yè)部第235號公告《動物源性食品中獸藥最高殘留限量》中明確規(guī)定，在動物源性食品中不得檢出CAP和ZER［5］。

液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）具有高的選擇性和靈敏度，被廣泛應(yīng)用于動物源性食品中真菌毒素和獸藥的殘留檢測［6，7］。但動物源性食品的基質(zhì)非常復(fù)雜，如果不經(jīng)過凈化去除基質(zhì)影響，會影響LC－MS／MS的準(zhǔn)確性和靈敏度。樣品前處理凈化技術(shù)主要有液－液萃取和固相萃取，但兩者均耗費試劑，操作步驟繁瑣且專屬性差。免疫親和柱（IAC）作為一種優(yōu)良的前處理技術(shù)，具有良好的專屬性和高富集性，被廣泛應(yīng)用于真菌毒素和獸藥的殘留分析［8，9］。針對ZER或者CAP凈化的免疫親和柱，只單一的包含了ZER或者CAP的抗體，不能同時凈化富集同一樣品中的ZER和CAP；而復(fù)合免疫親和柱（IAC－CZ柱）同時包含了ZER和CAP抗體，能同時對ZER和CAP進行富集凈化，從而提高了樣品中ZER和CAP的檢測效率。本文建立了采用IAC－CZ柱凈化、LC－MS／MS同時檢測魚肉、豬肝、牛奶、蜂蜜中ZER和CAP殘留的方法，對同時檢測動物源性食品中的ZER和CAP具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC－20A液相色譜儀（日本Shimadzu公司）和API4000串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB公司）；XH－B型振蕩器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；3－30K臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；ZHWY－2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；N－EVAP 116氮氣吹干儀（美國Organomation Associates公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（美國 Millipore公司）。

IAC－CZ柱（柱容量100 ng，3 mL，北京中檢維康技術(shù)有限公司；4℃冰箱中保存）；HLB固相萃取柱（60 mg，3 mL，美國Supelco公司）；C18固相萃取柱（1.0 g，6 mL，美國Supelco公司）；NH2固相萃取柱（500 mg，3 mL，美國Supelco公司）；MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL，美國 Waters公司）；β－葡萄糖苷酸／硫酯酸復(fù)合酶（美國Sigma公司）；乙腈、甲醇、叔丁基甲醚、乙醚、乙酸乙酯等試劑為色譜純，氫氧化鈉、乙酸鈉、氯化鉀等試劑為分析純；實驗用水均為超純水。

α－玉米赤霉醇、β－玉米赤霉醇、α－玉米赤霉烯醇、β－玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98.0%，購自美國Sigma公司。氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98.5%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

魚肉、豬肝、牛奶、蜂蜜等樣品購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和基質(zhì)曲線溶液：用甲醇配制ZER和CAP的單標(biāo)準(zhǔn)儲備液，質(zhì)量濃度均為100 mg／L，于－18℃下保存。用25%乙腈水溶液將ZER和CAP標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0μg／L（ZER）和 CAP為0.1、0.25、0.5、2.5、5.0、25.0μg／L（CAP）的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。用空白魚肉（或蜂蜜、牛奶、豬肝）基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成與標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液相同濃度的系列基質(zhì)曲線溶液。

乙酸鈉緩沖液：稱取6.80 g乙酸鈉，用900 mL超純水溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH為4.80，定容至1 L。

PBS 溶 液：分 別 稱 取 8.00 g NaCl、2.90 g Na2HPO4·12H2O、0.24 g KH2PO4和 0.20 g KCl，用 900 mL 超 純 水 溶 解，再 用 1.0 mol／L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.40，用水定容至1 L。

1.3 LC－MS／MS條件

色 譜 柱：Shimadzu Shim－pack VP－ODS（150 mm×2.0 mm，5μm）。流動相：A相為乙腈，B相為2 mmol／L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）。梯度洗脫程序：0～4.0 min，25%A～75%A；4.0～7.0 min，75%A；7.0～7.5 min，75%A～25%A；7.5～8.0 min，25%A。流速：0.30 mL／min；柱溫：40℃；進樣量：10μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧負離子－多反應(yīng)監(jiān)測（ESI－－MRM）模式檢測；電噴霧電壓：－4.5 kV；霧化氣壓力：0.24 MPa；氣簾氣壓力：0.28 MPa；輔助氣壓力：0.41 MPa；離子源溫度：550℃；其他主要質(zhì)譜條件見表1。

表1 ZER和CAP測定的主要質(zhì)譜條件Table 1 Main mass spectrometric conditions for the determination of ZER and CAP

1.4 供試品制備

1.4.1 樣品的提取

魚肉、蜂蜜、豬肝：準(zhǔn)確稱取勻漿后的樣品5.00 g于50 mL具塞離心管中，加入10.0 mL乙酸鈉緩沖液和50μLβ－葡萄糖苷酸／硫酸酯復(fù)合酶，渦旋混勻；置于37℃恒溫振蕩器（轉(zhuǎn)速為100 r／min）中酶解16 h，冷卻至室溫后，用20.0 mL乙醚振蕩提取30 min，于 5 000 r／min下離心5 min，將上層乙醚液轉(zhuǎn)移至另一離心管中。余下水層中加入100μL1 mol／L NaOH溶液，混勻，用20.0 mL乙醚重復(fù)提取1次。合并提取液，于40℃下用氮氣吹干，殘渣用1.0 mL 50%乙腈水溶液復(fù)溶，用0.22μm濾膜過濾（若溶液渾濁，可于5 000 r／min下離心3 min后再過濾）。取濾液0.5 mL，用PBS稀釋至5 mL，混勻，待凈化。

牛奶：準(zhǔn)確稱取勻漿后樣品5.00 g于50 mL具塞離心管中，加入10.0 mL乙酸鈉緩沖液和50μL β－葡萄糖苷酸／硫酸酯復(fù)合酶，渦旋混勻；置于37℃恒溫振蕩器（轉(zhuǎn)速為100 r／min）中酶解16 h，冷卻至室溫，加入5.0 g NaCl，渦旋混勻后，用20.0 mL乙醚振蕩提取30 min，于 7 000 r／min 下離心10 min，剩余操作同上。

1.4.2 IAC－CZ柱凈化

將待凈化液通過IAC－CZ柱，用5.0 mL PBS和5.0 mL水淋洗，抽干。用2.0 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，于40℃下氮氣揮干，用1.0 mL 25%乙腈水溶液溶解并過濾（0.22μm有機濾膜），濾液供LC－MS／MS分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 溶液pH對提取效率的影響

據(jù)報道，ZER在弱酸性及中性條件下易溶于有機溶劑［10］，而CAP在弱堿條件下能得到較好的提取效果［11］。在pH4.8時，ZER的提取效率≥90%，而CAP的提取效率僅為50%～70%。當(dāng)pH為7.5±0.5時，CAP的回收率≥95%。本實驗采用調(diào)節(jié)下層水溶液pH的方法，經(jīng)兩步提取，可最大限度地提取基質(zhì)中的ZER和CAP。

2.1.2 提取溶劑的選擇

本實驗考察了乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯和乙腈對幾種基質(zhì)中ZER和CAP的同時提取效率。稱取肝臟、蜂蜜、魚肉等空白基質(zhì)，分別添加10μg／kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別以乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯和乙腈為提取溶劑，按1.4節(jié)處理，結(jié)果（見表2）表明乙醚的提取效果較好，在不同基質(zhì)中ZER和CAP的回收率均在90%以上。因此實驗選擇乙醚作為提取溶劑。

2.2 IAC－CZ柱凈化條件的優(yōu)化

2.2.1 過濾不溶性雜質(zhì)

以乙醚作為提取溶劑時會同時提取出部分雜質(zhì)。提取液吹干后，用1 mL 50%乙腈溶液溶解殘渣，乙腈溶液中含有大顆粒的不溶性雜質(zhì)，這些大顆粒雜質(zhì)進入色譜柱容易堵塞柱，阻礙分析物與特異性抗體相結(jié)合，影響IAC－CZ柱的凈化效果，對IAC－CZ柱的壽命也有一定的影響。因此，本實驗采用0.22μm的濾膜過濾乙腈溶液，可有效減少大顆粒雜質(zhì)對IAC－CZ柱凈化過程的干擾。

表2 不同溶劑對基質(zhì)中ZER和CAP的提取回收率Table 2 Extraction recoveries of ZER and CAP in matrices with different solvents

2.2.2 上載溶液中乙腈含量的考察

本實驗考察了上載溶液中乙腈含量對IAC－CZ柱富集效果的影響。當(dāng)乙腈含量≤10%時，ZER和CAP的回收率無明顯差別（見圖1），免疫親和柱中抗體和分析物的特異性結(jié)合作用不受影響。因此，上載溶液中乙腈的含量控制在5%。

圖1 上載溶液乙腈含量對IAC－CZ柱富集作用的影響Fig.1 Effect of acetonitrile content in loading solution on the enrichment function of IAC－CZ column

2.2.3 淋洗液和洗脫液的考察

淋洗液選用5 mL PBS溶液和5 mL水，PBS溶液有助于洗脫上載溶液中的非特異性雜質(zhì)，水可以洗脫非特異性雜質(zhì)以及PBS溶液中的鹽。淋洗過程中無目標(biāo)物被洗脫。

為確保目標(biāo)物完全洗脫，本實驗考察了洗脫液甲醇的體積對洗脫率的影響。結(jié)果見圖2，隨著洗脫液甲醇體積的增加，洗脫率提高，當(dāng)甲醇體積達到2 mL及以上時，洗脫率趨于穩(wěn)定。因此本方法采用2 mL甲醇洗脫。

圖2 甲醇體積對目標(biāo)物洗脫率的影響Fig.2 Effect of methanol volume on the elution rates of the analytes

2.3 IAC－CZ柱與其他凈化柱凈化能力的比較

常用于ZER或CAP凈化的固相萃取柱（SPE）有 HLB 柱［12，13］、NH2柱［14，15］、C18柱［16，17］、MCX柱［18，19］等。本文比較了常用的 SPE 柱與IAC－CZ柱對ZER和CAP的凈化效果。稱取魚肉基質(zhì)加入5.0μg／kg 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按照1.4.1節(jié)提取，分別在不凈化、固相萃取柱凈化、IAC－CZ凈化處理提取液后，用LC－MS／MS測定。實驗結(jié)果見圖3（以β－ZAL的LC－MS／MS圖為例）?；|(zhì)樣品不經(jīng)過凈化直接過濾后進樣分析，基質(zhì)影響明顯，對主成分的測定干擾很大（圖3a）；HLB柱、NH2柱、C18柱、MCX柱有一定的凈化能力，但基質(zhì)干擾還是非常明顯（圖3b～3e）；IAC－CZ具有良好的凈化效果，能有效減小基質(zhì)影響，LC－MS／MS譜圖中基線穩(wěn)定，主成分峰不受干擾（圖3f）?；谔禺愋陨锓磻?yīng)原理的免疫親和柱凈化方法越來越廣泛地用于ZER或 CAP 的 殘 留 分 析［11，13］，本 文 使 用IAC－CZ柱同時富集ZER和CAP，凈化效果良好，適合ZER和CAP的殘留分析。

圖3 （a）未經(jīng)凈化和經(jīng)（b）MCX、（c）HLB、（d）C18、（e）NH2 和（f）IAC－CZ柱凈化的魚肉基質(zhì)中β－ZAL的 LC－MS／MS譜圖Fig.3 LC－MS／MS chromatograms ofβ－ZAL in the fish matrix（a）without clean－up and cleaned－up by（b）MCX，（c）HLB，（d）C18，（e）NH2and（f）IAC－CZ cartridges

2.4 線性方程、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)評價

取1.2節(jié)中標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和各基質(zhì)曲線溶液進樣分析，以定量離子對的響應(yīng)值為y，以質(zhì)量濃度為x作線性回歸，考察標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線和各基質(zhì)曲線的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及儀器的檢出限和定量限，結(jié)果見表3?？梢姌?biāo)準(zhǔn)曲線的R2≥0.999 0，各基質(zhì)曲線的R2≥0.998 0，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線與各基質(zhì)曲線的線性范圍良好。信噪比為3或10時，分別得出儀器檢出限為0.04～0.10μg／kg，定量限為0.10～0.40 μg／kg。

基質(zhì)效應(yīng)用基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率比值（SSE）來評價［20，21］。SSE為90.8%～108.0%，表示基質(zhì)效應(yīng)不明顯，說明經(jīng)過IAC－CZ柱凈化后，基質(zhì)對目標(biāo)物的測定無明顯干擾，可以用外標(biāo)法定量。

表3 各分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)Table 3 Linear equations，correlation coefficients，limits of detection（LODs），limits of quantification（LOQs）and matrix effects（SSEs）of the analytes

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

2.5 回收率和精密度

稱取空白魚肉（或蜂蜜、牛奶、豬肝）樣品，分別添加低、中、高水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻后，按照1.4節(jié)處理后測定，每個添加水平重復(fù)6次，外標(biāo)法定量，計算平均回收率和精密度。由表4可知，7種分析物的平均回收率在70.9%～95.6%之間，RSD在2.0%～11.8%之間，表明該方法的回收率和精密度均良好。

表4 空白基質(zhì)中各分析物的加標(biāo)回收率和精密度（n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of the analytes spiked in blank samples（n＝6）

3 結(jié)論

本文利用復(fù)合免疫親和柱同時凈化富集樣品中的ZER和CAP，建立了針對ZER和CAP殘留的LC－MS／MS定量分析方法。該復(fù)合免疫親和柱具有獨特的專屬性和良好的凈化效能，可有效地富集不同基質(zhì)中的ZER和CAP，最大程度地消除基質(zhì)對分析的干擾。LC－MS／MS分析方法靈敏度高，分析結(jié)果可靠，分析時間短，提高了殘留檢驗工作的效率。本方法具有良好的回收率和精密度，分析方法穩(wěn)定。該方法對不同基質(zhì)均有良好的適用性，具有良好的應(yīng)用前景。

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