王定穎， 朱靖博，2＊， 丁 燕，2， 寇自農(nóng)， 楊蘭蘋

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連116034；2.大連工業(yè)大學(xué)植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所，遼寧 大連116034；3.大連工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器中心，遼寧 大連116034）

單味及復(fù)方中藥、植物源功能性食品的活性評(píng)價(jià)方法是公認(rèn)的難點(diǎn)，其主要原因是物質(zhì)體系組成和作用機(jī)理的復(fù)雜性。在現(xiàn)有的科學(xué)技術(shù)水平下，研究者們普遍采用針對(duì)混合物中已知或主要化合物進(jìn)行定量分析或針對(duì)全成分指紋圖譜闡明其化學(xué)組成色譜信息的方法進(jìn)行分析［1］。但由于化合物成分對(duì)靶點(diǎn)同時(shí)存在協(xié)同、拮抗等復(fù)雜作用，這一方法對(duì)于植物源功能性食品、單味及復(fù)方中藥等復(fù)雜體系活性評(píng)價(jià)的局限性是不言而喻的［2，3］。各種類別的色譜分析在獲得復(fù)雜體系化合物組成及含量方面信息具有明顯的優(yōu)勢(shì)，如運(yùn)用分子生物色譜篩選中藥活性成分及其質(zhì)量控制，采用高效液相色譜法檢測(cè)藥材中某主要化合物或某雜質(zhì)的含量，結(jié)合質(zhì)譜分析確定藥材中某主要化合物或某雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)等［4－7］，因此在獲得提取物活性數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合色譜信息構(gòu)建數(shù)學(xué)模型來評(píng)價(jià)這些復(fù)雜體系的活性，可能是解決這一問題的有效方法。

復(fù)雜體系的色譜信息包含成分組成、比例、含量等多方面，其對(duì)活性的影響可隨色譜信息的變化而變化，且這一變化不呈簡(jiǎn)單的線性加合作用?；貧w分析常被用作處理一系列變化的因素對(duì)某單方面探測(cè)目標(biāo)的影響效應(yīng)，包括變化因素之間的冪響應(yīng)、相互作用效應(yīng)、多重共線性與超飽和模型等［8，9］。逐步回歸法（stepwise regression，SR）是回歸分析中的一種模式，采用在基本自變量回歸的基礎(chǔ)上逐一篩選其余自變量，并通過對(duì)已剔除的自變量進(jìn)行多輪篩選過程，改變顯著自變量項(xiàng)選入和剔除的標(biāo)準(zhǔn)，獲得包含主要效應(yīng)分量的優(yōu)化回歸方程。由于每步都做檢驗(yàn)，因而保證了最后所建立的回歸方程中所有自變量都是顯著的［8，10］。SR已廣泛應(yīng)用于農(nóng)學(xué)、經(jīng)濟(jì)學(xué)、社會(huì)學(xué)、地質(zhì)學(xué)等行業(yè)［11－16］，在中藥活性研究中僅見于篩選血竭中活性成分和藥物質(zhì)量控制中有所運(yùn)用［17，18］。

α－葡萄糖苷酶抑制劑可以良好地抑制餐后血糖升高，已成為降低餐后血糖的一線藥物［19，20］。目前人們已發(fā)現(xiàn)大量植物提取物或有效部位可明顯抑制α－葡萄糖苷酶，并對(duì)其有效成分進(jìn)行分離富集研究［21－26］。已有的研究證明，西青果提取物具有較強(qiáng)的抑制α－葡萄糖苷酶作用，較現(xiàn)有的治療糖尿病臨床藥物阿卡波糖（acarbose）具有明顯的優(yōu)勢(shì)［27－29］。因此，本論文建立了基于復(fù)雜體系色譜分析信息、生物活性信息的數(shù)學(xué)模型來表征與評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物抑制α－葡萄糖苷酶活性的方法，對(duì)于開展植物源功能食品、中藥研發(fā)具有重要的科學(xué)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

P230－Ⅱ型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；DZF－6050真空干燥箱、R502B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限公司）；SK－1快速混勻器（常州國(guó)華儀器有限公司）；MDFF2LASO.25反滲透純水機(jī)（大連美德環(huán)保設(shè)備公司）；BS2245電子天平（北京賽多利斯儀器公司）；BT100－1J蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)器（保定蘭格恒流泵公司）；1.5 mL PE離心管（美國(guó)Axygen公司）；Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm；迪馬科技公司）；Galaksil EF－C18M120A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm；加萊克色譜科技公司）；超聲波清洗機(jī)、恒溫水浴鍋等實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備。

對(duì)－硝基苯基－α－D－吡喃葡萄糖苷（p－nitrophenyl－α－D－glucopyranoside，PNPG，純度99%）、α－葡萄糖苷酶（來自釀酒酵母，規(guī)格為7.14 U／mg）、牛血清白蛋白（BSA，純度≥95%）均購(gòu)于Sigma公司；阿卡波糖片（acarbose，50 mg／片，批號(hào) H19990205；拜耳醫(yī)藥保健有限公司）。

甲酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鈉、磷酸購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，對(duì)－硝基苯酚（PNP）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。工業(yè)級(jí)甲醇、乙醇、丙酮、正己烷（均重蒸后使用），購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈、甲醇均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；超純水為實(shí)驗(yàn)室儀器自制。

西青果原藥材：生產(chǎn)批號(hào)090301，購(gòu)自河北聚仁堂飲片有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Galaksil EF－C18M120A；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：0.02 mol／L 磷酸二氫鉀溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH＝2）。梯度洗脫程序：0～40 min，10%A～18%A；40～55 min，18%A；55～60 min，18%A～70%A；60～70 min，70%A；70～73 min，70%A～10%A；73～80 min，10%A。流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：常溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。檢測(cè)過程每組樣品平行測(cè)定3次。儀器檢出限：峰高＞6.0 mV，峰面積＞50.0 mV·s。

1.2.2 組分樣品的制備

取212 g西青果原藥材經(jīng)乙醇加熱回流提取得到 TCR－crude。取 TCR－crude 60.0 g經(jīng) HPD－100大孔樹脂除去蛋白質(zhì)、氨基酸、無機(jī)鹽以及部分極性極小的物質(zhì)，得到富集后的產(chǎn)物TCR－pur，編號(hào)S1。取TCR－pur 9.5 g進(jìn)行Sephadex LH－20色譜分離，得到28份組成既有聯(lián)系又有區(qū)別的混合物樣品組，編號(hào)S2～S29。分別濃縮、干燥、稱重，并將其配制為1.00 g／L的甲醇溶液，密封保存作為后續(xù)HPLC成分檢測(cè)與PNPG活性檢測(cè)的樣品。制備流程如圖1所示。

圖1 組分樣品制備過程Fig.1 Preparation process of the samples

1.2.3 α－葡萄糖苷酶抑制活性的檢測(cè)

酶液配制：取14 U／mg規(guī)格的α－葡萄糖苷酶7.14 mg，用含0.20%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖溶液（pH6.8，濃度0.067 mol／L）溶解后定容于100 mL容量瓶中，冰箱凍存，使用前經(jīng)解凍并稀釋10倍后即得0.1 U／mL的α－葡萄糖苷酶液。

采 用 HPLC－PNPG 法［30，31］檢 測(cè)，反 應(yīng) 在 1.5 mL的PE管中完成。具體操作方法：加入0.067 mol／L pH6.8的磷酸鹽緩沖溶液50μL、0.1 U／mLα－葡萄糖苷酶60μL、待測(cè)樣品的甲醇溶液5 μL，振蕩混勻，于37℃水浴中恒溫孵育20 min；再加入40μL4.0 mmol／L PNPG，振蕩混勻，于37℃水浴中恒溫孵育反應(yīng)30 min；最后加入0.2 mol／L Na2CO3溶液160μL終止反應(yīng)，加超純水稀釋定容至1 500μL，混勻機(jī)中混勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，待HPLC檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)樣品組、空白對(duì)照組（blank control，以等量磷酸鹽緩沖溶液代替酶液）、陰性對(duì)照組（negative control，以等量純甲醇代替樣品溶液）和陽(yáng)性對(duì)照組（positive control，以等量同濃度阿卡波糖溶液代替樣品溶液）。HPLC檢測(cè)條件：Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.1%甲酸水溶液（45∶55，v／v）；等度洗脫8 min；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：常溫；UV檢測(cè)波長(zhǎng)：315 nm。檢測(cè)限：峰高＞0.0 mV，峰面積＞0.0mV·s。

活性大小采用相同濃度的樣品對(duì)酶的抑制率（W）來表示，使用PNP峰面積－濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取PNP標(biāo)準(zhǔn)品0.034 7 g，用重蒸純水超聲輔助溶解，定容于25 mL容量瓶中，配制成10 mmol／L的PNP母液，再將 其 稀 釋 成 0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.002 5 mmol／L 系列濃度的PNP標(biāo)準(zhǔn)液，過0.45μm水系濾膜，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，檢測(cè)條件同PNPG法活性檢測(cè)中的HPLC條件。以PNP峰面積為橫坐標(biāo)，PNP濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。抑制率 W 計(jì)算公式：100%，式中：A為陰性對(duì)照中PNP的濃度（扣除相應(yīng)空白）；B為樣品組（包括陽(yáng)性對(duì)照）中PNP的濃度（扣除相應(yīng)空白）。

1.2.4 數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建

以樣品對(duì)α－葡萄糖苷酶的抑制率 W 為因變量、樣品HPLC譜圖中各組分的峰面積3次測(cè)定的平均值（Vi）為自變量進(jìn)行多元線性回歸。在這個(gè)模型中，樣品個(gè)數(shù)N＝29，樣品維度（所有樣品峰的總數(shù)）P＝55，屬于典型的超飽和模型（P＞N），且單個(gè)樣品中的不同成分之間會(huì)對(duì)活性產(chǎn)生難以預(yù)估的相互作用，或者某個(gè)成分的單獨(dú)作用可以相抵其他若干組分的共同作用，即待考察的項(xiàng)數(shù)之間存在多重共線性，故選用逐步回歸法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。具體操作中使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0中的“Regression Analysis／Linearity／Stepwise”程序進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，選取F分布概率區(qū)間為進(jìn)入F（α＝0.05），移出F（α＝0.10）。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC條件的確定

為了獲取充分的色譜信息，本文考察了Diamonsil C18、UniPS 5－100、Hypersil BDS C18、Sino－Chrom ODS－BP等色譜柱對(duì)樣品的分離效果，確定了 Galaksil EF－C18M（250 mm×4.6 mm，5μm，填料孔徑12 nm）作為分析色譜柱，選擇乙腈與0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液（磷酸調(diào)節(jié)pH＝2）作為流動(dòng)相，梯度洗脫，在此條件下西青果提取物達(dá)到了較好的分離（見圖2）。

2.2 組分樣品的制備及其HPLC檢測(cè)

圖2 西青果乙醇提取物的HPLC譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Terminalia chebula Retz.extract with ethanol

TCR－crude經(jīng) HPD－100大孔樹脂富集處理后 得 到 黃 褐 色 細(xì) 干 粉 狀 TCR－pur 40.3 g，經(jīng)Sephadex LH－20凝膠色譜柱分離得到29個(gè)成分連續(xù)變化、組成既有聯(lián)系又有區(qū)別的混合物樣品組。對(duì)各組樣品采用HPLC檢測(cè)各樣品的化學(xué)組成，結(jié)果見圖3。

每組樣品平行測(cè)定3次，根據(jù)出峰時(shí)間對(duì)不同組分的各個(gè)峰進(jìn)行排列，將保留時(shí)間相同或相近、峰形相似的峰進(jìn)行識(shí)別和匹配，記錄峰面積數(shù)值并計(jì)算其平均值與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（具體數(shù)據(jù)略）。

2.3 樣品抑制α－葡萄糖苷酶活性的檢測(cè)

對(duì)上述樣品進(jìn)行PNPG法活性檢測(cè)，所得結(jié)果的標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 方 程 為 y＝0.000 2x＋0.002 3，r＝0.999 2，根據(jù)方程計(jì)算各組分的PNP濃度及其相應(yīng)的對(duì)酶抑制率，對(duì)各樣品活性檢測(cè)數(shù)據(jù)取3次測(cè)定的平均值，所得結(jié)果見表1。

表1 PNPG法測(cè)定的29組樣品的α－葡萄糖苷酶抑制率（n＝3）Table 1 Inhibition ofα－glycosidase enzyme for the 29 samples by PNPG method（n＝3）

圖3 29組樣品的HPLC譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the 29 samples

2.4 樣品成分與活性對(duì)應(yīng)的數(shù)學(xué)關(guān)系模型的構(gòu)建

由 SPSS13.0軟件中的“Regression Analysis／Linearity／Stepwise”程序處理得出如下結(jié)果：模型擬合概況及方差分析見表2，其中的復(fù)相關(guān)系數(shù)R表明自變量與因變量之間的相關(guān)程度，復(fù)決定系數(shù)R2反映V引起W 的變異性。當(dāng)自變量V7、V18、V29、V4、V11、V36都進(jìn)入方程時(shí)，R＝0.854，表明自變量與因變量有良好的相關(guān)性。R2＝0.729表明上述6個(gè)自變量可以解釋因變量72.9%的變異性。檢驗(yàn)回歸方程6種模式的F統(tǒng)計(jì)量分別為6.962、7.112、4.296、7.641、5.053、4.909，均大于對(duì)應(yīng)的F0.1（1，54）＝2.81，F(xiàn)0.1（2，53）＝2.41，F(xiàn)0.1（3，52）＝2.20，F(xiàn)0.1（4，51）＝2.06，F(xiàn)0.1（5，50）＝1.97，F(xiàn)0.1（6，49）＝1.90。6步回歸的顯著F 變化值（Sig.F change）依次為 0.014、0.013、0.049、0.011、0.034、0.037，均小于0.05，差異顯著，所以回歸方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型6的方程更顯著，更有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，為最優(yōu)回歸方程。

在回歸系數(shù)分析表（表3）中，回歸系數(shù)（B）的絕對(duì)值反映了組分對(duì)酶的抑制率程度，絕對(duì)值越大，表現(xiàn)出對(duì)抑制酶活能力的影響越大，影響包括促進(jìn)與阻礙兩種作用。表3中列出了回歸模型的自變量系數(shù)與常數(shù)項(xiàng)及個(gè)體的t檢驗(yàn)。由第6步回歸分析的t檢驗(yàn)可以知道，對(duì) V7、V18、V29、V4、V11、V36檢驗(yàn)的 Sig.F change值依次為 0.018、0.006、0.000、0.001、0.016、0.037，均小于0.05，差異顯著，表明回歸方程在個(gè)體上有意義。且由Model 1、Model 2可看出，V18引入后使V7的回歸系數(shù)絕對(duì)值減小，說明前者可部分抵消后者的作用。同理，V29可部分抵消V7、V18的作用，三者的回歸系數(shù)均為負(fù)值，表明該成分對(duì)酶的活性有顯著的促進(jìn)作用；V4、V11的回歸系數(shù)為正，表明該成分對(duì)酶的活性有顯著的抑制作用，且V11的引入使V4的回歸系數(shù)變大，即V11可以增強(qiáng)V4的抑制作用；V36的回歸系數(shù)為負(fù)，且V36的引入使V7、V4的回歸系數(shù)的絕對(duì)值變小，V18、V29、V11的回歸系數(shù)絕對(duì)值變大，表明V36本身對(duì)酶活性有顯著的抑制作用，且其可抑制 V7、V4的作用，促進(jìn) V18、V29、V11的作用。

表2 模型擬合概況及方差分析Table 2 Model summary and analysis of variance

表3 6個(gè)數(shù)學(xué)模型的回歸系數(shù)分析Table 3 Analysis of the coefficients of the six models

逐步回歸方程：

Model 1：W ＝V7× （－0.035±0.013）＋77.336±5.921；

Model 2：W＝V7×（－0.032±0.012）＋V18×（－0.175±0.066）＋80.439±5.472；

Model 3：W＝V7×（－0.031±0.011）＋V18×（－0.155±0.051）＋V29×（－0.043±0.021）＋84.582±5.529；

Model 4：W＝V7×（－0.048±0.012）＋V18×（－0.117±0.058）＋V29×（－0.095±0.026）＋V4×（0.057±0.021）＋84.018±4.918；

Model 5：W＝V7×（－0.052±0.011）＋V18×（－0.126±0.054）＋V29×（－0.135±0.030）＋V4×（0.081±0.022）＋V11×（0.069±0.031）＋82.553±4.596；

Model 6：W＝V7×（－0.034±0.013）＋V18×（－0.155±0.051）＋V29×（－0.142±0.028）＋V4×（0.079±0.020）＋V11×（0.074±0.028）＋V36×（－0.117±0.053）＋85.669±4.476。

綜上，對(duì)酶活性影響顯著的物質(zhì)依次為第18、29、36、4、11、7號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物。

2.5 模型的穩(wěn)健性與普適性分析

在29組樣品中隨機(jī)抽取15組進(jìn)行任意混配，制得5組新樣品并配制為1.00 g／L 的甲醇溶液，編號(hào) S1N、S2N、S3N、S4N、S5N，采用上述方法重復(fù)HPLC成分檢測(cè)與PNPG活性檢測(cè)。5組樣品的HPLC檢測(cè)化學(xué)組成結(jié)果見圖4（相應(yīng)的色譜信息具體數(shù)據(jù)略）。從HPLC成分檢測(cè)可知此5組樣品構(gòu)成的新測(cè)試集包含數(shù)學(xué)模型6中所述對(duì)活性影響顯著的全部化合物，故可采用此組數(shù)據(jù)驗(yàn)證模型的穩(wěn)健性。

圖4 模型穩(wěn)健性考察樣品的HPLC譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of the samples for the steadiness of the model

根據(jù)模型方程式可預(yù)測(cè)該5組樣品對(duì)α－葡萄糖苷酶抑制率分別為88.48%、99.76%、78.49%、26.94%、93.88%，按其大小順次樣品排列為S2N＞S5N＞S1N＞S3N＞S4N。采用PNPG法實(shí)際測(cè)得樣品的 抑 制 率 分 別 為 93.36%、99.98%、76.65%、31.15%、97.03%，按大小順次樣品排列為S2N＞S5N＞S1N＞S3N＞S4N。該數(shù)值變化規(guī)律與計(jì)算所得數(shù)據(jù)吻合，存在正常范圍內(nèi)的隨機(jī)誤差，說明模型的穩(wěn)健性良好。

中藥組分是天然的混合復(fù)雜化合物體系，不同中藥組分的復(fù)雜程度不同，西青果組成成分與藥理活性已被多位學(xué)者深入研究。本論文通過構(gòu)建西青果提取物中多個(gè)化學(xué)成分與抑制α－葡萄糖苷酶活性之間對(duì)應(yīng)關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，建立了一種基于復(fù)雜體系色譜分析信息、生物活性信息的數(shù)學(xué)模型來表征與評(píng)價(jià)天然產(chǎn)物某方面活性的方法。相信這一研究思路同樣適用于單一植物的多種成分與其他方面活性、不同中藥資源的成分與多種不同活性等方面的研究，這對(duì)于開展植物源功能食品、中藥研發(fā)具有重要的科學(xué)意義。

3 結(jié)論

本研究借助SPSS13.0軟件，探索了結(jié)合色譜學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)表征復(fù)雜體系中成分與活性對(duì)應(yīng)數(shù)學(xué)關(guān)系的可行性。研究中構(gòu)造了一系列組成既有區(qū)別又有聯(lián)系的連續(xù)變化樣品組，測(cè)定其成分信息與活性信息，采用多元線性回歸中的逐步回歸法建立數(shù)學(xué)關(guān)系模型來表征多個(gè)化合物的混合復(fù)雜體系中各物質(zhì)含量與活性大小的關(guān)系并證明了該關(guān)系模型的穩(wěn)健性良好。結(jié)果表明這一探索是可行的。此關(guān)系模型可表征化合物混合體系中各物質(zhì)含量變化引起的活性變化，對(duì)藥物開發(fā)以及質(zhì)量控制中的關(guān)鍵活性物質(zhì)的確定具有一定的指導(dǎo)作用，為應(yīng)用數(shù)學(xué)在色譜分析學(xué)領(lǐng)域的使用開拓了一個(gè)新的思路與方法，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。由于本研究時(shí)間及條件所限，未能確定對(duì)活性影響較大物質(zhì)（第18、29、36、4、11、7號(hào)峰對(duì)應(yīng)化合物）的具體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，后續(xù)研究中可在此方面做進(jìn)一步的探索。

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