張文華， 黃超群， 謝 文＊， 沈 立

（1.浙江出入境檢驗檢疫局，浙江 杭州310016；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海200135）

棉酚（gossypol）是一種存在于棉花的棉籽及棉根皮中的多酚類物質(zhì)。棉酚在棉籽初榨過程中轉(zhuǎn)移至油中，粗制棉籽油中棉酚含量可達(dá)1%～1.3%［1］。長期食用棉酚較多的粗制棉籽油會引起中毒，影響生殖機(jī)能，導(dǎo)致不孕及胃腸障礙，甚至引起肺出血、呼吸困難等癥狀。棉籽油在其做成食用油前，必須經(jīng)過精煉、漂白和去味3道工序，才能將其中的棉酚去除。由于棉酚毒性較大，國家標(biāo)準(zhǔn)GB2716－2005《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》［2］規(guī)定食用植物油中棉酚的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.02%（200 mg／kg）。近期臺灣地區(qū)爆出“黑心油”事件后，臺灣地區(qū)“衛(wèi)生福利部”擬將食用油中棉酚的限量規(guī)定為1 mg／kg［3］。為了測定食用植物油中游離棉酚的含量是否超標(biāo)，開展對食用植物油中游離棉酚含量的測定方法研究很有必要。

目前對棉酚的檢測主要采用高效液相色譜法（HPLC）［4－6］、薄層色譜法［7］、紫外分光光度法［8，9］等。其中分光光度法測定時選擇性不強(qiáng)，與棉酚有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)均能被同時測定，使檢測結(jié)果偏高；HPLC雖然得到廣泛的應(yīng)用，但低于1 mg／kg的棉酚含量已超出儀器的靈敏度極限。文獻(xiàn)［10，11］采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS／MS）分別測定了鮮蛋黃和棉籽中的棉酚，而利用LC－MS／MS對食用植物油中棉酚進(jìn)行檢測的方法未見報道。本工作所建立方法的測定低限達(dá)到1 mg／kg，能滿足目前市場的檢測需求，同時還能用作HPLC確證陽性樣品的輔助方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

Thermo TSQ Quantum Ultra液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧電離源（ESI）（美國Thermo Fisher公司）；Surveyor液相色譜系統(tǒng)（美國Finnigan公司）；臺式離心機(jī)（美國Thermo公司）；AE260電子天平（瑞士Mettler公司）；渦旋混勻器（上海醫(yī)大儀器廠）；超純水凈化系統(tǒng)（英國ELGA公司）；微孔過濾膜（0.22μm，有機(jī)相）。

棉酚標(biāo)準(zhǔn)品：分子式為C30H30O8，相對分子質(zhì)量為518.55，CAS No.303－45－7（上海安譜科學(xué)儀器有限公司），純度為90.5%。準(zhǔn)確稱取經(jīng)純度折算后的棉酚10 mg，用丙酮溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 g／L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，進(jìn)一步采用食用油的空白樣品提取液稀釋成質(zhì)量濃度為10、20、40、60、100μg／L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。丙酮（色譜純，美國TEDIA公司）；乙腈和甲酸（色譜純，西班牙Scharlau公司）；水為超純水；無水乙醇為分析純。甲酸溶液（0.1%）：準(zhǔn)確量取1 mL甲酸于1 L容量瓶中，加水并定容至刻度，混勻后備用。實驗中所用其他試劑除特殊說明外均為分析純。

1.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入10 mL無水乙醇，劇烈振搖2 min，置于4℃冰箱中30 min，以4 000 r／min離心5 min后，取約2 mL上清液過濾。準(zhǔn)確移取1.0mL，用無水乙醇稀釋至10 mL，供LC－MS／MS測定。

1.3 LC－MS／MS檢測條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5μm）；流動相：乙腈（A）－0.1%甲酸水溶液（B）；梯度洗脫程序：0～2.0 min，50%A；2.0～4.0 min，50%A～90%A；4.0～6.0 min，90%A；6.0～7.0 min，90%A～50%A；7.0～10 min，50%A。流速為0.30 mL／min；柱溫為室溫；進(jìn)樣體積為5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子掃描；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；電噴霧電壓（IS）：3 500 V；離子源溫度：300℃；毛細(xì)管溫度：270℃；碰撞氣：高純氬氣，0.2 Pa；鞘氣：高純氮氣，6.5 L／min；輔助氣：高純氮氣，5.0 L／min。用于定量分析的離子對為 m／z 517.1／230.9（碰撞電壓43 V）。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶解溶劑的選擇及穩(wěn)定性的考察

棉酚是一種黃色不穩(wěn)定的多酚羥基聯(lián)萘醛類化合物，難溶于水、甘油、環(huán)己烷和苯，微溶于石油醚，易溶于無水乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、甲醇等有機(jī)溶劑。為了選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)品溶解溶劑，本文進(jìn)行了優(yōu)化實驗。將10 mg／L 的棉酚分別保存在甲醇、丙酮、乙腈和乙醇中，連續(xù)測試5天，如圖1a所示，發(fā)現(xiàn)棉酚溶解在丙酮中比較穩(wěn)定，棉酚降解的幅度不明顯。棉酚儲存在乙腈、乙醇和甲醇中則不穩(wěn)定，棉酚都有一定的降解，在甲醇和乙醇中尤為明顯，這與文獻(xiàn)報道相符［12，13］。因此選用丙酮作為配制標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的溶劑。

將棉酚溶解于丙酮中，配成10 mg／L 標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4℃下保存放置。將剛配制時所測得的棉酚峰面積和分別儲存0、1、3、5、7、14、30、60天后的結(jié)果作圖比較（見圖1b），RSD為11.5%。從圖1b還可以看出，棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液在14天之內(nèi)比較穩(wěn)定。

由于試樣采用無水乙醇提取，因此用無水乙醇對標(biāo)準(zhǔn)中間液和工作液進(jìn)行配制，同時對其穩(wěn)定性進(jìn)行考察。如圖1c所示，10 mg／L標(biāo)準(zhǔn)中間液在24 h內(nèi)一直處于降解過程，但6 h內(nèi)降解幅度較小。因此只要保證檢測在6 h內(nèi)完成，對于結(jié)果的準(zhǔn)確性還是可以得到保證。同時，由圖1c可知，標(biāo)準(zhǔn)中間液及工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.1.2 提取溶劑的選擇

文獻(xiàn)中有用丙酮［14］、無水乙醇［4－6］、70% （v／v）丙酮水溶液［15］、不同體積比的乙腈磷酸水溶液提取的報道。大多數(shù)文獻(xiàn)都是采用無水乙醇提取。本文重點對上述幾種溶劑的提取效率進(jìn)行了考察比較。實驗結(jié)果顯示，4℃靜置30 min后，丙酮與油互溶，70%丙酮水溶液與油形成乳濁液，無法實現(xiàn)對棉酚的有效提取。無水乙醇和乙腈與油有明顯的分層，且提取效率在90%以上。相比乙腈而言，無水乙醇的毒性更小。因此，本實驗采用無水乙醇進(jìn)行提取。

圖1 棉酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液在（a）不同溶劑中5天內(nèi)、（b）丙酮中60天內(nèi)和（c）無水乙醇中24 h內(nèi)的穩(wěn)定性考察Fig.1 Stability test of gossypol standard in（a）different reagents during 5 d，（b）acetone during 60 d，and（c）alcohol during24 h

為獲得最佳提取效率，本文同時考察了提取次數(shù)對提取效率的影響。結(jié)果顯示，提取一次，棉酚的提取率為80.1%；提取兩次，棉酚的提取率為83.3%；說明隨著提取次數(shù)的增加，棉酚的提取率沒有明顯增加。為了簡化實驗步驟，本文采用單次提取方式。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg／L）在ESI源負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定準(zhǔn)分子離子峰；通過調(diào)節(jié)離子化溫度、噴霧電壓等參數(shù)后進(jìn)行子離子掃描，同時對碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，得到兩個干擾較小的子離子m／z 230.9和471.1。其中 m／z 230.9離子的響應(yīng)更高，被選作定量離子，471.1為輔助定性離子。圖2分別為棉酚的碎片離子質(zhì)譜圖和樣品的色譜圖。

圖2 棉酚標(biāo)準(zhǔn)品的碎片離子質(zhì)譜圖和樣品的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖Fig.2 Product ion mass spectrum of gossypol standard and MRM chromatograms of sample

2.3 方法的線性關(guān)系、準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度

2.3.1 線性關(guān)系

由于質(zhì)譜在電離和掃描過程中存在基質(zhì)效應(yīng)的影響［16］，通常需采用內(nèi)標(biāo)法校正或基質(zhì)匹配曲線［17］來消除或減弱基質(zhì)效應(yīng)。本實驗測試了橄欖油、菜籽油、花生油和大豆油等不同種類植物油的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些植物油的基質(zhì)對棉酚離子化有很強(qiáng)的增強(qiáng)效應(yīng)，而且差別不大。采用橄欖油空白樣品溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其 m／z 517.1／230.9定量離子對響應(yīng)為采用無水乙醇配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的211%。因此，為消除樣品基質(zhì)效應(yīng)，提高定量準(zhǔn)確性，以食用油的空白樣品提取溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液，可使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有同樣的離子化條件，從而補償樣品的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明棉酚在10～100μg／L濃度范圍均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999。如果樣品中棉酚含量較高，處理后最終樣液中濃度超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，應(yīng)用無水乙醇對其進(jìn)行稀釋。同時標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)用稀釋相同倍數(shù)的空白溶液進(jìn)行配制。

2.3.2 回收率、精密度和測定低限

本方法對植物油中棉酚的測定低限為1 mg／kg，同時臺灣地區(qū)和祖國大陸對植物油中棉酚的最低限量分別為1 mg／kg和200 mg／kg。因此在空白植物油中添加1、2、200 mg／kg 3個水平的棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行方法學(xué)考察（200 mg／kg添加水平下，樣品稀釋倍數(shù)適當(dāng)加大），按優(yōu)化條件提取并分析，每個添加水平平行測定6次。如表1所示，方法的平均回收率在87.4%～100%范圍內(nèi)，實驗室內(nèi)測定的精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示）小于10%。同時當(dāng)空白植物油中添加1 mg／kg的棉酚時，方法的平均回收率為100%，RSD為9.8%，信噪比大于10，因此方法的測定低限被定為1 mg／kg。可見，該方法完全能滿足植物油中棉酚的測定。

表1 植物油中棉酚的添加回收率與精密度（n＝6）Table 1 Spiked recoveries and precisions of gossypolin edible oil（n＝6）

3 結(jié)論

通過對影響液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分離分析的主要因素進(jìn)行優(yōu)化和考察，建立了液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測植物油中棉酚的分析方法。該方法測定低限為1 mg／kg，相比目前已見報道的分析方法，提高了靈敏度，也縮短了分析檢測的時間。該方法快速簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

［1］ Baidu Encyclopedia（百度百科）.（2007－05－29）［2014－01－20］.http：／baike. baidu. com／link？ url ＝ cYITcw－NkA8nhF6RAY6U71ToagC04IxOoCrNqBC8PNzGZb8＿AxxP－bIAhxPCWlqfh

［2］ GB2716－2005

［3］ Food Mate Net（食品伙伴網(wǎng)）.（2013－10－29）［2014－01－20］.http：／news.foodmate.net／2013／10／246990.html

［4］ Yu J Q.Science and Technology of Cereals，Oils and Foods（于加乾.糧油食品科技），2013，21（4）：78

［5］ Zhang Q Z.Guangzhou Chemical Industry（張慶珍.廣州化工），2012，40（15）：159

［6］ Wen J，Miao H，Wang X J，et al.Chinese Journal of Health Laboratory Technology（文君，繆紅，王鮮俊，等.中國衛(wèi)生檢驗雜志），2006，16（8）：1017

［7］ Shen J，Yang S，Yu H，et al.Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory（沈靜，陽勝，于紅，等.光譜實驗室），2011，28（1）：235

［8］ Zhao H X.Food Engineering（趙海霞.食品工程），2012（4）：47

［9］ Tian X Y，Yi J G，Xu S J，et al.Endemic Diseases Bulletin（田秀蕓，易建國，徐世江，等.地方病通報），2003，18（4）：91

［10］ Shi Q Y.Modern Food Science and Technology（施琦貽.現(xiàn)代食品科技），2012，28（5）：598

［11］ Yao J，He X W，Li X X，et al.Science and Technology of Food Industry（姚軍，何曉文，李新霞，等.食品工業(yè)科技），（2013－05－02）［2014－01－20］.http：／www.cnki.net／kcms／detail／11.1759.TS.20130502.1348.010.html

［12］ Nomeir A A，Abou－Donia M B.J Am Oil Chem Soc，1982，59：546

［13］ Wu W W，Xu G R.Journal of Agricultural University of Hebei（吳偉偉，許贛榮.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報），2009，32（5）：106

［14］ Shen Y，Xue Y L，Jin Q Z，et al.China Oils and Fats（沈媛，薛雅琳，金青哲，等.中國油脂），2012，37（10）：71

［15］ Ma Y J，Shi G Y，Chen B.Journal of Hygiene Research（馬勇健，石根勇，陳蓓.衛(wèi)生研究），1993，22（5）：302

［16］ Xiang P，Shen M，Zhuo X Y.Journal of Instrumental Analysis（向平，沈敏，卓先義.分析測試學(xué)報），2009，28（6）：753

［17］ Perello A E，Moreno M V，Monaco C，et al.Biocontrol，2009，54（1）：113