劉川燕，張 莉，侯曉暉，昌 藝，孫志誠(chéng)

(遵義醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563099)

九香蟲(chóng)屬半翅目蝽科，是重要的藥用昆蟲(chóng)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，九香蟲(chóng)具有抗炎、抗菌、抗癌、促纖溶、解痙、鎮(zhèn)痛及恢復(fù)機(jī)體免疫功能等多種作用［1］。我們前期研究［2，3］用氯仿和乙醇粗提九香蟲(chóng)有效成分進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)九香蟲(chóng)粗提物雖能抑制腫瘤細(xì)胞體外增殖，但并非通過(guò)影響細(xì)胞周期而產(chǎn)生作用。在上述基礎(chǔ)上，2011年11月～2012年4月，我們以石油醚和甲醇為試劑，提取九香蟲(chóng)體內(nèi)的有效成分，對(duì)其抗癌作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌細(xì)胞株SGC7901，由遵義醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);九香蟲(chóng)樣品購(gòu)自遵義百頤醫(yī)藥有限責(zé)任公司，研成粉末備用;胎牛血清;PBS;胰蛋白酶;青霉素;鏈霉素;RPMI Medium DMEM培養(yǎng)基;MTT粉末;DMSO;C1052細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 九香蟲(chóng)粗提物的制備 取九香蟲(chóng)粉末11 g，分別以石油醚和甲醇為溶劑、索氏提取器連續(xù)回流提取法提取九香蟲(chóng)有效成分，分別收集提取液(九香蟲(chóng)粗提物)，待自然揮干，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 將胃癌細(xì)胞SGC7901置5%CO2培養(yǎng)箱(37℃)中，10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)并鋪滿平底時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.3 細(xì)胞分組及干預(yù) 取已傳代的細(xì)胞，設(shè)石油醚組、甲醇組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔。石油醚組分別加入濃度為35、52、79、118、178、267、400 μg/mL 的石油醚粗提物，甲醇組分別加入濃度為 70、105、158、237、355、533、800 μg/mL的甲醇粗提物，均按1.5倍稀釋;陰性對(duì)照組加入含有石油醚或甲醇的培養(yǎng)基;空白對(duì)照組中僅加入培養(yǎng)基。

1.2.4 檢測(cè)項(xiàng)目

1.2.4.1 SGC7901細(xì)胞形態(tài)變化 給藥48 h后，倒置顯微鏡下觀察各組SGC7901細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.2.4.2 SGC7901細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中［4］。給藥48 h后采用MTT法，檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)值，重復(fù)3次取均值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率［增殖抑制率=(1－給藥孔A值/對(duì)照孔A值)×100%］及IC50［4，5］。

1.2.4.3 SGC7901細(xì)胞周期變化 石油醚中劑量組及高劑量組分別采用濃度為1/2 IC50及IC50的石油醚粗提物干預(yù);甲醇中劑量組及高劑量組分別采用1/2 IC50、IC50濃度的甲醇粗提物干預(yù)。空白對(duì)照組不干預(yù)。培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌、70%乙醇固定;避光條件下加入染色液200 μL，吹打均勻;避光預(yù)熱30 min后，4℃放置備用。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果用CELL Quest軟件分析，統(tǒng)計(jì)各組S期、G2～M期、G0～G1期的細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SGC7901細(xì)胞形態(tài)變化 空白對(duì)照組細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞貼壁、透明度較大、胞膜清晰，生長(zhǎng)旺盛。陰性對(duì)照組細(xì)胞未發(fā)生改變。石油醚組及甲醇組則表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、皺縮，細(xì)胞間空隙加大，染色質(zhì)固縮、胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀異物，形成較多的細(xì)胞碎片。見(jiàn)圖1。

圖1 九香蟲(chóng)的石油醚及甲醇粗提物對(duì)SGC7901細(xì)胞形態(tài)的影響(200×)

2.2 SGC7901細(xì)胞增殖抑制率 石油醚組和甲醇組細(xì)胞增殖抑制率均低于空白對(duì)照組(P均＜0.05)，且呈劑量依賴性，見(jiàn)表1。石油醚和甲醇的IC50分別為 52.3 μg/mL 及 168.8 μg/mL。

2.3 SGC7901細(xì)胞周期變化 與空白對(duì)照組相比，石油醚組和甲醇粗提物干預(yù)后S期及G2～M細(xì)胞比例增加，G0～G1期細(xì)胞比例降低(P＜0.05)，甲醇組的效果優(yōu)于石油醚組。見(jiàn)表2。

表1 不同濃度石油醚和甲醇粗提物對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s)

表1 不同濃度石油醚和甲醇粗提物對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖抑制率的影響(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05

組別 細(xì)胞增殖抑制率(%)石油醚組35 μg/mL 11.22 ±0.14*52 μg/mL 53.79 ±0.09*79 μg/mL 86.35 ±0.01*118 μg/mL 88.03 ±0.01*178 μg/mL 89.35 ±0.01*267 μg/mL 90.92 ±0.01*400 μg/mL 91.05 ±0.00*甲醇組70 μg/mL 16.84 ±0.05*105 μg/mL 23.85 ±0.07*158 μg/mL 42.71 ±0.05*237 μg/mL 80.56 ±0.06*355 μg/mL 83.51 ±0.02*533 μg/mL 86.10 ±0.00*800 μg/mL 87.40 ±0.01*

表2 各組SGC7901細(xì)胞周期變化(%，±s)

表2 各組SGC7901細(xì)胞周期變化(%，±s)

注:與空白對(duì)照組相比，*P＜0.05

*石油醚高劑量組 58.85 ±8.01 34.63 ±5.12* 6.51 ±2.89石油醚中劑量組 55.28 ±4.02 34.61 ±3.68* 10.12 ±1.94甲醇高劑量組 42.12 ±0.28*40.59 ±0.99* 17.29 ±0.74*甲醇中劑量組 57.67 ±1.81*33.88 ±0.77* 8.46 ±1.05*空白對(duì)照組61.45 ±5.40 29.37 ±1.76 9.19 ±3.91

3 討論

九香蟲(chóng)粗提物的成分具有抗腫瘤作用［6～9］。以往多采用浸提法提取九香蟲(chóng)的有效成分。本研究中采用連續(xù)回流提取法，其優(yōu)點(diǎn)為操作簡(jiǎn)便、節(jié)省試劑，缺點(diǎn)是時(shí)間耗時(shí)較長(zhǎng)、對(duì)受熱易分解的成分不宜采用［10］。理論上，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致九香蟲(chóng)體內(nèi)的物質(zhì)被破壞，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。

本研究中兩種方式獲得的九香蟲(chóng)粗提物對(duì)SGC7901細(xì)胞體外增殖均有明顯的抑制作用，提示采用該方法進(jìn)行抗癌有效成分提取是可行的，但是否有其他抗癌有效成分被破壞還有待進(jìn)一步深入研究。

石油醚和甲醇均為天然產(chǎn)物提取的常用試劑，與我們前期研究中采用的氯仿和乙醇相比，兩者分別具有親脂性強(qiáng)和穿透力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)［10］。九香蟲(chóng)氯仿和乙醇粗提物對(duì)SGC7901細(xì)胞體外增殖的的IC50分別為 1 281.62 μg/mL 和 1 193.52 μg/mL［2，3］。本研究發(fā)現(xiàn)，石油醚和甲醇粗提物的 IC50為52.3 μg/mL 和168.8 μg/mL，有效濃度大大降低，抑制作用提高，說(shuō)明兩者作為試劑進(jìn)行抗癌有效成分提取是高效的。本研究結(jié)果顯示，九香蟲(chóng)的石油醚和甲醇粗提物均可抑制SGC7901細(xì)胞的體外增殖，但前者顯著優(yōu)于后者，提示石油醚提取的粗提物中抗癌有效成分量和(或)作用高于甲醇。另外，細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，兩種粗提物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制是由于其細(xì)胞周期的阻滯作用，使得SGC7901細(xì)胞停滯于S

期，S期作為DNA合成、染色質(zhì)組裝和中心粒復(fù)制的主要時(shí)期［11～13］，其明顯改變會(huì)影響細(xì)胞增殖。與我們前期研究［2，3］(氯仿和乙醇)結(jié)果相比，石油醚和甲醇粗提物對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響更顯著。

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