王曉燕，邢 歡，鐘韻山，宋東輝，徐仰倉

(天津市海洋資源與化學(xué)重點實驗室，天津科技大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457)

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是一種單細胞微藻，生活在近海水域，易養(yǎng)殖，含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、色素、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[1]．現(xiàn)階段，三角褐指藻僅作為動物飼料的原料，應(yīng)用領(lǐng)域較為狹窄[2]．三角褐指藻也曾被認為是生產(chǎn)二十碳五烯酸(EPA)[3-4]和生物柴油[5-6]的潛在生物，但過高的加工成本限制了其在該領(lǐng)域的應(yīng)用．

小球藻(Chlorella vulgaris)也是一種單細胞微藻，同樣含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、色素、維生素、多不飽和脂肪酸等生理活性物質(zhì)[7]，它的保健功效已被人們廣泛認識[8-9]．目前，小球藻已應(yīng)用于飼料、環(huán)保、食品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域．本文比較了小球藻和三角褐指藻營養(yǎng)物質(zhì)的含量，從營養(yǎng)角度分析了三角褐指藻的開發(fā)潛力，旨在使人們充分認識三角褐指藻的營養(yǎng)保健功能．

1 材料與方法

1.1 藻種和培養(yǎng)方法

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)由中國科學(xué)院海洋研究所王廣策研究員饋贈，藻接種在 f/2培養(yǎng)基上，22,℃、1,000,lx光照(光/暗周期為14,h/10,h)下培養(yǎng)．小球藻(Chlorella vulgaris)由本研究室保存，藻接種在BG-11培養(yǎng)基上，25,℃、4,000,lx光照(全光照)下培養(yǎng)．從接種后的第 2天開始，用顯微鏡觀察法對培養(yǎng)液中的微藻細胞進行計數(shù)．

1.2 測定方法

1.2.1 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍法[10]測定微藻細胞中的蛋白質(zhì)含量．用牛血清白蛋白制作標準曲線．

1.2.2 總糖含量的測定

采用蒽酮比色法[11]．準確吸取藻液 40,mL，5,000,r/min離心 10,min，去除上清液．藻泥凍融破碎3次后，加入 3,mL磷酸緩沖溶液，沸水中加熱30,min，取 1,mL加入 0.1,mL硫酸鋅溶液，沸水浴5,min后，立即加入亞鐵氰化鉀溶液 0.1,mL，5,000,r/min離心 10,min，取上清液 1,mL于 4,mL蒽酮中，沸水浴 10,min，冷水迅速冷卻至室溫，測定620,nm處的吸光度．用葡萄糖制作標準曲線．

1.2.3 游離氨基酸的測定

采用茚三酮顯色法[12]測定微藻細胞中的游離氨基酸含量．用亮氨酸制作標準曲線．

1.2.4 不飽和脂肪酸含量的測定

采用氣相色譜法．準確稱取 80,mg真空冷凍干燥的藻粉于 10,mL螺口玻璃試管中，加入 2,mol/L KOH-CH3OH 2,mL，75,℃水浴中皂化 30,min，冷卻至室溫，加入 3,mol/L HCl-CH3OH 2,mL，75,℃水浴中甲酯化 15,min，冷卻至室溫，加入 l mL正己烷和少量的蒸餾水萃取脂肪酸．用 GC-7890Ⅱ型氣相色譜儀(日本島津公司)測定不飽和脂肪酸的含量．色譜條件：色譜柱為強極性柱(長50,m，內(nèi)徑 0.2,mm)，柱溫 200,℃，檢測器為氫火焰離子化檢測器(FID)，溫度 280,℃，載氣為氮氣，流量 1,mL/min，分流比 50∶1．標準品購于Sigma公司，是由19種脂肪酸甲酯組成的混合物．用面積歸一法計算不飽和脂肪酸含量．

1.3 統(tǒng)計分析

通過 SPSS 19.0比較組間差異，采用 One Way ANOVA法中的 LSD比較不同組間的差異性(P＜0.05時差異顯著)．數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實驗的平均值．

2 結(jié)果與分析

2.1 三角褐指藻和小球藻生長速率的比較

三角褐指藻是海水藻，而小球藻是淡水藻．它們的生長環(huán)境不同，對培養(yǎng)基、溫度等條件的要求也不相同．要比較這兩種微藻的生長速率，必須在各自的最優(yōu)生長條件下比較．為此，首先探索了兩種微藻的最佳培養(yǎng)條件：三角褐指藻為 f/2培養(yǎng)基、22,℃、1,000,lx光照(光/暗周期為 14,h/10,h)，而小球藻為BG-11培養(yǎng)基、25,℃、4,000,lx光照(全光照)．兩種微藻都是游離生長的單細胞藻類，其生長速率可由培養(yǎng)液中藻細胞密度的變化來衡量．三角褐指藻和小球藻生長曲線如圖 1所示．三角褐指藻細胞增殖最快的時期是在接種后的2～6,d，細胞密度的日增長率在 18.2%～23.3%；6,d后細胞增殖率逐漸變小；12,d后藻細胞停止增殖，此時培養(yǎng)液中的藻細胞密度最大，為 9.6×106,mL-1，與接種初相比，細胞密度增大了4.8倍．小球藻細胞增殖最快的時期是在接種后的2～7,d，細胞密度的日增長率在 14.6%～50.0%；7,d后細胞增殖率逐漸變??；培養(yǎng) 12,d時的細胞密度為2.31×107,mL–1，與接種初相比，細胞密度增大了 6.6倍．由此可見，小球藻的生長速率高于三角褐指藻，平均生長速率是三角褐指藻的2.4倍，說明在相同的時間內(nèi)，養(yǎng)殖小球藻可獲得較多的生物量(P＜0.05).在需要通過生物量才能體現(xiàn)效果的領(lǐng)域，如污染環(huán)境中重金屬的吸附，小球藻的優(yōu)勢要高于三角褐指藻．

圖1 三角褐指藻和小球藻生長曲線Fig.1 Growth curve of Phaeodactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

2.2 三角褐指藻和小球藻糖含量的比較

糖含量是衡量食物營養(yǎng)價值高低的重要指標之一．就單個細胞而言，三角褐指藻的糖含量高于小球藻的(圖 2)，前者是后者的 2.71倍，說明三角褐指藻具有產(chǎn)生較多糖的潛力；但是，能否為人類提供較多的糖，不僅與單細胞的糖含量有關(guān)，還與該生物的生物量有關(guān)．為此，對兩種微藻在 1個生長周期(12 d)內(nèi)累積的總糖量進行測定，三角褐指藻積累的總糖量達到了 106.6,μg/mL，是同齡小球藻的 1.13倍(圖2)．結(jié)果表明，用相同的時間養(yǎng)殖三角褐指藻獲得的糖要多于小球藻的(P＜0.05)．

圖2 三角褐指藻和小球藻總糖含量比較Fig.2 Comparison of sugar content between Phaeodactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

2.3 三角褐指藻和小球藻可溶性蛋白和游離氨基酸含量的比較

蛋白質(zhì)是細胞的重要結(jié)構(gòu)組分，也是細胞多種功能的執(zhí)行者，而氨基酸又是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，因此蛋白質(zhì)和氨基酸是衡量食物營養(yǎng)價值的重要指標．檢測停滯生長前期藻體內(nèi)蛋白質(zhì)、游離氨基酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單細胞中三角褐指藻的蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量均高于小球藻，分別為小球藻的 25.3倍和 2.9倍(圖 3)．在 1個生長周期中，三角褐指藻能形成 8.6,μg/mL的蛋白質(zhì)和 26.2,μg/mL的游離氨基酸，而小球藻則能形成 0.82,μg/mL的蛋白質(zhì)和21.7,μg/mL的游離氨基酸，可見三角褐指藻累積的蛋白質(zhì)和游離氨基酸比小球藻的多(P＜0.05)．蛋白質(zhì)和氨基酸的總和代表了人體所能利用的總營養(yǎng)氮．通過計算發(fā)現(xiàn)，三角褐指藻的總營養(yǎng)氮是小球藻的1.55倍，說明三角褐指藻能為人類提供更多的營養(yǎng)氮．

圖3 三角褐指藻和小球藻蛋白質(zhì)和游離氨基酸含量比較Fig.3 Comparison of protein and free amino acids contents between Phaedactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

2.4 三角褐指藻和小球藻色素含量的比較

植物細胞中的色素主要有葉綠素和類胡蘿卜素，前者又包括葉綠素a和葉綠素b．葉綠素是人體合成血紅素的原料之一，類胡蘿卜素具有清除人體自由基的功能[13]．為此，對三角褐指藻和小球藻的色素含量進行測定，結(jié)果如圖4所示．

圖4 三角褐指藻和小球藻色素含量比較Fig.4 Comparison of pigment content between Phaeodactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

單細胞小球藻的葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素含量分別是三角褐指藻的 87.3%、159%和 49.7%.結(jié)果表明，除葉綠素 b外，單細胞小球藻的其他兩種色素含量均低于三角褐指藻．1個生長周期后，小球藻中葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素的累積量分別為三角褐指藻的 210%、383%和 120%．由此可見，盡管單細胞中三角褐指藻的葉綠素 a和類胡蘿卜素含量高于小球藻(P＜0.05)，但因小球藻生長速率高，在1個生長周期后，小球藻中色素的含量均超過了三角褐指藻(P＜0.05)，但各色素的超出程度不同，類胡蘿卜素的高出量最?。虼?，僅從色素角度考慮，特別是從葉綠素角度考慮，小球藻的營養(yǎng)價值要高于三角褐指藻．

2.5 三角褐指藻和小球藻不飽和脂肪酸含量的比較

二十碳五烯酸(EPA)(C20∶5)是一種長鏈多不飽和脂肪酸，在營養(yǎng)強化、防治心血管疾病、減輕炎癥等方面起著十分重要的作用[14]．采用前述方法測定了兩種微藻中EPA的含量，1個生長周期后，三角褐指藻累積了8.12,mg/g的EPA，而小球藻幾乎檢測不到EPA(表1，圖5)，說明三角褐指藻的EPA含量遠遠高于小球藻(P＜0.05)．前人也報道了類似的結(jié)果[15–16]．由此可見，在同一時期內(nèi)，養(yǎng)殖三角褐指藻獲得的 EPA要比養(yǎng)殖小球藻多得多．另外，三角褐指藻的棕櫚油酸(C16∶1)含量也明顯高于小球藻(P＜0.05)；但小球藻的油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、亞麻酸(C18∶3)、二十碳烯酸(C20∶1)含量卻明顯高于三角褐指藻(P＜0.05)(表 1)，說明在累積不飽和脂肪酸方面，兩種微藻各有側(cè)重．

表1 三角褐指藻和小球藻不飽和脂肪酸含量比較Tab.1 Comparison of unsaturated fatty acid content between Phaeodactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

圖5 三角褐指藻和小球藻脂肪酸氣相色譜圖Fig.5 Gas chromatogram of fatty acid of Phaeodactylum tricornutum and Chlorella vulgaris

3 討 論

小球藻含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素、礦物質(zhì)和色素等，具有多種保健和藥理作用[7,16–17]．我國已將小球藻批準為新資源食品[9]．小球藻作為營養(yǎng)功效食品已經(jīng)被人們廣泛認識[8]．本文以小球藻為參照物，分析了三角褐指藻營養(yǎng)物質(zhì)的含量．就單個細胞而言，小球藻的葉綠素 b含量高于三角褐指藻．葉綠素 b是天線色素，在細胞中負責(zé)光線的吸收和傳遞[18]，較多的葉綠素 b能夠吸收較多的光能，從而使植物能夠適應(yīng)強光環(huán)境．這可能是小球藻的最佳培養(yǎng)條件中光照度高于三角褐指藻的原因所在．葉綠素 b的含量高，吸收、固定的光能就多，光合作用的產(chǎn)物也多，這些產(chǎn)物能夠為生命活動提供更多的能量，因而生長速率也快，最終導(dǎo)致小球藻的生長速率高于三角褐指藻．

單細胞三角褐指藻的多數(shù)營養(yǎng)物質(zhì)含量高于小球藻，說明三角褐指藻具有高效生產(chǎn)營養(yǎng)物質(zhì)的潛力；但這并不代表人們能夠獲得較多的營養(yǎng)物質(zhì)，因為營養(yǎng)物質(zhì)的總量是由單位細胞中的含量和生物量兩個因素決定的．本文檢測了 1個生長周期中兩種微藻累積的營養(yǎng)物質(zhì)總量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三角褐指藻的蛋白質(zhì)、游離氨基酸、多糖、EPA及棕櫚油酸的含量高于小球藻，說明三角褐指藻提供的營養(yǎng)物質(zhì)總量要比小球藻多．

小球藻的葉綠素 b、油酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳烯酸含量高于三角褐指藻．植物中的色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素，前者的含量是后者的 3倍，因此，類胡蘿卜素比葉綠素更加稀有[19]．所以，分析食物的營養(yǎng)價值時，類胡蘿卜素的權(quán)重要高于葉綠素．另外，油酸、亞油酸、亞麻酸都是高等植物可以合成的不飽和脂肪酸，而高等植物幾乎不能合成 EPA，因此 EPA比油酸等不飽和脂肪酸更加稀有．所以，從營養(yǎng)價值的角度考慮，EPA權(quán)重要高于油酸等不飽和脂肪酸．綜上所述，在同一培養(yǎng)時期，三角褐指藻生產(chǎn)的糖、蛋白質(zhì)、氨基酸及重要不飽和脂肪酸要多于小球藻，因此它的營養(yǎng)價值不比小球藻低．

盡管三角褐指藻易養(yǎng)殖[1,20–21]，有作為提取EPA[3–4]和生物柴油[5–6]的原料的潛力，但因加工成本高還未工業(yè)化．目前，唯一利用三角褐指藻的行業(yè)是生產(chǎn)動物飼料[2]．據(jù)統(tǒng)計，世界年銷售小球藻干粉2,500噸左右，有人預(yù)測[22]今后幾年內(nèi)，小球藻干粉

國際市場總需求量有望上升至 8,000～10,000噸．而本文研究發(fā)現(xiàn)，在相同的生長時期內(nèi)三角褐指藻能夠生產(chǎn)出比小球藻更多的營養(yǎng)物質(zhì)．因此，三角褐指藻的市場競爭力要強于小球藻．如果小球藻干粉的部分市場被三角褐指藻干粉替代，三角褐指藻產(chǎn)業(yè)將會獲得極大的發(fā)展．Draaisma等[23]對2011年歐洲食用油的來源進行了研究，從土地資源、污染物的排放、水資源的消耗等方面分析了養(yǎng)殖三角褐指藻和種植油料作物的經(jīng)濟效益，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者的養(yǎng)殖效益要高于后者的種植效益．據(jù)此，他預(yù)測將來歐洲市場的食用油有可能會被三角褐指藻等海洋硅藻油所代替．由此也看出，若三角褐指藻的營養(yǎng)價值被大家認可，則它的開發(fā)潛力將是很大的．

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